張婧菲，韓紅麗，沈明明，張莉莉，王 恬*

（南京農業(yè)大學動物科技學院，江蘇 南京 210095）

抗氧化物是指有能力還原、降低或者阻止氧化反應過程的一類化合物。在體外，測定抗氧化物的抗氧化能力有多種不同方法，包括活性自由基法和細胞實驗?；钚宰杂苫ㄊ侵咐没瘜W反應生成活性自由基，然后測定抗氧化物清除該自由基的能力。它的優(yōu)點是操作簡單、反應環(huán)境單一、實驗結果的重現(xiàn)性高；缺點是采用不同反應原理的化學體系評價樣品的抗氧化能力，有時會得到相互矛盾的結果[1-2]。有研究者指出，制備樣品的方法不同、清除自由基原理的不同等因素都會在很大程度上影響實驗結果。根據(jù)淬滅自由基的反應原理不同，檢測方法可以分為氫過氧自由基清除能力、金屬還原能力、羥自由基（·OH）清除能力、有機自由基清除能力和抑制脂質過氧化產物的能力等[3]。其中，鐵離子還原/抗氧化能力（ferric-reducing antioxidant power，F(xiàn)RAP）、清除2,2’-聯(lián)氮-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸（2,2-azinobis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)，ABTS）陽離子自由基和1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基能力是目前使用最多的評價樣品體外抗氧化能力的指標。鑒于每個指標檢測方法的優(yōu)缺點及其適用范圍，近年來許多研究者推薦采用兩種及以上指標相結合的方法，更客觀、全面地評價抗氧化物的體外抗氧化能力[4]。

紅細胞的生命周期短，與其他細胞相比是一類特異性較低的體細胞。在氧化反應過程中，紅細胞是自由基攻擊的主要目標[5]。一方面，紅細胞在體內負責氧氣運輸，因此與氧原子頻繁接觸；另一方面，紅細胞的細胞膜富含多不飽和脂肪酸，且存在于紅細胞結構中的血紅蛋白極易發(fā)生自氧化反應[6]。因此，紅細胞膜是體外評價抗氧化物活性的合適介質。在常見的紅細胞氧化損傷模型中，2,2’-偶氮二(2-甲基丙基咪)二鹽酸鹽（2,2’-azobis(2-amidinopropane) dihydrochloride，AAPH）作為一種親脂性氧化反應誘導劑被廣泛使用。在水溶液中，AAPH水解生成烷基，并進一步在氧原子的作用下轉變生成氫過氧自由基[7]。此外，AAPH也可生成·OH。這些游離的自由基可以攻擊紅細胞膜，誘導脂質過氧化反應，最終導致紅細胞溶血作用和細胞凋亡。

姜黃是姜科屬的一種地下莖多年生植物草本植物，主要種植于熱帶和亞熱帶地區(qū)。姜黃含有69.4%（質量分數(shù)，下同）碳水化合物、6.3%蛋白質、5.1%脂肪、5.8%精油和3%～6%姜黃素（curcumin，CUR）類化合物[8]。在印度和中國等國家，姜黃被用作著色劑和香料劑，廣泛見于咖喱、芥末、奶酪等中[9]。此外，姜黃還是一種藥用歷史悠久的多酚類物質，可用于治療各種呼吸道疾?。ㄈ缦?、支氣管炎和過敏）、肝功能紊亂、厭食癥、風濕病、糖尿病、腹痛和扭傷等[10-11]。大量研究證實，姜黃提取物是一類重要的抗氧化物。從姜黃根莖中提取的活性物質，主要為CUR（約77%）、去甲氧基姜黃素（demethoxycurcumin，DUR）（約17%）和雙去甲氧基姜黃素（bisdemethoxycurcumin，BUR）（約3%）[12-13]。研究表明，CUR、DUR和BUR的化學結構十分相近，是姜黃屬藥用植物的最主要活性成分。它們的藥理作用廣泛，耐受性好、毒性低，因此在醫(yī)藥、食品、農業(yè)等領域具有良好的應用前景。許多學者將這3 種化合物統(tǒng)稱為總CUR。

CUR是近幾年食品科學和醫(yī)學領域的研究熱點。相對而言，關于DUR和BUR的研究相對滯后。與CUR一樣，DUR、BUR可保護DNA免受氧化損傷[14]。近來研究表明，雖然3 種CUR的藥理學活性相似，但其抗氧化活性仍存在較大差異。在脂質過氧化反應體系中，DUR、BUR的抗氧化活性較CUR相比更強；但在自由基體系中，CUR的抗氧化活性最強，其次才是DUR和BUR[15-16]。在體外細胞模型中，Zhang Lijia等利用脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）建立體外細胞損傷模型，研究發(fā)現(xiàn)CUR與BUR發(fā)揮了相似的細胞保護作用；但較CUR相比，BUR對LPS誘導的細胞損傷更加敏感[17]。上述結果提示，3 種CUR在動物體內的抗氧化活性很可能存在差異。

本團隊前期通過體外化學法和紅細胞氧化損傷模型，測定了CUR的體外抗氧化能力，并且比較了CUR和其他幾種天然色素的抗氧化活性差異。但目前關于3 種CUR在體外的抗氧化能力差異，尚缺乏系統(tǒng)的研究?；诖?，本實驗以CUR、DUR和BUR為對象，同時選取二丁基羥基甲苯（butylated hydroxytoluene，BHT）和丁羥茴醚（butylated hydroxyanisole，BHA）為對照物，測定自由基清除率和金屬離子還原力，研究其對AAPH處理的雞紅細胞溶血率、丙二醛（malondialdehyde，MDA）含量和超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）活性的影響。以期為進一步研究CUR及其類似物的抗氧化活性差異提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

ABTS、DPPH、AAPH 西格瑪奧德里奇（上海）貿易有限公司；CUR、DUR、BUR（純度大于98%[11]）廣州科虎生物技術研發(fā)中心；BHT、BHA等其他試劑均為國產分析純，購自國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

BSA224S-CW電子分析天平 德國賽多利斯公司；Multiskan GO多功能酶標儀 美國Thermo Fisher Scientific公司；5804/5804R臺式高速冷凍離心機德國Eppendorf公司；DK-S24電熱恒溫水浴鍋 上海精宏實驗設備有限公司；Vortex-Genie 2漩渦混合器美國Scientific Industries公司；S-250D超聲波破碎儀美國Branson公司。

1.3 方法

1.3.1 ABTS陽離子自由基清除能力的測定

參考do Carmo Brito等[14]的方法，以ABTS水溶液（7 mmol/L）為溶劑，配制過硫酸鉀溶液（2.45 mmol/L），于室溫下避光穩(wěn)定12～16 h。以乙醇作為稀釋介質，選取合適的稀釋比例，調整過硫酸鉀溶液于734 nm波長處的吸光度為0.700±0.025。取0.195 mL上述溶液與0.65 mL樣品溶液（濃度分別為0、2、4、,6、8、10、20 μmol/L）充分混合，于30 ℃條件下反應30 min。用蒸餾水調零，于734 nm波長處測定吸光度，結果記為A樣品。用0.65 mL的乙醇溶液代替樣品溶液作為對照管，進行相同的處理后，于734 nm波長處其吸光度，結果記為A對照。每個樣品平行測定3 次，取平均值。按式（1）計算樣品的ABTS陽離子自由基清除率。選取Trolox為參照物，配制不同濃度的Trolox溶液，代替樣品溶液進行上述反應，利用相對應的吸光度繪制Trolox清除率的標準曲線。通過標準曲線，計算樣品相對應于Trolox的清除率。樣品的ABTS陽離子自由基清除能力以Trolox計，單位為μmol/L。

1.3.2 DPPH自由基清除能力的測定

參考Oliveira等[18]的方法，配制DPPH自由基乙醇溶液（0.1 mmol/L），而后裝入棕色瓶子中置于陰涼處，現(xiàn)配現(xiàn)用。取0.65 mL樣品溶液與0.195 mL DPPH自由基乙醇溶液（0.1 mmol/L）充分混合，于室溫下避光反應30 min。用乙醇溶液調零，于517 nm波長處測定吸光度，結果記為A樣品。用0.65 mL的乙醇溶液代替樣品溶液作為對照管，進行相同的處理后，于517 nm波長處其吸光度，結果記為A對照。每個樣品平行測定3 次，取平均值。按式（1）計算樣品的DPPH自由基清除率。后續(xù)操作同1.3.1節(jié)，樣品的DPPH自由基清除能力以Trolox計，單位為μmol/L。

1.3.3 ·OH清除率的測定

參考Ohata等[19]的方法，取0.1 mL樣品溶液與0.15 mL 2-脫氧核糖（5 mmol/L）、0.4 mL磷酸鈉緩沖液（0.75 mol/L，pH 7.4）、0.25 mL雙蒸水和0.1 mL硫酸亞鐵溶液（7.5 mmol/L）混合。向上述混合液中加入0.1 mL過氧化氫溶液（體積分數(shù)1%），并充分混勻。37 ℃水浴條件下反應1 h后，于536 nm波長處測定吸光度，結果記為A樣品。用相同體積的雙蒸水代替樣品溶液作為對照管，進行相同的處理后，于536 nm波長處測定其吸光度，結果記為A對照。每個樣品平行測定3 次，取平均值。按式（1）計算樣品的·OH清除率。后續(xù)操作同1.3.1節(jié)，樣品的·OH清除能力以Trolox計，單位為μmol/L。

1.3.4 O2-·清除能力的測定

參考Lim等[20]的方法，以磷酸鈉緩沖液（0.1 mol/L，pH 7.4）為溶劑，分別配制氯化硝基四氮唑藍溶液（150 μmol/L）、煙酰胺腺嘌呤二核苷酸溶液（468 μmol/L）和吩嗪硫酸甲酯溶液（60 μmol/L）。取1 mL樣品溶液與1 mL氯化硝基四氮唑藍溶液、1 mL煙酰胺腺嘌呤二核苷酸溶液混合，加入1 mL吩嗪硫酸甲酯溶液后立即充分混勻。室溫條件下反應5 min后，于560 nm波長處測定吸光度，結果記為A樣品。用1 mL的磷酸鈉緩沖液代替樣品作為對照管，進行相同的處理后，于560 nm波長處測定吸光度，結果記為A對照。每個樣品平行測定3 次，取平均值。按式（1）計算樣品超氧陰離子自由基（O2-·）清除率。后續(xù)操作同1.3.1節(jié)，樣品的O2-·清除能力以Trolox計，單位為μmol/L。

1.3.5 FRAP的測定

FRAP的測定參考Tang Yao等[21]的方法。具體步驟如下：以鹽酸溶液（40 mmol/L）為溶劑，配制2,4,6-三吡啶基三嗪溶液（10 mmol/L）。醋酸鹽緩沖液（0.3 mol/L、pH 3.6）、2,4,6-三吡啶基三嗪溶液溶液（10 mmol/L）和氯化鐵溶液（20 mmol/L）按體積比10∶1∶1充分混合，于37 ℃條件下進行預熱。取300 μL預熱的FRAP試劑，加入30 μL的超純水和10 μL的樣品溶液，充分混合后于37 ℃水浴條件下避光反應30 min。于593 nm波長處測定吸光度。以七水硫酸亞鐵代替樣品溶液進行上述反應，利用相對應的吸光度繪制七水硫酸亞鐵還原力的標準曲線。通過標準曲線，計算樣品相對應于七水硫酸亞鐵的FRAP。每個樣品平行測定3 次，取平均值。

1.3.6 抑制脂質過氧化能力的測定

抑制脂質過氧化能力的測定參考Awah等[22]的硫代巴比妥酸法。具體步驟如下：以磷酸鹽緩沖液（pH 7.4）為勻漿介質，配制新鮮的蛋黃勻漿液500 μL（體積分數(shù)10%）。以3 g硫代巴比妥酸、120 g三氯乙酸、10.4 mL高氯酸（體積分數(shù)70%）和800 mL蒸餾水配制硫代巴比妥酸反應液。取100 μL樣品溶液以蒸餾水稀釋至1.0 mL，然后加入50 μL硫酸亞鐵溶液（0.075 mol/L）、20 μL VC（0.1 mol/L）。充分混合后，在37 ℃下反應1 h。冷卻后加入200 μL的乙二胺四乙酸溶液（0.1 mol/L）和1.5 mL上述的硫代巴比妥酸反應液，在100 ℃沸水浴下反應15 min。冷卻后3 000 r/min離心10 min。上清液于532 nm波長處測定吸光度。按式（2）計算樣品的脂質過氧化抑制率。

1.3.7 AAPH誘導雞紅細胞的氧化應激反應

采取新鮮雞血，用肝素抗凝，1 500×g離心10 min，棄上清液，所得沉淀為雞紅細胞。加入合適體積的緩沖液（4 ℃預冷，pH 7.4，含150 mmol/L氯化鈉、1.9 mmol/L磷酸二氫鈉、8.1 mmol/L磷酸氫二鈉），輕柔吹散雞紅細胞，形成均勻的雞紅細胞懸浮液，然后于1 500×g離心10 min，棄上清液。如此反復，用緩沖液清洗雞紅細胞3 次。最后，加入適量的緩沖液，制備成質量分數(shù)2%的雞紅細胞懸浮液備用。

AAPH通過生成水溶性的脂質過氧化自由基，可誘導雞紅細胞的氧化應激損傷[23]。將分離得到的新鮮紅細胞懸浮液分為不同的處理組，即未處理的紅細胞懸浮液（對照，CON）、AAPH處理過的紅細胞懸浮液、AAPH處理過的紅細胞懸浮液＋不同濃度的3 種不同濃度CUR：取質量分數(shù)2%雞紅細胞懸浮液，分別加入不同濃度的CUR溶液（終濃度為0.5、1、5、10、20 μmol/L），于37 ℃條件下孵育30 min。然后加入AAPH溶液（75 mmol/L），充分混勻后恒溫孵育5 h。

1.3.7.1 紅細胞溶血率的測定

紅細胞溶血率的測定參考Magalhaes等[24]的方法。具體步驟如下：每隔1 h取出等體積的雞紅細胞懸浮液，1 500×g離心10 min，棄上清液。按體積比1∶7向紅細胞沉淀中加入150 mmol/L的生理鹽水，充分混勻后1 500×g離心10 min。取上清液于540 nm波長處測定吸光度，所得結果記為A。以雙蒸水代替生理鹽水，誘導雞紅細胞完全溶血，離心后取上清液于540 nm波長處測定吸光度，所得結果記為A’。每個濃度樣品溶液平行測定3 次，計算平均值。雞紅細胞溶血率按式（3）計算。

1.3.7.2 紅細胞SOD活力和MDA含量的測定

超聲波破碎法破碎雞紅細胞樣品，采用試劑盒測定SOD活力和MDA含量。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

所有數(shù)據(jù)經Excel 2013軟件初步整理后，先用SPSS 17.0軟件進行方差齊性檢驗。然后，采用SPSS 17.0軟件的單因素方差分析，利用Tukey法進行組間顯著性比較。所有結果均表示為平均值±標準誤。P＜0.05表示差異顯著。

2 結果與分析

2.1 3 種CUR對ABTS陽離子自由基、DPPH自由基、·OH和O2-·清除率的影響

圖1 3 種CUR對ABTS陽離子自由基（A）、DPPH自由基（B）、·OH（C）和O－2·（D）清除率Fig. 1 Scavenging effects of curcuminoids on ABTS radical cation (A),DPPH radical (B), ·OH (C) and O2-· (D)

由圖1A可知，3 種CUR對ABTS陽離子自由基的清除率呈現(xiàn)濃度依賴性。在1～20 μmol/L濃度范圍內，隨著樣品濃度的升高，其對ABTS陽離子自由基的清除率也逐漸升高。在濃度為20 μmol/L時，不同樣品對ABTS陽離子自由基清除率由高到低為BHA＞BUR＞CUR＞BHT＞DUR。與BHT相比，CUR和BUR對ABTS陽離子自由基的清除率均有顯著提高（P＜0.05）。與DUR相比，CUR和BUR對ABTS陽離子自由基的清除率分別顯著提高了49.62%和77.36%（P＜0.05）。

由圖1B可知，DUR和BUR對DPPH自由基的清除率呈現(xiàn)濃度依賴性，在1～20 μmol/L濃度范圍內，隨著樣品濃度的升高，其對ABTS陽離子自由基的清除率逐漸升高。CUR對DPPH自由基的清除率在1～10 μmol/L范圍內隨濃度升高而升高，且在10 μmol/L時達到最大值。在濃度為20 μmol/L時，不同樣品對DPPH自由基清除率由高到低為DUR＞BHT＞BUR＞CUR＞BHA。與BHT相比，DUR對DPPH自由基的清除率顯著提高（P＜0.05），BUR差異不顯著（P＞0.05），CUR則顯著降低（P＜0.05）。BUR和CUR兩者對DPPH自由基的清除率無顯著差異（P＞0.05）。

由圖1C可知，3 種CUR對·OH的清除率呈現(xiàn)濃度依賴性。在10～400 μmol/L范圍內，隨著濃度的升高，其對·OH的清除率也逐漸升高。在濃度為400 μmol/L時，不同樣品對·OH清除率由高到低為BHT＞BHA＞BUR＞DUR＞CUR。與BHA和BHT相比，3 種CUR對·OH的清除率均有顯著降低（P＜0.05）。與CUR相比，DUR和BUR對·OH的清除率分別顯著提高了20.00%和28.78%（P＜0.05）。DUR和BUR兩者對·OH的清除率無顯著差異（P＞0.05）。

由圖1D可知，3 種CUR對O2-·的清除率呈現(xiàn)濃度依賴性。在10～400 μmol/L范圍內，隨著濃度的升高，其對O2-·的清除率也逐漸升高。在濃度為400 μmol/L時，不同樣品對·OH清除率由高到低為BUR＞CUR＞BHA＞BHT＞DUR。與DUR相比，BUR和CUR對O2-·的清除率分別顯著提高了59.76%和36.41%（P＜0.05）。

2.2 3 種CUR對ABTS陽離子自由基、DPPH自由基、·OH、O2-·的半抑制濃度

表1 3 種CUR對ABTS陽離子自由基、DPPH自由基、·OH、·的IC50（n＝8）Table 1 IC50 for scavenging effects of curcuminoids on ABTS radical cation, DPPH radical, ·OH and O－2· (n= 8)

表1 3 種CUR對ABTS陽離子自由基、DPPH自由基、·OH、·的IC50（n＝8）Table 1 IC50 for scavenging effects of curcuminoids on ABTS radical cation, DPPH radical, ·OH and O－2· (n= 8)

組別 IC50/（μmol/L）ABTS陽離子自由基 DPPH自由基 ·OH O2-·CUR 16.28 4.89 81.01 135.40 DUR 27.66 5.18 77.41 209.03 BUR 14.91 18.49 77.95 124.67 BHT 26.03 35.05 38.87 182.19 BHA 14.09 59.55 47.26 182.72

表1為3 種CUR對ABTS陽離子自由基、DPPH自由基、·OH、O2-·的半抑制濃度（half maximal inhibitory concentration，IC50）。就ABTS陽離子自由基和O2-·而言，3 種CUR中，BUR的IC50最低，然后依次是CUR和DUR。就DPPH自由基而言，CUR的IC50值最低，BUR的IC50最高。就·OH而言，3 種CUR中，DUR和BUR的IC50相近，CUR的IC50最高。

2.3 3 種CUR對FRAP的影響

圖2 3 種CUR對FRAP的影響Fig. 2 Ferric reducing antioxidant power of curcuminoids

由圖2可知，3 種CUR的FRAP結果呈現(xiàn)明顯的濃度依賴性。在1～400 μmol/L濃度范圍內，隨著樣品濃度的升高，其FRAP也逐漸升高。在濃度為400 μmol/L時，BHA的FRAP最大，CUR次之；其中，3 種CUR處理組間的FRAP均差異顯著（P＜0.05）。400 μmol/L時不同樣品的FRAP由高到低為：BHA＞CUR＞DUR＞BUR＞BHT。

2.4 3 種CUR對脂質過氧化反應抑制率的影響

圖3 3 種CUR對脂質過氧化反應抑制率的影響Fig. 3 Inhibitory activity of curcuminoids on lipid peroxidation

由圖3可知，3 種CUR均可有效抑制蛋黃卵磷脂的脂質過氧化反應，且這種抑制作用呈現(xiàn)濃度依賴性。在1～400 μmol/L濃度范圍內，隨著樣品濃度的升高，它們對脂質過氧化反應的抑制率也逐漸升高。在濃度為400 μmol/L時，BUR的抑制率最高。不同樣品對脂質過氧化反應的抑制率由高到低為BUR＞DUR＞CUR＞BHT＞BHA。與CUR相比，BUR和DUR對脂質過氧化反應的抑制率分別顯著提高了34.15%和54.16%（P＜0.05）。

2.5 3 種CUR對AAPH誘導的紅細胞溶血率的影響

圖4 3 種CUR對AAPH誘導的紅細胞溶血率的影響Fig. 4 Effects of curcuminoids on AAPH-induced erythrocyte hemolysis

由圖4可知，經AAPH處理后，紅細胞的溶血率較對照組相比顯著提高（P＜0.05）。在0.5～20 μmol/L時，孵育1 h后，與AAPH組相比，3 種CUR均顯著降低了紅細胞的溶血率（P＜0.05）；并且這種抑制作用呈現(xiàn)濃度依賴性和時間依賴性。但3 種CUR處理組間的溶血率差異不顯著（P＞0.05）。孵育3 h后，在0.5 μmol/L時，與AAPH組相比，DUR和BUR顯著降低了紅細胞的溶血率（P＜0.05）。在1～20 μmol/L時，紅細胞分別經3 種CUR處理后溶血率較AAPH組相比顯著降低（P＜0.05）。在20 μmol/L時，與CUR組相比，DUR和BUR組的紅細胞溶血率顯著降低（P＜0.05）。在0.5～20 μmol/L時，孵育5 h后，與AAPH組相比，3 種CUR均顯著降低了紅細胞的溶血率（P＜0.05）。在20 μmol/L時，與CUR組相比，DUR和BUR組的紅細胞溶血率更低（P＜0.05）。

2.6 3 種CUR對AAPH誘導的紅細胞MDA含量的影響

由圖5可知，在0.5～20 μmol/L時，孵育1 h后，3 種CUR處理可明顯抑制AAPH誘導的紅細胞脂質過氧化反應，降低MDA含量（P＜0.05）。在0.5～20 μmol/L時，孵育3 h后，與AAPH組相比，3 種CUR均顯著降低了紅細胞的MDA含量（P＜0.05）；并且這種抑制作用呈現(xiàn)濃度依賴性。在10 μmol/L時，3 種CUR處理組間的紅細胞MDA含量差異顯著（P＜0.05）。孵育5 h后， 3 種CUR在不同濃度時均可有效抑制AAPH誘導的紅細胞MDA含量升高（P＜0.05）。其中，在1～10 μmol/L時，與CUR組相比，DUR和BUR顯著降低了紅細胞的MDA含量（P＜0.05）。在20 μmol/L時，經BUR處理后的紅細胞MDA含量更低；且與CUR和DUR處理組相比差異顯著（P＜0.05）。

圖5 3 種CUR對AAPH誘導的紅細胞MDA含量的影響Fig. 5 Effects of curcuminoids on MDA content in erythrocytes induced by AAPH

2.7 3 種CUR對AAPH誘導的紅細胞SOD活力的影響

由圖6可知，在37 ℃條件下孵育5 h后，CON組的紅細胞SOD活力沒有隨著時間的變化產生顯著差異（P＞0.05）。經AAPH處理后，紅細胞的SOD活性較對照組相比顯著降低（P＜0.05）。在0.5～20 μmol/L時，孵育1 h后，與AAPH組相比，3 種CUR均顯著提高了紅細胞的SOD活力（P＜0.05）。在0.5 μmol/L時，孵育3 h后，與AAPH組相比，CUR和DUR顯著提高了紅細胞的SOD活力（P＜0.05）。在1～20 μmol/L時，經3 種CUR處理后的紅細胞SOD活性較AAPH組相比顯著提高（P＜0.05）。在20 μmol/L時，與CUR組相比，DUR和BUR組的紅細胞SOD活力更高（P＜0.05）。孵育5 h后，3 種CUR在不同濃度下均可有效抑制AAPH誘導的紅細胞SOD活力降低（P＜0.05）。其中，在1 μmol/L時，與DUR組相比，CUR和BUR顯著提高了紅細胞的SOD活力（P＜0.05）。在5～10 μmol/L時，經DUR和BUR處理后的紅細胞SOD活力較CUR處理組相比顯著提高（P＜0.05）。在20 μmol/L時，CUR和DUR組的紅細胞SOD活力更高，且較BUR組差異顯著（P＜0.05）。

圖6 3 種CUR對AAPH誘導的紅細胞SOD活力的影響Fig. 6 Effects of curcuminoids on SOD activity in erythrocytes induced by AAPH

3 討 論

ABTS陽離子自由基和DPPH自由基清除率是兩種廣泛使用的體外抗氧化力檢測指標。它們的反應原理相同，都是基于樣品提供H原子或質子來淬滅自由基，并通過反應液的顏色變化來評估自由基清除率的高低[25]。Zhang Jingfei等[26]測定了CUR對DPPH自由基的清除率，提示CUR對DPPH自由基有良好的清除率，且在一定濃度范圍內，CUR對DPPH自由基的清除率存在明顯的濃度依賴性。本實驗在前期研究基礎上，進一步比較了3 種CUR對ABTS陽離子自由基和DPPH自由基清除率。結果顯示，DUR和BUR與CUR類似，可以有效地中和DPPH自由基，并且在1～20 μmol/L濃度范圍內呈現(xiàn)一定的濃度依賴性。這與Kim等[27]的研究結果一致。就ABTS陽離子自由基清除率而言，BUR的清除率與人工合成抗氧化劑BHA相近，并在20 μmol/L濃度時顯著高于CUR和BUR。

·OH能與絕大部分生物大分子物質發(fā)生反應，包括細胞中的碳水化合物、蛋白質、脂質和DNA?！H散逸可導致細胞損傷和大面積的細胞凋亡[28]。因此，及時清除多余的·OH對保護機體的正常生命活動和生理代謝反應具有重要作用。O2-·是線粒體呼吸鏈反應的一種自由基副產物。生成的O2-·可以進一步反應產生另一種活性氧自由基H2O2。H2O2在過氧化氫或谷胱甘肽過氧化物酶的催化下最終將自由基轉化為水[29]。因此，有效清除O2-·是發(fā)揮線粒體抗氧化防御功能的重要環(huán)節(jié)之一。本實驗結果顯示，3 種CUR都能有效地清除·OH和O2-·。3 種CUR相互比較而言，BUR的清除活性最高。目前關于這3 種CUR對不同自由基清除率的比較研究很少，尤其對造成它們抗氧化活性差異的原因仍無法給出統(tǒng)一的解釋。推測這種差異一方面是因為不同的自由基反應基于不同的中和原理；另一方面可能與3 種CUR的功能基團不同有關[30]。

生物脂質對氧化反應非常敏感，不僅因為它富含不飽和脂肪酸，而且它與機體內的酶促和非酶系統(tǒng)之間存在密切聯(lián)系。脂質過氧化是一個典型的自由基鏈式反應，通過從不飽和脂肪酸側鏈上吸收一個H原子繼而引發(fā)一系列的自由基聚合反應，這也是導致細胞膜破損和細胞壞死的一個重要機制之一[28]。因此，不同樣品對脂質過氧化反應的抑制率是體外檢測樣品抗氧化活性的一個重要指標。本實驗選取蛋黃卵磷脂作為脂質底物，比較研究3 種CUR對蛋黃脂質過氧化反應抑制率的影響。結果顯示，3 種CUR都能有效地抑制脂質過氧化反應。其中，BUR和DUR的抑制率顯著高于CUR。這一結果與Jayaprakasha等[31]的研究結果一致。

紅細胞膜富含不飽和脂肪酸，在氧化反應過程中是自由基攻擊的主要目標。游離的自由基會誘導磷脂重排反應，并將磷脂酰絲氨酸暴露在細胞膜外側的小葉上，最終導致過氧化鏈式反應的發(fā)生[32]。與成熟的哺乳動物紅細胞不同，家禽的紅細胞有完整的細胞核、線粒體、溶酶體和高爾基體等細胞器。一旦發(fā)生氧化應激反應，可激活若干生物機制參與對細胞的保護作用，緩解自由基誘導的紅細胞溶血作用和血紅蛋白的氧化。因此，家禽紅細胞的結構和功能上的特異性使其成為一種易于操作的細胞模型，尤其適合用于與氧化應激相關的研究。本實驗利用水溶性自由基AAPH誘導雞紅細胞發(fā)生氧化應激反應，然后通過測定紅細胞的溶血率、MDA含量和SOD活力，比較3 種CUR的抗氧化潛力。結果顯示，3 種CUR均能發(fā)揮良好的抗氧化活性，并在一定程度上緩解紅細胞的氧化損傷。多酚類物質的抗氧化機制之一是通過降低脂質過氧化反應和自由基活性來穩(wěn)定細胞膜[33]。有研究指出，酚類化合物的疏水性使其主要富集在細胞膜和脂蛋白等脂質含量豐富的區(qū)域[34]。3 種CUR屬于天然提取的一類多酚化合物，可以通過整合到細胞雙層膜的疏水核心區(qū)，降低細胞膜的流動性和穩(wěn)定性，限制自由基的擴散，提高抗氧化效率。本實驗中MDA的研究結果也在一定程度上證實了上述CUR類化合物的可能抗氧化作用機制。

值得注意的是，綜合本實驗中紅細胞的3 個測定指標結果，認為DUR和BUR對紅細胞的保護作用優(yōu)于CUR。Toda等[35]也以紅細胞為實驗模型，研究了3 種CUR對·OH誘導的大鼠紅細胞溶血率和脂質過氧化反應的影響，但其研究發(fā)現(xiàn)，與DUR和BUR相比，CUR對紅細胞的保護作用更顯著。這一發(fā)現(xiàn)與本實驗的結果不一致。而Sheejayan等[36]以大鼠腦和肝組織勻漿液為介質，研究3 種CUR對鐵離子催化下脂質過氧化反應的影響，也得到了與上述研究不同的結果，其認為3 種CUR的抗氧化活性基本一致。由于目前關于CUR、DUR和BUR的抗氧化活性差異的報道比較少，可供參考和比較的實驗結果不多。因此，推測反應體系、誘導脂質過氧化反應的自由基種類和發(fā)生過氧化反應的脂質種類都可能會影響CUR類化合物的抗氧化活性發(fā)揮，并導致實驗結果的參差不齊。

抗氧化劑的抗氧化能力與其化學結構密切相關，尤其是它的功能基團。根據(jù)功能基團不同，常見的抗氧化化合物可以分為兩類：酚醛類和β-二酮基類。自然界中絕大部分的天然抗氧化劑含有酚基或β-二酮基。CUR的化學結構很特別，是一個高度對稱的分子，既有β-二酮基又有酚羥基。它的主要功能基團包括：β-二酮基、兩個酚羥基、甲氧基、羰基[37-38]。羰基是CUR的主要顯色基團，目前鮮有研究發(fā)現(xiàn)羰基與CUR抗氧化活性的相關。近年來的主流研究認為，β-二酮基和酚羥基是影響CUR抗氧化活性的主要功能基團。目前關于甲氧基在抗氧化活性中發(fā)揮的作用研究很少[39-40]。但有研究顯示，若酚羥基的鄰位存在甲氧基，可以提高酚羥基的抗氧化活性[30]。從化學結構上看，3 種CUR的唯一不同是甲氧基數(shù)量。CUR在動物體內不穩(wěn)定，大部分會被迅速降解為阿魏酸和阿魏酰甲烷。阿魏酸也是一種潛在的生物活性物質，具有多種藥理學功能，例如抗氧化活性。有研究報道，阿魏酸的抗氧化活性甚至優(yōu)于CUR[41-42]。馮生光[43]研究了CUR和DUR的降解途徑，推測它們在丙酮溶液和小鼠體內的可能降解產物存在明顯不同，其中就包括阿魏酸和反式阿魏酸。然而，目前尚缺乏去DUR和BUR在機體內的分解代謝途徑的相關研究。因此推測，CUR及其代謝產物的存在可部分解釋其與DUR、BUR在某些自由基體系中的抗氧化活性差異。

綜上所述，本實驗結果表明，與CUR類似，DUR和BUR均表現(xiàn)出良好的抗氧化活性。3 種CUR能有效地中和ABTS陽離子自由基、DPPH自由基、·OH和O2-·，具有較高的FRAP和脂質過氧化抑制率。在紅細胞模型中，3 種CUR顯著降低了AAPH誘導的紅細胞溶血率和抑制了MDA含量升高，并提高了SOD活力。同時，3 種CUR的抗氧化活性還存在差異。就ABTS陽離子自由基、·OH和O2-·清除率和脂質過氧化抑制率而言，BUR的活性最佳。在緩解紅細胞氧化損傷方面，DUR和BUR的抗氧化力較CUR相比更顯著。