杜周和 嚴旭 左艷春

摘要：通過花粉管通道將高丹草總DNA導入玉米自交系，獲得遺傳改變的突變體。突變體第1代穗柄明顯增長，結實雙穗，第2代長穗柄性狀消失，雙穗性狀保持，第3代雙穗性狀保持，株高發(fā)生分化。經(jīng)純化選擇，獲得遺傳穩(wěn)定的飼草玉米種質新材料，株高增高，葉片變細長，雙穗發(fā)育良好，飼用品質改善，全株干物質含量提高。

關鍵詞：花粉管通道技術;高丹草;總DNA提取;飼草玉米;種質資源

草牧業(yè)是農(nóng)業(yè)的重要組成部分，是一個國家農(nóng)業(yè)現(xiàn)代化水平的重要標志。歐美發(fā)達國家畜牧產(chǎn)值的60%以上由飼草轉化而來，美國飼料蛋白的50%以上來自飼草[1]。任繼周院士指出，制約我國草業(yè)發(fā)展的瓶頸是品種問題。優(yōu)良種質資源匱乏是制約我國飼草品種選育的重要因素之一。草料是草食牲畜的必需飼料組分，過量使用糧食飼養(yǎng)，不僅增加草食牲畜的養(yǎng)殖成本，而且會造成草食牲畜免疫力降低，增加發(fā)病機會。玉米是重要的糧食和飼料作物，2015年中央一號文件提出“糧改飼”工程，青貯玉米是工程推薦的首選草種。

利用花粉管通道轉導外源DNA是我國科學家首創(chuàng)的植物轉基因技術，1981年首次利用該技術培育出抗枯萎病的棉花新品種[2]。隨后，眾多科學家以不同植物為對象進行了大量研究，取得一批重要成果[3]。祁永紅等將大豆DNA導入玉米自交系，獲得具有廣泛變異的不同類型[4]。張秀君等將含高賴氨酸蛋白質基因的cDNA導入玉米，使籽粒干物質中賴氨酸含量提高18.75%[5]。孫學輝等將高賴氨酸基因導入玉米自交系，獲得種子中粗蛋白含量11.05%、賴氨酸含量提高16.00%的轉化植株[6]。王豐等將稗草總DNA和玉米總DNA導入水稻，獲得抗稻瘟病轉化植株[7]。王罡等將Bt抗蟲毒蛋白基因轉導到玉米自交系，獲得玉米抗蟲育種優(yōu)良抗源[8]。曹陽等研究獲得抗蟲轉基因高粱[9]。侯文勝等成功將人工合成的雪花蓮凝聚素基因sgna導入優(yōu)良小麥品系[10]。樂錦華等將廣譜抗真菌的菜豆基因與煙草基因導入棉花育成抗枯萎病、耐黃萎病的抗病新品系[11]。張茂銀等將新疆大賴草DNA導入普通春小麥獲得大穗、多粒、晚熟變異株[12]。鄒冬生等將玉米DNA導入水稻，獲得單穗總粒數(shù)、千粒質量顯著增加的超質量類型[13]。李建粵等將大豆總DNA導入水稻，提高了稻米的蛋白質含量和總氨基酸、賴氨酸含量[14]。

本研究采用花粉管通道技術將植株分蘗力強、產(chǎn)草量高的樂食高丹草總DNA導入玉米自交系，以期獲得在營養(yǎng)體生物產(chǎn)量、品質、抗性、再生性等方面有所突破的飼草玉米新種質，豐富飼草玉米育種的親本選擇。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗草種為樂食高丹草，市售;自46玉米自交系由四川省農(nóng)業(yè)科學院牧業(yè)研究中心提供。

1.2 試驗方法

1.2.1 試驗地概況 試驗地位于四川省南充市順慶區(qū)瀠溪鎮(zhèn)（106°12′E，31°06′N），海拔高度為 305 m，年日照時數(shù)為1 062 h;年均氣溫為17.6 ℃，極端最低溫度為-2.8 ℃，極端最高溫度為 42.1 ℃，10 ℃以上年積溫為5 206.9 ℃，平均氣溫10 ℃以上的天數(shù)為232 d;無霜期為307 d;年降水量為1 060 mm。紫色土壤，0～20 cm耕作層土壤pH值為7.94，有機質含量為42.8 g/kg，含全氮 5.1 g/kg、硝態(tài)氮178.82 mg/kg、速效鉀 163.66 mg/kg、有效磷 11.96 mg/kg。

1.2.2 植物基因組DNA提取 樂食高丹草種子用培養(yǎng)箱25 ℃催芽，剪取幼苗幼嫩莖葉，用天根生化科技（北京）有限公司的DP305型試劑盒提取基因組總DNA;核酸測定儀NanoDrop 2000測定濃度，內切酶Hind Ⅲ、BamHⅠ20 ℃酶解8 h，用檸檬酸鈉（SSC）緩沖液稀釋至300 μg/mL，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 外源DNA轉導入玉米自交系 2014年4月9日，田間種植自46玉米自交系，穴播，行距 100 cm、株距40 cm，苗高15 cm時間苗，每穴留壯苗1株。開花前夕用硫酸紙袋分別套住雌花和雄花，避免田間自然傳粉污染。每天觀察開花進度，雌花盛開時人工收集花粉自交授粉，然后繼續(xù)套袋保護。人工授粉15～24 h后，剪去距穗軸頂部1～2 cm 以上的苞葉和花絲，用移液器將樂食高丹草DNA溶液滴在花絲剪口處，每穗300 μL。繼續(xù)套袋保護直至玉米成熟，單穗收種。

1.2.4 種植調查 轉基因處理玉米單穗收種，翌年按穗行播種，同時播種未處理的自46自交系作對照，全生育期觀察比較生長發(fā)育情況，發(fā)掘性狀變異株。變異后代隔離種植，調查其生物學性狀、農(nóng)藝學性狀及遺傳分化情況。轉化第1代只發(fā)現(xiàn)1株變異株，作單株調查;其他各代均分別測定5個單株計算算術平均值。葉長、葉寬測量自上而下第7張葉;株高、葉長、葉寬、穗位、穗長、穗圍粗用卷尺測量;莖粗用游標卡尺在基部第2莖節(jié)“十”字方向測量2次;全株干物質含量測定在籽粒1/2乳線期收割（留茬高度為5 cm），105 ℃殺青30 min后65 ℃烘干測定。

1.2.5 數(shù)據(jù)處理 采用Excel 2007進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析。

2 結果與分析

2.1 樂食高丹草基因組DNA提取

經(jīng)檢測，所提取的DNA D260 nm/D280 nm值為 1.83，滿足試驗要求。

2.2 變異材料發(fā)掘

經(jīng)種植觀察，處理材料第1代和對照在種子出苗率、生長發(fā)育速度、株高、莖粗、株型、葉片大小、葉色、穗位等指標均未發(fā)現(xiàn)明顯變異。在處理材料的08穗行發(fā)現(xiàn)1株變異（命名為46優(yōu)），單株結實雙穗，穗柄明顯增長，穗柄長26 cm（圖1）;籽粒變大，百粒質量增加，約為38 g，與對照相比增加約33.33%（表1）。

2.3 變異材料繼代

3.4 研究成果的實踐意義

本研究采用花粉管通道技術，突破種屬限制，將同科異屬的高丹草DNA轉導入玉米自交系中，獲得了株高增高、葉形變得細長、雙穗性狀突出、干物質含量提高的飼草玉米新種質，增加了飼草玉米育種的素材選擇。植株形態(tài)的改變表明的確有外源基因整合到受體基因組中，引發(fā)了可穩(wěn)定遺傳的變異;雙穗發(fā)育良好，增加了玉米籽粒在收獲物種的比例，飼用品質提高。但研究還只是初步的，新材料的生理生化變異及轉化基因的分子檢測尚待深入進行，新材料的育種價值更需試驗驗證。本研究的重要實踐意義不在于獲得了1份突變新材料，更在于將花粉管通道轉基因技術引入飼草育種研究中，為飼草種質資源創(chuàng)新增添了一條行之有效的新途徑。

3.5 結論

飼草核心骨干種質資源匱乏及優(yōu)良品種不足嚴重制約我國畜牧業(yè)的發(fā)展。對廣大一線育種工作者而言，花粉管通道轉基因技術是創(chuàng)新種質資源的一種有效手段，已在其他作物育種中廣泛應用，取得可喜成績，但在飼草育種上幾乎還是空白。本研究成功將高丹草DNA轉導到飼草玉米中，獲得有益突變新材料，展現(xiàn)了花粉管通道轉基因技術在飼草種質資源創(chuàng)新中的可行性，為創(chuàng)制出量多質優(yōu)的飼草種質新資源提供參考。

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