李 鑫 羅曉霞 張利莉*

（1塔里木大學生命科學學院，新疆 阿拉爾 843300）

（2新疆生產建設兵團塔里木盆地生物資源保護利用重點實驗室，新疆 阿拉爾 843300）

耐堿鏈霉菌是挖掘生物活性產物的寶貴資源，通常在近pH中性環(huán)境不能生長或生長緩慢，在高pH的環(huán)境下生長較好，高pH環(huán)境可能激活了耐堿微生物的某些基因使其具有獨特的生理和代謝機制，能夠產生特殊及多樣化的代謝產物[1-3]。但目前已知微生物資源僅占實有總數(shù)的1%～10%，極端環(huán)境的微生物資源更是知之甚少，還有很大挖掘空間[4-5]。因此，極端環(huán)境微生物物種鑒定十分重要，物種鑒定是獲得微生物資源、了解物種分布情況以及活性產物挖掘的重要基礎。隨著人類長期濫用抗生素及用藥習慣不規(guī)范等因素造成耐藥菌株的出現(xiàn)，新型藥物的尋找迫在眉睫。傳統(tǒng)的挖掘方式不能滿足生產生活需要，基于基因導向的次級代謝產物挖掘策略成為目前的研究熱點?；驅虻拇渭壌x產物挖掘策略就是對微生物進行全基因組測序，通過基因組注釋、分析以及相關蛋白和基因簇的預測明確菌株的次級代謝潛能，從而有針對性地進行挖掘，避免了傳統(tǒng)挖掘方式耗時長、隨機性大等限制性因素，因此基因組信息能夠為挖掘次級代謝產物快速、準確獲得新的天然產物提供理論基礎。

TRM49041是我室從羅布泊地區(qū)分離的一株耐堿菌株，為了明確其分類學地位及代謝潛力，本研究擬從形態(tài)特征、基因型特征、生理生化特征、化學特征和基因組測序等方面進行分析及鑒定，為豐富微生物種質資源庫、尋找結構新穎作用機制獨特的天然產物奠定良好工作基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

實驗菌株：菌株TRM49041分離自新疆羅布泊地區(qū)渠溝沉積物，菌種純化后保存于實驗室。

1.2 方法

1.2.1 基因特征鑒定

參照Andreas等人的方法[6]提取TRM49041全基因組 DNA，以 27F（5’-GAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’）和 1492R（5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’）為引物，TRM49041基因組DNA為模板，擴增菌株16S rRNA基因,通過克隆測序獲得菌株16S rRNA基因序列，后在EzTaxon server[7]數(shù)據(jù)庫中比對，通過 MEGA6[8]，采用最大簡約法、最大似然法以及鄰近法三種方法構建系統(tǒng)進化樹。全基因組測序采用Illumina Hiseq平臺測序。

1.2.2 形態(tài)特征鑒定

參照《放線菌快速鑒定與系統(tǒng)分類》[9]，將菌株接種于 ISP 系列培養(yǎng)基（ISP1、ISP2、ISP3、ISP4、ISP5、ISP6和ISP7）[10]以及查氏培養(yǎng)基、NA培養(yǎng)基、PDA培養(yǎng)基中37℃培養(yǎng)10～14 d，觀察并記錄菌株生長情況，菌株電鏡拍攝委托廣東微生物所完成。

1.2.3 生理生化特征鑒定

生理生化指標檢測方法采用《放線菌快速鑒定與系統(tǒng)分類》[9]進行菌株生長溫度、生長鹽濃度、生長pH、碳源利用、黑色素產生、硫化氫產生、明膠液化、牛奶凝固與胨化、淀粉水解、硝酸鹽還原、氧化酶產生、過氧化氫酶產生、尿素酶產生、脂肪酶產生以及纖維素分解等指標測定。

1.2.4 化學特征鑒定

全細胞水解糖和氨基酸組分鑒定參照Hasegawa等[11]方法，極性脂鑒定參照Minnikin等[12]方法通過二維薄層TLC板顯色鑒定，甲基萘醌鑒定參照Collins等[13]方法進行提取，通過HPLC檢測，細胞脂肪酸由廣東微生物所完成，按照MIDI公司微生物識別系統(tǒng)測定。

1.2.5 全基因組測序、注釋及分析

TRM49041測序由上海派森諾公司完成。測序采用全基因組鳥槍法，構建不同插入片段文庫，利用二代測序技術對文庫進行雙末端測序。采用A5-MiSeq和SPAdes對去除接頭序列的測序數(shù)據(jù)進行從頭拼裝得到contig和scaffold，對所得序列進行評估比較以及堿基校對。將所得基因組序列進行相關功能元件預測以及蛋白編碼基因功能注釋。

2 結果與分析

2.1 菌株鑒定

2.1.1 基因型特征的鑒定

對菌株TRM49041的16SrRNA基因進行比對分析，發(fā)現(xiàn)與Streptomyces luozhongensisTRM 49605T最相似，相似性為99.59%，ANI值為99.97%；與菌株Streptomyces roseolilacinusNBRC 12815T的相似性為98.54%，ANI值為86.27%。分別用最大簡約法、最大似然法以及鄰近法進行系統(tǒng)進化樹的構建，發(fā)現(xiàn)菌株TRM49041呈獨立的分支，與羅中鏈霉菌最相近（圖1）。

圖1 菌株TRM49041 16S rRNA基因的系統(tǒng)進化分析

2.1.2 形態(tài)特征鑒定

菌株TRM49041在ISP系列培養(yǎng)基、NA培養(yǎng)基、查氏培養(yǎng)基以及PDA培養(yǎng)基上均長勢良好（表1），在ISP1培養(yǎng)基中菌體生長良好、菌落偏小、密集，呈黃色光滑凸起狀；在ISP2培養(yǎng)基中菌體生長良好，菌落呈黃色褶皺狀；在ISP3培養(yǎng)基中菌落呈褶皺凸起狀；在ISP4、ISP5培養(yǎng)基中菌落呈黃、褐色光滑凸起狀；在ISP6培養(yǎng)基中菌體生長較弱、菌落呈白色凹陷狀；在ISP7培養(yǎng)基中菌體生長良好，菌落呈黃、褐色褶皺狀；在NA培養(yǎng)基中菌體生長旺盛、菌落偏小，密集，呈白色光滑凸起狀；在查氏、PDA培養(yǎng)基中菌落呈黃色褶皺凸起狀。菌株在ISP4培養(yǎng)基上生長最旺盛，菌體量最多且菌落形態(tài)規(guī)整呈圓形，基內菌絲呈黃色（圖2-a），因此選用ISP4培養(yǎng)基作為摸索TRM49041最適溫度、最適鹽濃度、最適pH及菌株形態(tài)特征鑒定的基礎培養(yǎng)基。通過S-3000N掃描電鏡觀察發(fā)現(xiàn)菌株氣生菌絲呈灰白色，粗壯，無間隔，未見孢子及孢子囊形成（圖2-b），形態(tài)特征鑒定結果表明TRM49041符合鏈霉菌一般特性。

表1 TRM49041在不同培養(yǎng)基生長情況

圖2 TRM49041菌落形態(tài)及掃描電鏡圖

2.1.3 生理生化特征鑒定

通過最適生長溫度、最適生長NaCl濃度、最適生長pH以及碳源利用情況等方面對TRM49041的生理生化特征進行鑒定，結果如表2所示。TRM49041最適生長溫度為37℃，最適pH為8.0～10.0，最適NaCl濃度為1%，菌株能夠利用蔗糖、D-甘露醇、可溶性淀粉、D-半乳糖醇、棉子糖、乳糖、麥芽糖和L-鼠李糖作為唯一碳源。牛奶凝固與胨化、淀粉水解、硝酸鹽還原、氧化酶產生、過氧化氫酶以及脂肪酶產生實驗均呈現(xiàn)陽性結果；黑色素產生、硫化氫產生、明膠液化、尿素酶產生及纖維素水解實驗結果呈陰性。通過生理生化特征鑒定，發(fā)現(xiàn)菌株與Streptomyces luozhongensisTRM 49605T相似性較大，但也存在差異。

表2 TRM49041及相似菌株生理生化指標比較

2.1.4 化學指標鑒定

通過全細胞水解糖組分、氨基酸組分、磷脂類型等方面對菌株TRM49041進行鑒定，結果表明TRM49041全細胞水解糖組分為核糖、木糖、葡萄糖、甘露糖及半乳糖（圖3-a）；全細胞氨基酸組分為L,L-DAP（圖3-b）；細胞膜磷酸脂類主要有DPG（磷脂酸甘油）、PE（磷脂酰甲醇胺）、PG（磷脂酰甘油）、PIM（磷脂酰甲基肌醇）以及一個未知類型的L極性脂（圖 3-c）；其主要脂肪酸類型為 C16:0ω8c（12.20%）、cyclo-C19:0（12.08%）、iso-C16:0（10.34%）、C18:1ω9c（7.39%）和cyclo-C17:0（7.33%）；甲基萘醌類型為 MK-10（H6）和 MK-10（H8）。通過對菌株細胞壁化學組分特征的鑒定，發(fā)現(xiàn)TRM49041與相似菌株Streptomyces luozhongensisTRM 49605T和Streptomyces roseolilacinusNBRC 12815T存在差異（表3），具有典型新菌種的特性。

圖3 TRM49041化學指標圖

表3 TRM49041及相似菌株化學指標比較

通過菌株16S rRNA基因以及基因組ANI值比對，結果顯示TRM49041與羅中鏈霉菌為同一個種，在形態(tài)特征、基因型特征、生理生化特征及化學特征具有相似之處，同時也存在明顯差異。因此將TRM49041確定為羅中鏈霉菌的一個亞種，根據(jù)其耐堿特性，命名為羅中鏈霉菌耐堿亞種（Streptomycesluozhongensissubsp.alkalitolerant）。

2.2 TRM49041基因組分析

2.2.1 TRM49041基因組組裝與注釋

TRM49041全基因組測序基于Illumina Hiseq測序平臺，通過構建不同插入片段的文庫，進行雙末端測序，插入片段大小為400 bp，測序模式為paired-end 2*150 bp，采用A5-MiSeq和SPAdes進行從頭拼接基因組。

原始數(shù)據(jù)結果表明，菌株TRM49041共有70 889 032個raw reads，通過序列拼接獲得68個骨架，基因組全長7 019 135 bp，GC含量為73.99%，共編碼6 212個基因。通過COG數(shù)據(jù)庫分析（E-value＜1E-10），獲得COG功能注釋的基因有5 193個，主要為功能預測、轉錄、碳水化合物代謝、能量轉化以及次級代謝產物合成等，非編碼RNA中含有1個5S rRNA、1個16S rRNA、1個23S rRNA以及 66個tRNA。

2.2.2 TRM49041 KEGG代謝通路分類

KEGG分類，是對糖代謝、脂代謝以及次級代謝物生物合成途徑等多種代謝途徑進行歸類，是了解物種生命活動特征、代謝活動潛能的重要工具。通過KEGG代謝通路分類，菌株TRM49041共有4 348個基因被注釋，其中關于糖代謝基因450個，占基因總數(shù)10.35%，氨基酸代謝基因361個，占基因總數(shù)8.30%，以及跨膜運輸基因138個，占基因總數(shù)3.17%（圖4），進一步分析發(fā)現(xiàn)注釋基因中含有15個鏈霉素產生代謝通路相關基因，因此推測此菌株是一株能夠產生鏈霉素或鏈霉素類似物的菌株。

圖4 TRM49041 KEGG功能歸類

2.2.3 TRM49041次級代謝潛能預測

通過GeneMarks及NCBI數(shù)據(jù)庫預測蛋白編碼基因，TRM49041共有6 212個ORF，在NCBI NR數(shù)據(jù)庫中檢索到相關蛋白編碼基因數(shù)量為5 967個。通過antiSMASH預測該菌株次級代謝潛能，共獲得27個潛在天然產物生物合成基因簇（表4）。

表4 TRM49041antiSMASH預測次級代謝產物生物合成基因簇

antiSMASH分析結果表明：鏈霉菌TRM49041具有豐富的天然產物生物合成基因簇，菌株含有NRP和Polyketide類基因簇，如cluster1，與鏈霉素生物合成基因簇相似性為85%；cluster2為核苷類化合物，與衣霉素生物合成基因簇相似性為64%；cluster5和cluster21為非核糖體肽類化合物，cluster5與salinichelins生物合成基因簇相似性為69%，cluster21與化合物JBIR-126生物合成基因簇相似性為92%；cluster3和cluster11為萜類化合物，cluster3與Ikarugamycin生物合成基因簇相似性為100%，cluster11與hopene生物合成基因簇相似性為76%；cluster18、cluster24為聚酮類化合物，cluster18與星孢菌素生物合成基因簇相似性為66%，cluster24與尼日利亞菌素生物合成基因簇相似性為55%。通過進一步比對分析發(fā)現(xiàn)cluster1具有鏈霉素合成相關結構基因；cluster2含有衣霉素合成相關結構基因；cluster3具有Ikarugamycin生物合成相關基因；cluster18具有星孢菌素合成相關結構基因；cluster21含有JBIR-126合成相關基因；cluster24含有尼日利亞菌素核心生物合成基因，因此推測TRM49041是一株能夠產生鏈霉素、衣霉素、星孢菌素、Ikarugamycin、JBIR-126和尼日利亞菌素的潛力菌株，極具挖掘潛力。

3 討論

本研究通過形態(tài)特征、基因型特征、生理生化特征及化學特征鑒定TRM49041具有羅中鏈霉菌的特征[14]，同時也存在明顯差異，根據(jù)鑒定結果以及TRM49041獨特的耐堿特性確定其為羅中鏈霉菌耐堿亞種（Streptomyces luozhongensissubsp.alkalitolerant）。通過基因組分析預測發(fā)現(xiàn)，TRM49041具有更豐富的潛在次級代謝生物合成基因簇。因此，基于16S rRNA基因序列比對相同種相似性非100%的菌株，也具有挖掘潛力。實驗結果及相關文獻表明，基于16S rRNA序列物種鑒定方式的辨識度并不是很高，尤其是相近種的鑒定，作為物種鑒定及生態(tài)學研究的黃金標準不具備更細致的分辨能力，有研究發(fā)現(xiàn)，在2 013個細菌和古菌完整基因中，物種的16S rRNA基因存在異質性，尤其是極端環(huán)境來源的微生物，差異分歧更加明顯[15]。用眾多保守基因中的一個基因來反映菌株親緣關系，存在種內變異性和基因組內操縱子間的異源性，可能會出現(xiàn)一定的偏差[16]，因此僅通過16S rRNA基因不足以很好的區(qū)分相似種或種內親緣關系，多個看家基因聯(lián)用或尋找分辨率更高的鑒定標準可能會一定程度減少偏差，能夠更細致劃分種群分類關系，使得更多物種資源得到充分利用[17]。

TRM49041是一株耐堿鏈霉菌，高pH的環(huán)境可能會激活耐堿微生物的某些沉默基因，誘導出獨特的代謝途徑。通過基因簇預測TRM49041具有多種生物活性的次級代謝產物生物合成基因簇，如：抗結核桿菌的鏈霉素；抗真菌、抗病毒的衣霉素；抗真菌、抗高血壓的星孢菌素等，初步推測該菌株具有較強的代謝能力，具有非常重要的挖掘價值。通過測序分析，解析菌株次級代謝途徑已成為天然產物挖掘的主流趨勢，本研究通過COG分析、GO注釋以及KEGG代謝途徑分析發(fā)現(xiàn)，TRM49041基因組中含有鏈霉素等多個次級代謝產物合成相關基因。鏈霉素作為重要的臨床用藥，備受關注，通過代謝組分分析，從D-葡萄糖出發(fā)合成6-磷酸葡萄糖，在脒基轉移酶等多種酶作用下合成鏈霉素。6-磷酸葡萄糖也作為新霉素、卡那霉素等合成的前體物質，因此通過選擇葡萄糖作為碳源，能夠提高抗生素的產量，此外通過對脒基轉移酶等關鍵酶基因進行克隆加倍，或增加強啟動子等基因修飾也可大大提高抗生素的產量，為后期抗生素挖掘提供思路。

本研究相關結果為鏈霉菌的鑒定、分類提供參考數(shù)據(jù)，通過基因組預測及代謝組分分析可為抗生素的挖掘提供指導思路。