閆浩凱，張波，劉琦，牛見明，史肖，韓舜愈*

1(甘肅農業(yè)大學 食品科學與工程學院，甘肅 蘭州，730070) 2(甘肅省葡萄與葡萄酒工程學重點實驗室(甘肅農業(yè)大學)，甘肅 蘭州，730070) 3(甘肅省葡萄與葡萄酒產業(yè)技術研發(fā)中心(甘肅農業(yè)大學)，甘肅 蘭州，730070) 4(甘肅農業(yè)大學 生命科學技術學院，甘肅 蘭州，730070)

白蘭地多指以葡萄為原料，通過發(fā)酵蒸餾制成的酒，是世界上最著名的蒸餾酒之一，與威士忌、伏特加、朗姆酒、金酒和中國白酒并稱為世界六大蒸餾酒[1-2]。香氣是白蘭地風格與品質的直接體現，目前已在白蘭地中檢出揮發(fā)性香氣物質超過幾百種，主要包括高級醇、酯類、酮醛類、酸類、萜烯類、苯衍生物等[3]，它們以不同的種類、濃度、相互作用共同影響著白蘭地的香氣品質[4-5]。研究發(fā)現，在各類揮發(fā)性成分中，酯類和醇類香氣物質含量最高，并且酯類物質種類最多，對白蘭地風味與風格的影響也最大[6]。宋普[7]從陳釀0～6年的白蘭地中共檢出113種香氣物質，其中酯類共43種，占總檢出物質的38%，與CALDEIRA等[8]的實驗結果相似，且酯類物質閾值相對較低，對白蘭地香氣形成具有突出貢獻?，F有研究發(fā)現，酯類總量占白蘭地非酒精揮發(fā)物總量的46%以上[9]，并且白蘭地中酯類含量與感官分析得分呈正相關[10]。因此，酯類物質是白蘭地香氣中的關鍵成分，也是評價白蘭地質量的重要指標，即總酯含量可間接反映白蘭地的陳釀進程及品質高低。

新蒸白蘭地一般具有苦澀、辛辣等缺陷。利用橡木桶陳釀可改善上述問題，目前已被認為是提升白蘭地品質的關鍵環(huán)節(jié)。在木桶陳化的過程中，酒內的一些物質發(fā)生氧化還原、酯化水解、分子締合等一系列反應，最終使白蘭地變得甜潤、綿柔、醇厚[11]。但傳統(tǒng)橡木桶陳釀過程十分緩慢，增加了生產企業(yè)在設備、場地和人力方面的投入，增加了生產成本，影響了酒廠的經濟效益[12]。因此，縮短白蘭地陳釀周期已成為制約其工業(yè)化生產的重點難點問題。目前利用物理手段加速白蘭地陳化已有一定數量的報道，如通過超聲[13]、電場[14]、電子束輻照[15]等技術在一定程度上可加塊白蘭地的陳釀速度，但在實際生產中，這些技術存在很多不足和缺陷，如電場和磁場處理所需的設備龐大，成本高，不易工業(yè)化規(guī)模生產[16]；超聲波和紅外等波譜處理條件不易控制，白蘭地品質難以保證[17]。此外，有些催陳處理還會導致酒體溫度升高，不利于白蘭地香氣品質的提升[18]。

超高壓技術通常是指在100 MPa以上的壓力條件下，使體系中各物質化學鍵的種類、性質等發(fā)生變化，進而達到一定的生產目的。研究發(fā)現，超高壓催陳酒類具有處理效率高、能耗小、非加熱、無反生現象等優(yōu)點，并且操作過程條件可控、質量穩(wěn)定，易于工業(yè)化規(guī)模生產[19-20]。近年來已有部分學者利用超高壓技術在酒類催陳研究中取得了不錯的實驗效果[21-23]。梁茂雨等[24]通過對清香型白酒進行超高壓處理后發(fā)現，酒中酯類、醛類、雜醇油等香氣物質含量顯著變化，其酒的香氣品質基本達到陳釀2年的水平，部分指標甚至能達到陳釀3年的效果。同樣的效果在經超高壓處理后的黃酒中也有出現，如酒樣中醇類、醛類香氣物質減少，酯類物質含量增加，表明超高壓可促進醇、醛等物質的轉化和酯類物質的合成，加速黃酒的陳化過程[25]。此外，超高壓技術在干紅葡萄酒陳釀過程中也有應用[26]，與對照相比，經超高壓處理后的干紅葡萄酒，其酯類香氣物質含量明顯增加，果香特征更加突出。盡管超高壓在酒類催陳方面已有研究，但在白蘭地方面的研究卻鮮有報道。本文以白玉霓葡萄白蘭地基酒為原料，通過單因素及響應面實驗優(yōu)化超高壓催陳處理的工藝參數，以期為白蘭地催陳方法的拓展以及評估超高壓技術在白蘭地催陳研究中的應用前景提供一定的理論支持。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

法國橡木桶：50 L，中度烘烤，蓬萊市沃林橡木桶有限公司。

白蘭地原酒：取自甘肅省莫高股份有限公司生產的白玉霓葡萄白蘭地基酒，經蒸餾釜二次蒸餾得到白蘭地原酒，酒精度60%。

1.2 主要試劑

NaOH、NaCl、濃H2SO4，酚酞指示劑等,天津市光復精細化工研究所。

1.3 主要儀器

TRACE 1310-ISQ氣相色譜-質譜儀，美國Thermo Scientific公司；DB-WAX氣相色譜柱，美國Agilent Technologies公司；HS-SPME裝置、DVB/CAR/PDMS萃取頭，美國Surpelco公司；HPP.L2-600/1超高壓處理裝置，天津華泰森淼生物工程技術股份有限公司；DC-0530低溫恒溫槽，上海平軒科學儀器有限公司；SB20L帝伯仕20 L三釜蒸餾器，煙臺帝伯仕有限公司；DK-S12型電熱恒溫水浴鍋，上海森信實驗儀器有限公司；DZ-450A真空包裝機，溫州市大江真空包裝機械有限公司；AE224型電子分析天平，上海舜宇恒平科技儀器有限公司；DF-2集熱式磁力攪拌器，常州市金壇恒豐儀器制造有限公司；8100摩爾超純水機，上海摩勒科學儀器有限公司。

1.4 試驗方法

1.4.1 總酯含量的測定

參考GB/T 11856—2008[27]的方法進行白蘭地中總酯含量的測定，按公式(1)計算：

(1)

式中：ρ,樣品中總酯的質量濃度(以乙酸乙酯計)，g/L；V1,皂化后樣品消耗NaOH標準滴定溶液體積，mL；V0,空白試驗皂化后樣品消耗NaOH標準滴定溶液的體積，mL；c,皂化后滴定時所用NaOH標準滴定溶液的濃度，mol/L；88,乙酸乙酯的摩爾質量，g/mol；V,吸取樣品的體積，mL。

1.4.2 主要酯類香氣化合物含量測定

1.4.2.1 香氣物質富集

取8 mL酒樣于15 mL樣品瓶中，加入2.0 g NaCl和10 μL內標2-辛醇(質量濃度為88.2 mg/L)，加轉子后密封并置于磁力攪拌器中，50 ℃下水浴平衡30 min后頂空萃取30 min。萃取完成后立即進行香氣成分檢測。

1.4.2.2 香氣成分分析

參照張斌[28]的方法，并略作調整。色譜條件：色譜柱DB-WAX(60 m×2.5 mm×0.25 μm)；升溫程序40 ℃保持5 min，以3.5 ℃/min升至210 ℃，保持15 min；載氣(He)流速 1 mL/min；進樣口溫度 230 ℃；不分流進樣。質譜條件：電子轟擊離子源(EI)；電子能量 70 eV；連接桿溫度 180 ℃；離子源溫度250 ℃；質譜掃描范圍50～350m/z。

定性分析：化合物經計算機檢索與 NIST Library(107 k compounds，Version 2.0 a，July 1，2002)相匹配對香氣物質種類進行初步確定。

定量分析：采用內標法進行半定量分析，按公式(2)計算：

(2)

式中：Ci,待測香氣物質質量濃度，mg/L;Ai,待測香氣物質峰面積;A內,內標的峰面積;C內,內標質量濃度，mg/L。

1.4.3 超高壓處理工藝流程

取白蘭地原酒100 mL裝入鋁箔袋中，真空包裝2次后放入20 ℃恒溫箱中備用。進行超高壓實驗前先打開恒溫槽預熱，達到設定溫度時將樣品放入加壓艙內，調節(jié)處理壓力、處理時間后進行超高壓實驗，每個樣品均超高壓處理1次。

1.4.4 單因素試驗

1.4.4.1 處理壓力對總酯的影響

取原酒100 mL，調節(jié)超高壓處理溫度為20 ℃，處理時間為30 min，研究不同處理壓力(100、200、300、400、500、600 MPa)對白蘭地的影響，試驗重復3次。

1.4.4.2 處理時間對總酯的影響

取原酒100 mL，調節(jié)超高壓處理溫度為20 ℃，壓力條件為200 MPa，研究不同處理時間(20、30、40、50、60、70 min)對白蘭地的影響，試驗重復3次。

1.4.4.3 處理溫度對總酯的影響

取原酒100 mL，調節(jié)超高壓處理壓力為200 MPa，處理時間為30 min，研究不同處理溫度(5、10、15、20、25、30 ℃)對白蘭地的影響，試驗重復3次。

1.4.5 響應面試驗設計

在單因素試驗結果的基礎上，利用Design-Expert 8.0.6.1軟件進行響應面試驗設計，以白蘭地中總酯含量為響應值，設計如下3因素(處理壓力、處理時間、處理溫度)3水平響應面試驗進行超高壓處理工藝的優(yōu)化。

表1 響應面試驗因素與水平

1.4.6 催陳工藝評價

利用1.4.5中響應面優(yōu)化的超高壓工藝參數對甘肅省莫高股份有限公司不同陳釀時間(4、5、6、7、8年)的白玉霓葡萄白蘭地中總酯及主要酯類香氣物質含量進行測定，從而評價本試驗優(yōu)化的超高壓處理工藝的實際效果。

1.5 試驗數據處理

利用Microsoft Excel 2010對試驗所得數據進行基本分析，利用OriginLab Origin 9.0繪圖，使用IBM SPSS Statistics 20.0進行顯著性分析(Duncan法，P<0.05)，響應面試驗設計及回歸分析使用Design-Expert 8.0.6.1軟件進行操作。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果

2.1.1 處理壓力對白蘭地中總酯的影響

如圖1所示，隨著處理壓力的增加，總酯含量呈現先大幅增加后小幅降低的趨勢，并且在300 MPa時總酯含量最高，為0.83 g/L，是未處理酒樣中總酯含量(0.62 g/L)的1.34倍。超高壓技術的本質是一個基本的熱力學變量，在超高壓技術處理過程中，高壓會引起體系內物質能量的變化，其中壓力為主要影響因素[29]。研究發(fā)現，超高壓技術主要是通過均衡效應、勒夏特列效應、微觀有序效應等原理使各種生物大分子物質結構、狀態(tài)、能力等發(fā)生一定變化，從而改變其原有性質[30]。在本實驗中，處理壓力為100、200 MPa時，總酯含量變化不大，當壓力繼續(xù)增加到300 MPa時，總酯含量迅速升高到最大值，但壓力過高，可能會降低酯類物質的穩(wěn)定性，從而造成酯類物質含量減少，本試驗結果與李紹峰[30]在葡萄酒的研究中有類似的結果。因此，試驗選擇處理壓力為300 MPa較為適宜。

圖1 超高壓處理壓力對白蘭地總酯含量的影響

2.1.2 處理時間對白蘭地中總酯的影響

由圖2可知，在其他因素水平固定時，當處理時間小于50 min時，總酯含量較低;當處理時間在50～70 min時，總酯含量較高，并且在處理時間為60 min時，總酯含量最高(0.84 g/L)。酯類物質合成需要消耗一定的化學能，而超高壓處理可增加酒中物質的能量，并且處理時間越長，酒中物質積累的能量越高。處理時間為10～40 min時，酒中積累的化學能較少，可能還未達到酯類物質合成反應的活化能;處理時間為50 min時，酒中積累的化學能超過酯類物質合成所需的能量，因此總酯含量大幅增加，并且隨著處理時間的繼續(xù)延長，總酯含量變化較小。此外，PANOSYAN等[31]在研究不同年份干邑白蘭地時發(fā)現，隨著時間的增加，酯類物質含量逐漸增加，白蘭地的風味和口感也有一定的提升，這與本實驗白蘭地中酯類物質變化趨勢一致。因此，超高壓處理時間為50 min較為適宜。

圖2 超高壓處理時間對白蘭地總酯含量的影響

2.1.3 處理溫度對白蘭地中總酯的影響

如圖3所示，總酯含量隨處理溫度的升高總體成上升趨勢，并且在25 ℃時，總酯含量最高，為0.83 g/L。當繼續(xù)升高處理溫度，總酯含量略微下降。醇和酸生成酯是吸熱反應，當升高溫度時，化學反應向生成酯的方向進行。此外，升高溫度會增加酒樣體系中的熵，體系中分子運動加劇，酯化反應的速度增加，但隨著溫度繼續(xù)升高，酯化反應的逆反應速率也在增加。結合本試驗結果可知，當溫度在25 ℃附近時，酯化反應速率趨于平衡；當溫度繼續(xù)升高，逆反應速率大于酯化反應速率，總酯含量開始降低，這與李聰麗[22]研究結果有著相同的趨勢。因此，超高壓處理溫度為25 ℃時較為適宜。

圖3 超高壓處理溫度對白蘭地總酯含量的影響

2.1 響應面優(yōu)化超高壓對白蘭地中總酯的影響

2.2.1 響應面試驗結果

以單因素試驗結果為基礎，利用Design-Expert 8.0.6.1軟件進行響應面試驗設計，響應面試驗設計及試驗結果如表2所示。

表2 響應面試驗設計及結果

2.2.2 響應面回歸模型的方差分析及顯著性檢驗

表3 優(yōu)化回歸模型方差分析及顯著性檢驗

表4 回歸模型可信度分析

2.2.3 響應面交互作用分析結果

為進一步研究本試驗中超高壓處理三因素間的交互作用，利用Design-Expert 8.0.6.1軟件繪制兩因素間交互作用的響應面圖。響應面圖像中顏色從藍紫色到紅橙色的漸變表示試驗指標從低到高的變化，圖像為凸面表示試驗指標有最大值[33]。圖4-a為處理溫度25 ℃時處理時間和處理壓力間的交互作用，與處理時間相比，超高壓壓力強度對總酯含量影響更大，并且處理時間與處理壓力間的交互作用較強。圖4-b為處理時間50 min時處理壓力和處理溫度間的交互作用，如圖4-b所示，底面形狀為橢圓，表明處理壓力和處理溫度間的交互作用顯著。圖4-c為處理壓力300 MPa時處理時間和處理溫度間的交互作用，響應面B、C軸方向變化趨勢均較為平緩，即二者對總酯含量影響幅度相似，響應面的底面等高線近似為圓，則說明二者交互作用較弱。此外，響應圖中所反映的因素間的交互作用與回歸方程的顯著性分析結果一致。

a-壓力與時間;b-壓力與溫度;c-時間與溫度

2.2.4 響應面工藝優(yōu)化與驗證試驗

對回歸方程進行極值求解得到最優(yōu)工藝參數見表5。

表5 最優(yōu)工藝參數及驗證試驗結果

為了驗證回歸模型所確定的最優(yōu)條件的正確性，結合實際操作對最優(yōu)參數略作調整后進行3次驗證試驗，試驗所得總酯含量平均為0.86 g/L，與模型預測值相差0.018 8 g/L，誤差較小。因此，本試驗所優(yōu)化的超高壓工藝參數具有較高的可行性，可用于白蘭地催陳研究。

2.3 催陳效果評價試驗結果

2.3.1 總酯含量比較結果

利用本試驗優(yōu)化的超高壓處理工藝對不同陳釀時間的白蘭地酒樣中總酯含量進行測定，以超高壓處理酒樣中總酯含量(0.86 g/L)為零水平，不同陳釀時間與超高壓處理總酯含量的差值為縱坐標進行作圖，結果如圖5所示。隨著陳釀時間的延長，白蘭地中總酯含量成逐漸上升趨勢，其逐年增長速率依次為10.61%、18.39%、4.72%和3.22%，即陳釀前期，白蘭地中總酯含量增加明顯，而在陳釀第7、8年時，白蘭地中總酯含量變化幅度較小。陳釀6年白蘭地總酯含量差值接近零水平，即超高壓處理組白蘭地中總酯含量與橡木桶陳釀6年的總酯含量相近。因此，在總酯含量方面，本試驗所優(yōu)化的超高壓處理工藝可達到橡木桶陳釀6年的效果。

圖5 超高壓處理工藝催陳效果評價

2.3.2 主要酯類香氣物質比較結果

結合前人研究與本試驗測定結果[34-35]，選擇乙酸乙酯、己酸乙酯、辛酸乙酯、月桂酸乙酯、癸酸乙酯、庚酸乙酯、琥珀酸二乙酯、乙酸異戊酯這8種酯類作為白蘭地的主要酯類香氣物質，并通過GC-MS測定其含量，測定結果如表6所示。

表6 白蘭地中主要酯類香氣物質含量 單位：mg/L

由表6可知，酯類香氣物質主要賦予白蘭地不同種類的水果香味，隨著陳釀時間的延長，各酯類香氣物質含量整體呈上升趨勢。其中己酸乙酯、辛酸乙酯、癸酸乙酯含量增幅最大，月桂酸乙酯、乙酸異戊酯含量增幅較小。與超高壓處理組中各酯類香氣物質含量相比，乙酸乙酯和乙酸異戊酯含量與陳釀7年白蘭地最接近，己酸乙酯、月桂酸乙酯、琥珀酸二乙酯含量與陳釀6年白蘭地最接近，辛酸乙酯含量與陳釀5年白蘭地最接近，癸酸乙酯、庚酸乙酯含量與陳釀4年白蘭地最接近。經超高壓處理后，白蘭地中主要的酯類香氣物質含量可達到4～7年的陳釀效果，并且超高壓處理對不同酯類香氣物質含量的催陳效果具有一定的差異。

為進一步探究經超高壓處理后白蘭地酒樣中主要酯類香氣物質與不同陳釀年份白蘭地中主要酯類香氣物質的關系，對表6中數據標準化處理后進行熱圖(heatmap)聚類分析，其結果如圖6所示。由圖6可知，依據陳釀年份可將6個酒樣聚為2類(Ⅰ、Ⅱ)，其中4、5、6年及超高壓處理組聚為Ⅰ類，其可達到VSOP級白蘭地，Ⅰ類還可細分為3類(ⅰ、ⅱ、ⅲ)，其中超高壓處理組和陳釀6年白蘭地聚為ⅲ類，則表明超高壓處理后白蘭地中主要酯類香氣物質可達到橡木桶陳釀6年的效果；陳釀7、8年白蘭地酒樣為Ⅱ類，可達到XO級，并且主要酯類香氣物質含量較高。

圖6 白蘭地中主要酯類香氣物質聚類分析

綜合分析總酯含量、主要酯類物質含量及聚類分析結果可知，優(yōu)化超高壓工藝處理后的白蘭地酒樣，其在總酯含量及主要酯類香氣方面有了明顯提升，可基本達到橡木桶陳釀6年的效果，但8種主要酯類香氣物質并非均達到陳釀6年的效果，即超高壓催陳后白蘭地各指標并不能與陳釀特定時間白蘭地各指標對應。因此，白蘭地的陳釀不能單純依靠催陳技術來實現，而高新的催陳技術結合傳統(tǒng)的陳釀方式可能會成為對白蘭地催陳研究的新方向。此外，總酯類含量對白蘭地的品質固然重要，其他指標對白蘭地品質的形成也具有一定的影響，而超高壓處理對白蘭地其他指標方面影響的相關研究還嚴重不足。因此，我們還需進一步綜合研究超高壓技術在白蘭地催陳處理中的應用前景，進而早日實現超高壓催陳白蘭地的工業(yè)化進程。

3 結論

本文以白玉霓葡萄白蘭地基酒為原料，對催陳工藝進行優(yōu)化，得到的最優(yōu)處理工藝參數為：處理壓力309 MPa，處理時間51 min，處理溫度25 ℃，此條件下總酯含量為0.86 g/L；催陳效果評價結果顯示，本試驗優(yōu)化的超高壓催陳方法可達到橡木桶陳釀6年的總酯效果；熱圖聚類分析結果顯示，超高壓處理后白蘭地中主要酯類香氣物質可基本達到橡木桶陳釀6年的效果。此外，本試驗中8種主要酯類香氣物質含量可達到4～7年的陳釀效果，并且超高壓處理對各酯類香氣物質含量的催陳效果具有一定的差異。