祝永才，楊勝林，譚斌，周璇，楊世皓，羅林麗

(貴州大學(xué) 動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，高原山地動(dòng)物遺傳育種與繁殖教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州 貴陽(yáng) 550025)

三穗麻鴨是貴州省著名的蛋用麻鴨品種，具有產(chǎn)蛋量高、成熟期短、善于行走、覓食能力強(qiáng)等特點(diǎn)，最突出的優(yōu)點(diǎn)是耐粗飼、產(chǎn)蛋率高、脂肪含量低、肉質(zhì)細(xì)嫩，富含多種人體必需氨基酸等營(yíng)養(yǎng)成分[1]。已有三穗麻鴨的研究多集中于生產(chǎn)性能、營(yíng)養(yǎng)成分和疾病預(yù)防，其行為學(xué)的研究較少。禽類啄羽行為是家禽啄擊同伴羽毛的一種非爭(zhēng)斗性的異常行為[2]。雞、鴨、鵝、鸚鵡等禽類都會(huì)表現(xiàn)啄羽行為，被啄的家禽生長(zhǎng)緩慢、羽毛殘缺、皮膚出血、潰爛，甚至引起死亡[3]。在高強(qiáng)度生產(chǎn)、集約化養(yǎng)殖的大背景下，蛋禽的啄羽行為對(duì)畜牧生產(chǎn)和動(dòng)物福利造成了不可忽略的負(fù)面影響。

前黑素小體蛋白(premelanosome protein-17，PMEL-17)，是黑素小體形成淀粉樣纖維的關(guān)鍵蛋白，在黑色素的形成和沉積中發(fā)揮重要作用[4-5]。已有研究發(fā)現(xiàn)，PMEL-17基因與家禽啄羽行為的發(fā)生存在一定的相關(guān)性[6-10]。本研究以有啄羽行為和無(wú)啄羽行為的三穗鴨為研究對(duì)象，分析PMEL-17基因在三穗鴨不同組織中的表達(dá)量，一方面是為了研究三穗麻鴨PMEL-17基因在不同組織中表達(dá)量規(guī)律，另一方面也為進(jìn)一步探討蛋鴨啄羽行為的發(fā)生機(jī)制提供依據(jù)，在優(yōu)良家禽育種、生產(chǎn)管理、動(dòng)物福利等方面都具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料

6月齡三穗鴨購(gòu)自三穗縣兄弟養(yǎng)鴨廠，檢疫合格、健康狀況良好。RevertAid Firt Strad cDNA Synthesis Kit K1621購(gòu)自北京賽默飛世爾科技有限公司，Ultra SYBR Mixture SYBR GreenⅠ購(gòu)自北京康為試劑生物科技有限公司。熒光定量PCR儀采用BIO-RAD CFX massage系統(tǒng)。

1.2 方法

1.2.1 處理設(shè)計(jì)

選取120只三穗鴨置于貴州大學(xué)養(yǎng)殖場(chǎng)內(nèi)進(jìn)行行為學(xué)觀察。分別于上午、下午相同時(shí)間，使用行為學(xué)軟件Media Record記錄當(dāng)日三穗鴨是否發(fā)生啄羽行為，連續(xù)記錄3周。連續(xù)不間斷地啄同一只鴨4 s以上時(shí)定義為發(fā)生啄羽行為，若將羽毛拔出，則定義為重度啄羽行為。根據(jù)其有無(wú)啄羽行為，將三穗鴨分為啄羽行為組和正常行為組。飼養(yǎng)期間，保證日糧營(yíng)養(yǎng)充足，自由采食、飲水，定期打掃鴨舍衛(wèi)生，定期清理糞便并消毒，保持鴨舍良好通風(fēng)，以保證三穗鴨處于良好的飼養(yǎng)環(huán)境。

1.2.2 樣品采集

試驗(yàn)結(jié)束后，隨機(jī)選出表現(xiàn)出啄羽行為和表現(xiàn)正常的三穗鴨各3只，采集心、肝、脾、肺、腎、腸、腦、胸、腿、眼、肌胃和腺胃共12個(gè)組織樣品，放入凍存管中-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 引物設(shè)計(jì)

參照NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中GeneBank所公布的雞PMEL-17基因的mRNA序列(登錄號(hào)：NM_205112.2)和鴨內(nèi)參基因β-actin(登錄號(hào)：NW_004677060.1)，利用Primer 5.0引物設(shè)計(jì)軟件設(shè)計(jì)引物。引物序列由生工生物(上海)有限公司合成。引物優(yōu)化體系：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，退火30 s，72 ℃延伸30 s，35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸5 min。引物序列與擴(kuò)增條件見(jiàn)表1，確定最佳退火溫度為58 ℃。

表1 引物信息

1.2.4PMEL-17基因檢測(cè)

采用Trizol法提取樣品總RNA，微量紫外分光光度計(jì)測(cè)定濃度及D值，采用反轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA第一鏈。采用SYBR GreenⅠ法對(duì)PMEL-17基因在各組織中的表達(dá)進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光相對(duì)定量分析。反應(yīng)體系為：混合反應(yīng)液25 μL，上下游引物各1 μL，cDNA 2 μL，補(bǔ)足ddH2O至50 μL。反應(yīng)以鴨內(nèi)參基因β-actin為參照基因，每個(gè)組織樣品的目的與內(nèi)參基因均重復(fù)檢測(cè)3次。反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性10 min；95 ℃變性15 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共40個(gè)循環(huán)；60 ℃ 5 s，90 ℃ 50 s。

1.2.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

運(yùn)用2-ΔΔCt法計(jì)算各基因在不同組織中的相對(duì)表達(dá)量，分析PMEL-17基因在三穗麻鴨各組織中的表達(dá)差異。使用Excel 2010統(tǒng)計(jì)原始數(shù)據(jù)，SPSS 18.0進(jìn)行單因素方差分析，Duncan法進(jìn)行多重比較，基因表達(dá)量以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 總RNA提取檢測(cè)

從三穗鴨12個(gè)組織中提取總RNA，經(jīng)微量紫外分光光度計(jì)測(cè)定，各樣品總RNAD260/D280均在1.80～2.01，D260/D230均在2.0以上，且各組織樣品最大吸收峰值均在260 nm處，說(shuō)明提取的樣品總RNA純度良好，無(wú)蛋白質(zhì)及其他雜質(zhì)污染，可用于下一步試驗(yàn)。

2.2 PMEL-17基因的PCR擴(kuò)增

三穗鴨部分組織樣品PMEL-17基因的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用0.5%的瓊脂糖凝膠檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖1。從圖1可以看出，PCR產(chǎn)物為一明亮的單帶，產(chǎn)物大小為226 bp，是目的基因。

圖1 PMEL-17基因的PCR產(chǎn)物檢測(cè)結(jié)果

2.3 熒光定量PCR檢測(cè)PMEL-17基因表達(dá)

三穗鴨PMEL-17基因在各組織的相對(duì)表達(dá)量見(jiàn)表2。由表2可知，三穗鴨啄羽組和無(wú)啄羽行為組中，PMEL-17基因在各組織樣品中均有表達(dá)，腦組織中相對(duì)表達(dá)量最高，心臟次之，肌胃中的相對(duì)表達(dá)量最低。

表2 PMEL-17基因在各組織中的相對(duì)表達(dá)量

除腦、心、胸組織外，啄羽組三穗鴨PMEL-17基因在其他組織中的表達(dá)量均低于正常行為組。啄羽組腦組織中PMEL-17基因表達(dá)量顯著高于正常組腦組織(P<0.01)。

3 討論

PMEL-17基因是稀釋基因家族成員之一，缺乏PMEL-17基因或表達(dá)突變的PMEL基因的動(dòng)物表現(xiàn)出不同程度的色素減退和色素細(xì)胞死亡[11]，是調(diào)控動(dòng)物毛色的主要候選基因[12-13]。彭燦陽(yáng)[14]研究發(fā)現(xiàn)，PMEL17基因的表達(dá)豐度影響雪峰烏骨雞黑色素沉積。姚文成等[15]研究發(fā)現(xiàn)，PMEL-17基因1904(C/G)、1961(T/C)和2143(A/G)位點(diǎn)基因型分布與鴨羽色具有顯著或極顯著差異。PMEL-17基因在動(dòng)物組織中表達(dá)的研究較少，在動(dòng)物啄羽行為的組織表達(dá)研究還未見(jiàn)報(bào)道。

雞羽毛的顏色主要與PMEL-17的基因型有關(guān)，其中顯性白、暗褐色和煙熏色是顯性白位點(diǎn)的等位基因，是影響家雞羽毛顏色的主要位點(diǎn)之一。顯性白和暗褐色均抑制黑色真黑素的表達(dá)[16]。雞的PMEL-17顯性白是影響羽毛顏色的主要位點(diǎn)之一，利用這一遺傳標(biāo)記，通過(guò)testcross分析鑒定了種系嵌合雞[17]。

雞啄羽行為與羽毛顏色的候選基因PMEL-17相關(guān)。白色羽毛母雞在追逐、攻擊、啄食和威脅行為特征上表現(xiàn)出明顯高于紅色羽毛母雞的攻擊性，如果將紅白雞混在一起可以減少攻擊性行為的發(fā)生[18]。在排除不良環(huán)境影響的情況下，PMEL-17基因型在雞的攻擊行為、探索行為和恐懼行為表現(xiàn)有差異性，并對(duì)其有直接影響[8]。Keeling等[10]研究發(fā)現(xiàn)，PMEL-17突變可以防止雞的啄羽行為。本試驗(yàn)中，PMEL-17基因在三穗鴨心、肝、脾、肺、腎、腸、腦、胸、腿、眼、肌胃和腺胃等12個(gè)組織中均有表達(dá)，且相對(duì)表達(dá)量存在差異。PMEL-17基因在啄羽組三穗鴨腦組織中表達(dá)量最高，與Karlsson等研究結(jié)果一致[19]。PMEL-17基因在組織中的表達(dá)規(guī)律與家禽的啄羽行為的發(fā)生具有一定的相關(guān)性，推測(cè)家禽啄羽行為的發(fā)生可能受到腦部某個(gè)區(qū)域神經(jīng)的調(diào)控，然而其相關(guān)性及調(diào)控機(jī)制還需進(jìn)一步研究驗(yàn)證。