劉琳娜 丁士剛 賈淑娟

北京大學首鋼醫(yī)院消化科1(100144) 北京大學第三醫(yī)院消化科2

背景：長期服用阿司匹林可造成不同程度的胃黏膜損傷。鋁碳酸鎂可通過多種機制對胃黏膜損傷發(fā)揮保護作用。目的：通過體外實驗探討鋁碳酸鎂對阿司匹林相關(guān)胃黏膜損傷的保護作用及其可能機制。方法：選取人胃黏膜上皮細胞株GES-1，設(shè)置正常對照組、損傷組和保護組，后兩組加入阿司匹林9 mmol/L共培養(yǎng)，保護組進一步予0.6 mg/mL鋁碳酸鎂干預(yù)。培養(yǎng)12 h后，使用倒置生物顯微鏡和透射電子顯微鏡觀察細胞形態(tài)學變化，MTT實驗和流式細胞術(shù)檢測細胞存活和凋亡情況，蛋白質(zhì)組學技術(shù)篩選、鑒定損傷組與保護組差異表達蛋白。結(jié)果：與損傷組相比，保護組GES-1細胞結(jié)構(gòu)相對完整，細胞存活率高、凋亡率低，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05);T復(fù)合蛋白1β亞基(TCP-1β)和硫氧還蛋白依賴性過氧化物還原酶3(PRX3)表達上調(diào)，兩種蛋白分別與蛋白質(zhì)的折疊和組裝、細胞骨架功能以及抗氧化應(yīng)激有關(guān)。結(jié)論：鋁碳酸鎂可通過促增殖、抗凋亡減輕阿司匹林相關(guān)胃黏膜損傷，其機制可能與改善細胞內(nèi)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能、抗氧化應(yīng)激等有關(guān)。

低劑量阿司匹林廣泛應(yīng)用于心腦血管事件的預(yù)防。然而，長期服用阿司匹林會增加患者的胃腸道疾病風險，如消化不良、消化性潰瘍出血甚至因大出血致死。阿司匹林相關(guān)胃黏膜損傷可誘發(fā)潰瘍和出血[1-2]，然而，由于阿司匹林的鎮(zhèn)痛作用，潰瘍患者的腹痛癥狀往往不明顯，從而延誤診治，對此類人群應(yīng)予足夠的重視。鋁碳酸鎂是一種具有層狀網(wǎng)絡(luò)晶格結(jié)構(gòu)的藥物，能通過中和胃酸、加強胃黏膜屏障功能、阻斷損傷因子而有效保護胃黏膜[3-7]。本文通過體外實驗探討鋁碳酸鎂對阿司匹林相關(guān)胃黏膜損傷的保護作用及其可能機制。

材料與方法

一、細胞株、主要試劑和儀器

人胃黏膜上皮細胞株GES-1(北京康為世紀生物科技有限公司)；阿司匹林(純度≥ 99%)、PI(Sigma-Aldrich?, Merck KGaA)；鋁碳酸鎂(拜耳醫(yī)藥保健有限公司)；MTT細胞增殖及細胞毒性檢測試劑盒(江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司)。

WMS-3680研究級倒置生物顯微鏡(上海無陌光學儀器有限公司)；JEM-1400Plus 透射電子顯微鏡(日本電子株式會社)；BD FACSCalibur流式細胞儀(BD Biosciences)；電泳儀(Bio-Rad Laboratories, Inc.)；DuoScan T1200掃描機(Agfa-Gevaert Group)；冷凍高速離心機、酶標儀、CO2細胞培養(yǎng)箱(Thermo Fisher Scientific)。

二、方法

1. 細胞培養(yǎng)和分組處理：GES-1 細胞使用含10%胎牛血清的RPMI1640 培養(yǎng)基，培養(yǎng)于37 ℃、50 mL/L CO2、飽和濕度環(huán)境培養(yǎng)箱中，每周換液3次，細胞生長至約80%融合時，以2.5 g/L胰蛋白酶消化，1∶3傳代。實驗設(shè)置3個組別：正常對照組細胞不予任何處理；阿司匹林損傷組(簡稱損傷組)加入阿司匹林9 mmol/L共培養(yǎng)；鋁碳酸鎂保護組(簡稱保護組)在阿司匹林處理的基礎(chǔ)上予0.6 mg/mL鋁碳酸鎂干預(yù)。每組設(shè)3個復(fù)孔。

2. 細胞形態(tài)學觀察：各組GES-1細胞培養(yǎng)12 h后，倒置生物顯微鏡下觀察細胞形態(tài)和生長狀態(tài)。收集各組細胞，離心、固定，環(huán)氧樹脂包埋，乙酸鈾-檸檬酸鉛雙重染色，超薄切片機切片，透射電子顯微鏡下觀察、拍照。

3. MTT實驗：取處于對數(shù)生長期的GES-1細胞，以每孔0.5×104加入96孔培養(yǎng)板，細胞貼壁后，按前述方法分組和處理。細胞培養(yǎng)12 h后，每孔加入200 μL MTT，4 h后吸出培養(yǎng)基，每孔加入150 μL DMSO，室溫震蕩10 min溶解，使用酶標儀測定550 nm波長處吸光度(A)值。細胞存活率=(實驗組A值/對照組A值)×100%。

4. 流式細胞分析：各組GES-1細胞培養(yǎng)12 h后，收集細胞制成細胞懸液，調(diào)整細胞濃度為1×106/mL，取1 mL細胞懸液，PBS 洗滌3 次，將細胞重懸于1 mL PI染液中，30 min后上流式細胞儀檢測，分析細胞凋亡情況。

5. 雙向凝膠電泳：各組GES-1細胞培養(yǎng)12 h后行蛋白質(zhì)組學分析。①等電聚焦：使用17 cm線性膠條，上樣量為每膠120 μg，轉(zhuǎn)至濃度為12%的聚丙烯酰胺凝膠。②電泳：每膠10 mA，30 min；每30 mA，5 h。銀染后掃描，ImageMaster 5.0 2D膠分析軟件結(jié)合手工操作進行分析，得到差異表達蛋白質(zhì)點。切取蛋白質(zhì)點以胰酶進行膠內(nèi)酶解，檢索Mascot數(shù)據(jù)庫(http://www.matrixscience.com/)確定蛋白質(zhì)名稱和功能。

三、統(tǒng)計學分析

結(jié) 果

一、細胞形態(tài)學變化

倒置生物顯微鏡下，正常對照組GES-1細胞呈長梭型，細胞形態(tài)飽滿，狀態(tài)良好，均一貼壁生長，培養(yǎng)基清亮；損傷組和保護組貼壁細胞數(shù)量均減少，與保護組相比，損傷組懸浮細胞增多，部分細胞核濃縮，細胞質(zhì)萎縮(圖1)。

A：正常對照組細胞形態(tài)飽滿，狀態(tài)良好；B：損傷組懸浮細胞增多，貼壁細胞減少；C：保護組可見懸浮細胞，但數(shù)量明顯少于損傷組

透射電子顯微鏡下，正常對照組GES-1細胞形態(tài)規(guī)整，胞核位于細胞中央，核膜完整，線粒體等細胞器分布于胞質(zhì)中；損傷組細胞結(jié)構(gòu)缺乏完整性，胞膜和核膜有不同程度的缺損，胞質(zhì)中細胞器減少，細胞呈現(xiàn)壞死狀態(tài)；保護組胞核呈現(xiàn)不規(guī)則的多樣性，但細胞結(jié)構(gòu)保持完整性(圖2)。

A：正常對照組細胞胞核位于細胞中央，核膜完整；B：損傷組細胞結(jié)構(gòu)缺乏完整性，胞膜和核膜缺損，細胞器減少，呈現(xiàn)壞死狀態(tài)；C：保護組細胞結(jié)構(gòu)保持完整性

二、細胞存活和凋亡情況

MTT實驗結(jié)果顯示，損傷組和保護組GES-1細胞存活率分別為19%和46%，保護組明顯高于損傷組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

流式細胞分析顯示，損傷組和保護組GES-1細胞凋亡率分別為30.6%和15.3%，保護組明顯低于損傷組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05；圖3)。

圖3 損傷組和保護組GES-1細胞凋亡流式細胞分析圖

三、差異表達蛋白篩選和鑒定

蛋白質(zhì)組學分析顯示，與損傷組相比，保護組有2種蛋白表達上調(diào)，名稱分別為T復(fù)合蛋白1 β亞基(T-complex protein 1 subunit beta, TCP-1β)和硫氧還蛋白依賴性過氧化物還原酶3(thioredoxin-dependent peroxide reductase 3, PRX3；圖4)，功能分別為減輕細胞炎癥反應(yīng)和保護細胞抵抗氧化應(yīng)激。

1: TCP-1β;2: PRX3

討 論

阿司匹林是一種常用的解熱鎮(zhèn)痛藥物，長期服用可造成不同程度的胃黏膜損傷，引起潰瘍和出血[1-2]。既往研究顯示，阿司匹林對胃黏膜細胞的損傷作用與抑制生長因子如血小板衍生生長因子AB(PDGF-AB)、血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)表達、抑制細胞增殖、誘導(dǎo)細胞凋亡等機制有關(guān)，氧化應(yīng)激在阿司匹林相關(guān)胃黏膜損傷中也發(fā)揮重要作用[2，8-10]。有研究[10]顯示，阿司匹林可能通過抑制Nrf2/HO-1抗氧化通路上調(diào)胃黏膜上皮細胞內(nèi)的活性氧(ROS)水平，產(chǎn)生氧化應(yīng)激，抑制細胞活力。

鋁碳酸鎂是一類具有抗酸和胃黏膜保護作用的非處方藥，可通過中和胃酸、抑制胃蛋白酶活性、增加前列腺素E2合成、促進表皮生長因子釋放、結(jié)合膽汁酸等多種藥理學作用保護胃黏膜、減少損傷和破壞胃黏膜的因素、促進潰瘍面修復(fù)，不良反應(yīng)少而輕微[3-7]。本研究體外實驗結(jié)果顯示，經(jīng)阿司匹林處理的人胃黏膜上皮細胞株GES-1發(fā)生明顯的形態(tài)學改變，貼壁細胞減少，懸浮細胞增多，細胞結(jié)構(gòu)缺乏完整性；予鋁碳酸鎂干預(yù)的GES-1細胞則能保持細胞結(jié)構(gòu)完整性，與損傷組相比，細胞存活率增高，凋亡率降低，差異均有統(tǒng)計學意義。進一步采用蛋白質(zhì)組學技術(shù)篩選損傷組與保護組的差異表達蛋白，發(fā)現(xiàn)保護組TCP-1β和PRX3蛋白表達顯著上調(diào)。TCP-1β是一種伴侶蛋白，又稱含TCP1伴侶蛋白亞基2(chaperonin containing TCP1, subunit 2, CCT2)，在真核細胞中主要參與協(xié)助蛋白質(zhì)的折疊、組裝、轉(zhuǎn)運和降解，在DNA的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄、細胞骨架功能、細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等方面也發(fā)揮重要生理作用[11-12]。研究表明CCTs可通過調(diào)節(jié)微管蛋白、肌動蛋白等，在腸道細胞微絨毛形成以及細胞的存活、遷移和侵襲中發(fā)揮重要作用[13-14]。本研究中保護組GES-1細胞高表達TCP-1β，提示其可能參與了鋁碳酸鎂的細胞保護作用。鋁碳酸鎂可能通過上調(diào)TCP-1β表達影響胃黏膜上皮細胞中的蛋白結(jié)構(gòu)和功能，進而影響細胞狀態(tài)，促進細胞存活，減輕阿司匹林相關(guān)胃黏膜損傷。PRX3定位于線粒體，具有強力抗氧化作用，可清除ROS，維持線粒體膜穩(wěn)定性，保護對自由基敏感的酶類抵抗氧化應(yīng)激損傷，并參與調(diào)節(jié)免疫炎癥相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子核因子-κB(NF-κB)激活，在線粒體抗氧化防御機制中起至關(guān)重要的作用[15-16]。本研究發(fā)現(xiàn)保護組GES-1細胞高表達PRX3，提示增強胃黏膜上皮細胞的抗氧化防御機制、維持線粒體穩(wěn)定可能是鋁碳酸鎂對阿司匹林相關(guān)胃黏膜損傷發(fā)揮保護作用的機制之一。

綜上所述，鋁碳酸鎂可通過促增殖、抗凋亡減輕阿司匹林相關(guān)胃黏膜損傷，其機制可能與改善細胞內(nèi)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能、抗氧化應(yīng)激等有關(guān)。然而，本研究僅在細胞水平進行了初步探討，后續(xù)擬建立阿司匹林急性胃黏膜損傷動物模型，通過檢測炎癥因子和氧化應(yīng)激相關(guān)因子的表達變化驗證鋁碳酸鎂的細胞保護作用，同時通過體內(nèi)外實驗對TCP-1β和PRX3所涉及的信號通路作進一步研究。