錢 楊,吳李川,許童桐,沈秋霞,袁 洋,饒 瑜

(1.四川工商職業(yè)技術(shù)學院,四川成都 611830; 2.西華大學食品與生物工程學院,四川成都 610039)

四川泡菜歷史悠久,以味道咸酸、口感脆生、色澤鮮亮、香味撲鼻而著稱,被稱為“川菜之骨”[1]。四川泡菜的制作是以各種新鮮蔬菜為原料,在一定鹽濃度溶液中經(jīng)以乳酸菌為主的復雜微生物體系(由蔬菜和輔料等帶入)在相對封閉的池或壇中自然發(fā)酵得到[2]。而在實際生產(chǎn)過程中,常存在空氣滲入發(fā)酵環(huán)境的可能,空氣中的氧氣是發(fā)酵蔬菜中腐敗微生物生長的重要條件之一[3]。四川泡菜的發(fā)酵由乳酸菌主導完成,在無氧的條件下乳酸菌進行乳酸發(fā)酵,產(chǎn)生乳酸降低四川泡菜的pH,形成獨特的泡菜鮮香味?？諝獾臐B入不但對乳酸發(fā)酵無益,反而會促進某些好氧微生物的生長,造成四川泡菜中微生物菌群失衡,影響四川泡菜品質(zhì)。

四川泡菜品質(zhì)改變主要表現(xiàn)為鹽鹵pH上升、產(chǎn)生惡臭味和腐敗膜醭以及蔬菜軟腐等[4],其中蔬菜軟腐是由于腐敗微生物能夠分泌植物細胞壁降解酶(Plant cell wall degradation enzymes,PCWDEs),如聚半乳糖醛酸酶、纖維素酶、果膠酶、蛋白酶、木聚糖酶、淀粉酶等[5],PCWDEs能夠軟化植物組織,破壞四川泡菜質(zhì)構(gòu)影響四川泡菜品質(zhì)[6]。蔬菜軟腐一般是產(chǎn)PCWDEs微生物群體共同作用的結(jié)果[7],空氣暴露情況不同,四川泡菜中的微生物群體組成種類存在差異[8],導致產(chǎn)PCWDEs微生物種類不同,但目前尚無不同空氣暴露條件下四川泡菜中產(chǎn)PCWDEs微生物的相關(guān)研究。

鑒于此,本文采用發(fā)酵壇口暴露、間歇暴露和封閉三種空氣暴露程度分別模擬四川泡菜發(fā)酵過程中空氣暴露情況,以探究不同空氣暴露條件對四川泡菜發(fā)酵過程中品質(zhì)的影響,并分析比較不同空氣暴露條件下產(chǎn)PCWDEs微生物種類的差異,以期為四川泡菜生產(chǎn)過程中的品質(zhì)控制提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

新鮮紅皮蘿卜(約重150 g/個) 成都某菜市場;泡菜發(fā)酵菌株:植物乳桿菌E11(LactobacillusplantarumE11) 本實驗室前期分離并保藏,用于四川泡菜發(fā)酵[9],使用前由MRS培養(yǎng)基活化培養(yǎng);鹽酸(分析純)、乙酸鈉、磷酸鈉、可溶性淀粉、CaCl2成都科龍化工試劑廠;羧甲基纖維素 西亞化工股份有限公司;木聚糖 北京索萊寶科技有限公司;多聚半乳糖醛酸 上海源葉生物科技有限公司;酵母提取物、MRS瓊脂培養(yǎng)基、虎紅瓊脂培養(yǎng)基、胰蛋白胨大豆瓊脂培養(yǎng)基(Tryptone soy,TSA)、胰蛋白胨大豆肉湯培養(yǎng)基(Tryptone soy broth,TSB) 北京奧博星生物技術(shù)有限責任公司;Tri-HCl Amresco公司;EDTA 天津市致遠化學試劑有限公司。

TA-XT Plus質(zhì)構(gòu)分析儀 英國Stable Micro System有限公司;Multifuge XIR臺式冷凍離心機 賽默飛世爾科技(中國)有限公司;Mastercycler ep grad PCR儀 美國Bio.Rad公司;Gel Doc EQ凝膠成像系統(tǒng) 美國Bio.Rad公司;DYY-2電泳儀 北京六一儀器廠;G154DWS全自動高壓滅菌鍋 致微(廈門)儀器有限公司;pHS-3C酸度計 成都世紀方舟科技有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 培養(yǎng)基的配制 蛋白酶(Protease)鑒別培養(yǎng)基:以TSA培養(yǎng)基為基礎(chǔ),添加質(zhì)量分數(shù)為1%的脫脂牛奶;淀粉酶(Amylase)鑒別培養(yǎng)基:以TSA培養(yǎng)基為基礎(chǔ),添加質(zhì)量分數(shù)為1%的可溶性淀粉;纖維素酶(Cellulase)鑒別培養(yǎng)基:以TSA培養(yǎng)基為基礎(chǔ),添加質(zhì)量分數(shù)為0.1%的羧甲基纖維素,25 mmol/L磷酸鈉,pH7.0;木聚糖酶(Xylanase)鑒別培養(yǎng)基:以TSA培養(yǎng)基為基礎(chǔ),添加質(zhì)量分數(shù)為1%的木聚糖,25 mmol/L磷酸鈉,pH7.0;果膠酶(Pectate lyase)鑒別培養(yǎng)基:以TSA培養(yǎng)基為基礎(chǔ),添加質(zhì)量分數(shù)為1%的多聚半乳糖醛酸(Polygalaconic acid,PGA),質(zhì)量分數(shù)為1%的酵母提取物,0.38 μmol/L CaCl2,100 mmol/L Tri-HCl,pH8.5;聚半乳糖醛酸酶(Polygalacturonase)鑒別培養(yǎng)基:以TSA培養(yǎng)基為基礎(chǔ),添加質(zhì)量分數(shù)為1%的PGA,質(zhì)量分數(shù)為1%的酵母提取物,2.2 mmol/L EDTA,110 mmol/L乙酸鈉,pH5.5。

1.2.2 四川泡菜制備 將新鮮紅皮蘿卜去除葉叢和須根并用清水洗凈,晾干多余水分。取約3 kg洗凈晾干的紅皮蘿卜于5 L泡菜壇中,加入3 L含鹽質(zhì)量濃度為60 g/L的涼開水,涼開水中含已活化L.plantarumE11(終濃度為106CFU/mL)。隨后,分別采用發(fā)酵壇口暴露、間歇暴露和封閉三種不同空氣暴露程度進行四川泡菜發(fā)酵,以模擬不同的空氣暴露情況。具體方法如表1所示,其中每種發(fā)酵方式泡制3壇,共9壇,在50%RH空氣濕度下常溫發(fā)酵。分別在發(fā)酵的第0、8、16、32、48和64 d進行取樣用于后續(xù)分析。

表1 不同空氣暴露條件下制備四川泡菜Table 1 Preparation of Sichuan pickle under different air exposure conditions

1.2.3 pH測定 使用pHS-3C酸度計測定泡菜鹽鹵的pH。

1.2.4 微生物計數(shù) 微生物分離和計數(shù)參照GB 4789.2-2016《食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 菌落總數(shù)測定》制備樣品稀釋液,選取適當?shù)南♂屘荻韧坎加谂囵B(yǎng)基。TSA培養(yǎng)基用于細菌總數(shù)的分離和計數(shù),MRS瓊脂培養(yǎng)基用于乳酸菌的分離和計數(shù),虎紅瓊脂培養(yǎng)基用于霉菌和酵母菌的分離和計數(shù)。樣品涂布后平板于30 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)24～48 h。

1.2.5 感官評價 不同空氣暴露條件下四川泡菜的感官評價采用綜合評分法,總分為100分,泡菜的色澤、香氣、鹽鹵狀態(tài)、膜醭狀態(tài)四個評價指標各占25分。30名參評人員均為接受過食品感官評價培訓的專業(yè)人員,男女比例為1∶1,統(tǒng)一采用盲評打分法進行評價,評分細則詳見表2。

表2 不同空氣暴露條件下四川泡菜感官評價評分細則Table 2 Sensory evaluation and scoring rules of Sichuan pickle under different air exposure conditions

1.2.6 質(zhì)構(gòu)特性測定 樣品前處理:取一整個紅皮蘿卜,將其按圖1所示均勻切分為四塊后取1～4位點為測試點,分別將各位點切分為長寬3 cm,厚2 cm的長方體使用TA-XT Plus質(zhì)構(gòu)分析儀P/5探頭進行質(zhì)構(gòu)測定。測試程序:測試前30 mm/min,測試中20 mm/min,測試后30 mm/min,壓縮量50%,圧縮力5 g。

圖1 樣品切分及測試點示意圖Fig.1 Sample segmentation and test point schematic注;1:前段,2:中心,3:后段,4:表皮。

1.2.7 產(chǎn)植物細胞壁降解酶微生物的分離 分別從TSA、MRS和虎紅瓊脂平板上挑取單克隆若干點種于6種產(chǎn)酶特性鑒別培養(yǎng)基上,聚半乳糖醛酸酶和果膠酶鑒別培養(yǎng)基于28 ℃培養(yǎng)24 h后觀察產(chǎn)PCWDEs情況,其余鑒別培養(yǎng)基均于30 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h后觀察產(chǎn)PCWDEs情況。其中,聚半乳糖醛酸酶和果膠酶鑒別培養(yǎng)基需用4 mol/L鹽酸加在菌落周圍,觀察透明區(qū)域;淀粉酶鑒別培養(yǎng)基需用碘液染色,觀察透明區(qū)域;纖維素酶和木聚糖鑒別培養(yǎng)基需用1 g/L剛果紅溶液染色15～30 min,再用1 mol/L NaCl沖洗數(shù)次,觀察透明區(qū)域;蛋白酶鑒別培養(yǎng)基可直接觀察透明區(qū)域[10]。

1.2.8 產(chǎn)植物細胞壁降解酶微生物的鑒定 分別將產(chǎn)植物細胞壁降解酶微生物接種于TSB培養(yǎng)基中,30 ℃搖床培養(yǎng)過夜并獲得菌懸液。使用快速提取法提取菌液中總基因組DNA[11],并進行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。以總基因組為模板,分別利用細菌16S rDNA擴增引物1490R:5′-GGTTACCTTGTTAC GACTT-3′,Eu27F:5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′和真菌ITS擴增引物ITS4:5′-TCCTCCG CTTATTGATATGC-3′,ITS5:5′-GGAAGTAAAA GTCGTAACAAGG-3′進行目的DNA的PCR擴增。前者擴增程序為:95 ℃ 5 min;95 ℃ 1 min,50 ℃ 1 min,72 ℃ 2 min,35個循環(huán);72 ℃ 10 min;后者擴增程序為:94 ℃ 3 min;94 ℃ 30 s,40 ℃ 1 min,72 ℃ 1 min,30個循環(huán),72 ℃ 10 min。將符合測序條件的擴增產(chǎn)物送往成都擎科梓熙生物技術(shù)有限公司測序,測序結(jié)果在NCBI GenBank Database中進行BLAST比對,序列同源性≥97%時可認為是同一個屬,同源性≥98%時可認為是同一個種[12]。

1.3 數(shù)據(jù)處理

通過Origin 2018、MEGA 6.0、Clustal X、IBM SPSS Statistics 20、Excel 2007 等軟件對三個平行實驗得到的數(shù)據(jù)進行處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同空氣暴露條件下四川泡菜發(fā)酵過程中的pH變化分析

不同空氣暴露條件下四川泡菜發(fā)酵過程中的pH變化如表3所示,在發(fā)酵的前16 d,不同空氣暴露條件下四川泡菜鹽鹵的pH都表現(xiàn)出相同的下降趨勢,并均在發(fā)酵第16 d降至3.0,這是由于在四川泡菜發(fā)酵前期,乳酸菌能夠消耗蔬菜中的糖類產(chǎn)生乳酸[13],從而導致鹽鹵中的pH下降?？諝獾臐B入對四川泡菜的前期發(fā)酵未造成明顯影響,但隨著發(fā)酵時間的繼續(xù)增加,暴露式發(fā)酵四川泡菜的pH開始出現(xiàn)明顯上升,在發(fā)酵64 d時已上升至6.5,間歇暴露式發(fā)酵四川泡菜的pH也上升至3.5,但封閉式發(fā)酵四川泡菜的pH仍維持在3.0。鹽鹵pH回升是泡菜腐敗的重要標志之一[14],暴露條件下空氣的大量滲入促進了某些真菌的生長,真菌是引起泡菜腐敗的主要微生物[15]。

表3 不同空氣暴露條件下四川泡菜發(fā)酵過程中的pH變化Table 3 pH changes during the fermentation of Sichuan pickle in different air exposure conditions

2.2 不同空氣暴露條件下四川泡菜發(fā)酵過程中的微生物變化分析

分析圖2可知,發(fā)酵前16 d不同空氣暴露條件下四川泡菜中的微生物數(shù)量變化趨勢基本一致。從發(fā)酵起始至第8 d,以乳酸菌為主的總菌數(shù)量增加1～2個數(shù)量級,乳酸菌數(shù)量的增加導致了泡菜鹽鹵pH的下降。第8～16 d,pH進一步降至3.0,以乳酸菌為主的總菌數(shù)量開始回落,這主要是由于低pH抑制了細菌的生長,該結(jié)果與Xiong等[16]的研究一致。從第16 d起,不同空氣暴露條件下四川泡菜中的微生物的數(shù)量開始出現(xiàn)差異。封閉式發(fā)酵四川泡菜中的總菌、乳酸菌和真菌的數(shù)量未出現(xiàn)明顯上升或下降。間歇暴露式發(fā)酵四川泡菜中總菌和真菌逐漸上升,64 d時分別達到7.73±0.38和6.69±0.33 lg CFU/mL,而乳酸菌數(shù)量與第16 d相比,下降了1個數(shù)量級。暴露式發(fā)酵四川泡菜中總菌和真菌數(shù)量從第16 d開始增加,第48 d時總菌數(shù)已高于108CFU/mL,真菌數(shù)量于64 d時達到7.60±0.38 lg CFU/mL,而乳酸菌已降至4.03±0.20 lg CFU/mL,此時真菌占暴露式發(fā)酵四川泡菜微生物的主導地位,引起暴露式發(fā)酵四川泡菜pH上升。

圖2 不同空氣暴露條件下四川泡菜 發(fā)酵過程中的微生物變化Fig.2 Microbial changes during the fermentation of Sichuan pickle in different air exposure conditions

2.3 不同空氣暴露條件下四川泡菜發(fā)酵過程中的感官評價分析

不同空氣暴露條件下四川泡菜的pH從第16 d開始出現(xiàn)差異,發(fā)酵48 d后暴露式和間歇暴露式發(fā)酵四川泡菜出現(xiàn)了明顯腐敗,因此對發(fā)酵16和48 d的四川泡菜進行感官評價,評價結(jié)果見表4。封閉式發(fā)酵四川泡菜始終具有最高的評分,在整個發(fā)酵過程中,封閉式發(fā)酵四川泡菜始終具有泡菜特有的鮮香味和澄清的鹽鹵;間歇暴露式發(fā)酵四川泡菜在48 d時出現(xiàn)腐敗膜醭,鹽鹵出現(xiàn)渾濁并伴隨著輕微惡臭味;暴露式發(fā)酵四川泡菜始終具有最低的評分,在發(fā)酵16 d時雖有一定泡菜香味,但鹽鹵表面有零星腐敗膜醭出現(xiàn),到發(fā)酵48 d時,暴露式發(fā)酵四川泡菜已不再具有泡菜香味,取而代之的是嚴重惡臭味,且蔬菜顏色發(fā)生改變,鹽鹵渾濁,膜醭厚重。

表4 不同空氣暴露條件下四川泡菜的感官評價Table 4 Sensory evaluation of Sichuan pickles under different air exposure conditions

2.4 不同空氣暴露條件下四川泡菜發(fā)酵過程中的質(zhì)構(gòu)變化分析

質(zhì)構(gòu)是評價四川泡菜品質(zhì)的重要指標之一[17]。質(zhì)構(gòu)的測試方法一般采用人工感官評價和質(zhì)構(gòu)儀檢測。質(zhì)構(gòu)儀可通過監(jiān)測試樣的硬度、彈性、粘聚性、膠著性、咀嚼度、回復性等來反映樣品的質(zhì)構(gòu)變化。本研究從硬度、脆度、彈性和咀嚼性[18-19]四個方面考察不同空氣暴露程度下四川泡菜發(fā)酵過程中的質(zhì)構(gòu)變化。由圖3A～3D可看出,不同空氣暴露條件下四川泡菜在發(fā)酵第8 d都具有最佳的質(zhì)構(gòu)特性。隨著發(fā)酵時間的增加,三種空氣暴露條件下四川泡菜的質(zhì)構(gòu)都發(fā)生了不同程度的改變,發(fā)酵64 d后,和發(fā)酵8 d相比,暴露式發(fā)酵四川泡菜的硬度下降了93.3%,脆度下降了100%,彈性下降了4.7%,咀嚼性下降了95.8%;間歇暴露式發(fā)酵四川泡菜的硬度下降了39.1%,脆度下降了35.6%,彈性下降了4.9%,咀嚼性下降了46.9%;封閉式發(fā)酵四川泡菜的硬度下降了52.5%,脆度下降了24.4%,彈性下降了5.3%,咀嚼性下降了57.7%。到四川泡菜發(fā)酵后期,由于鹽鹵的長期浸泡和某些耐酸微生物開始生長繁殖,導致封閉式發(fā)酵四川泡菜的質(zhì)構(gòu)變差,此外,暴露式和間歇暴露式發(fā)酵四川泡菜由于空氣滲入,導致鹽鹵pH升高,泡菜中產(chǎn)PCWDEs的微生物數(shù)量增加,也進一步導致了泡菜質(zhì)構(gòu)變差。

圖3 不同空氣暴露條件下四川泡菜發(fā)酵過程中的質(zhì)構(gòu)分析Fig.3 Texture test of Sichuan pickle during the fermentations under different air exposure conditions

2.5 產(chǎn)植物細胞壁降解酶微生物的篩選與鑒定結(jié)果分析

微生物產(chǎn)植物細胞壁降解酶是造成泡菜質(zhì)構(gòu)發(fā)生變化的重要原因之一[4]。從涂布有不同空氣暴露程度下泡菜鹽鹵樣品的TSA培養(yǎng)基(發(fā)酵第48和64 d)上隨機挑取菌落各50株進行產(chǎn)PCWDEs分析,菌株產(chǎn)PCWDEs情況及鑒定結(jié)果如表5所示。不同空氣暴露條件下四川泡菜發(fā)酵過程中產(chǎn)PCWDEs微生物種類不同,發(fā)酵48 d時,僅在暴露式發(fā)酵四川泡菜中所挑取的50株微生物中分離得到3種共12株產(chǎn)PCWDEs微生物,這些微生物主要產(chǎn)纖維素酶。間歇暴露和封閉式發(fā)酵四川泡菜中未分得產(chǎn)PCWDEs微生物。

表5 不同空氣暴露條件下顯著產(chǎn)酶微生物的種類及產(chǎn)酶特性Table 5 Microbial species and their enzymatic properties from different air exposure conditions

發(fā)酵64 d后三種空氣暴露條件下的四川泡菜中均分離得到了一定數(shù)量的產(chǎn)PCWDEs微生物。其中暴露式發(fā)酵四川泡菜中分離得到2種共7株產(chǎn)PCWDEs微生物,這些微生物主要產(chǎn)纖維素酶、木聚糖酶和蛋白酶;間歇暴露式發(fā)酵四川泡菜中分離得到2種共6株產(chǎn)PCWDEs微生物,這些微生物以產(chǎn)聚半乳糖醛酸酶為主;封閉式發(fā)酵四川泡菜中分離得到2種共5株產(chǎn)PCWDEs微生物,這些微生物主要產(chǎn)淀粉酶。本研究分離得到產(chǎn)酶微生物的產(chǎn)酶種類與Kuge等[20-25]的研究結(jié)果一致。

對所分離得到的產(chǎn)PCWDEs微生物進一步分析可知,暴露條件分離得到的5種微生物中普羅威登斯菌(Providenciavermicola)、鉛黃腸球菌(Enterococcuscasseliflavus)和糞腸球菌(Enterococcusfaecalis)為兼性好氧型微生物,產(chǎn)堿桿菌(Alcaligenesfaecalis)和谷氨酸棒桿菌(Corynebacteriumglutamicum)為專性好氧型微生物;間歇暴露條件下分離得到的土霉菌(Galactomycesgeotrichum)為好氧微生物,植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)為兼性好氧型微生物;封閉條件下分離得到的蠟狀芽孢桿菌(Bacilluscereus)和季也蒙畢赤酵母菌(Meyerozymaguilliermondii)為兼性厭氧型微生物?？諝獾臐B入影響了四川泡菜中微生物的生長,尤其促進了暴露式發(fā)酵四川泡菜中產(chǎn)PCWDEs的好氧微生物生長,因此,在四川泡菜發(fā)酵過程應(yīng)嚴格控制空氣的滲入。

3 結(jié)論

不同空氣暴露條件對四川泡菜的品質(zhì)和產(chǎn)PCWDEs微生物的種類和數(shù)量均有影響。暴露式發(fā)酵四川泡菜在發(fā)酵的前16 d能夠正常完成泡菜的發(fā)酵,在發(fā)酵第8 d具有最佳質(zhì)構(gòu);但隨著發(fā)酵時間增加,持續(xù)的空氣暴露導致泡菜鹽鹵pH升高,泡菜發(fā)生軟腐,發(fā)酵48 d后在隨機挑取的50株微生物中就已分得12株以產(chǎn)纖維素酶為主的好氧型和兼性好氧型微生物;發(fā)酵64 d后暴露式發(fā)酵四川泡菜的pH上升至6.5,真菌數(shù)量上升至7.6 lg CFU/mL,和發(fā)酵8 d相比泡菜硬度和脆度分別下降了93.2%和100%,并且新分離得到7株產(chǎn)纖維素酶和蛋白酶為主的產(chǎn)PCWDEs微生物。間歇暴露式發(fā)酵四川泡菜雖能基本維持四川泡菜的特性,但在發(fā)酵64 d后仍出現(xiàn)腐敗,主要表現(xiàn)為pH上升至3.5,和發(fā)酵8 d的最佳質(zhì)構(gòu)相比泡菜硬度和脆度分別下降了39.1%和35.6%,產(chǎn)生惡臭味和腐敗膜醭,在該條件下分離得到的6株產(chǎn)PCWDEs微生物多為好氧型微生物。封閉式發(fā)酵四川泡菜在整個發(fā)酵過程中都能較好的維持四川泡菜的特性,發(fā)酵64 d后鹽鹵pH仍維持在3.0,乳酸菌數(shù)量雖下降至5.34 lg CFU/mL,但仍是四川泡菜中的主導微生物,在該條件下分離得到的5株產(chǎn)淀粉酶的微生物多為兼性厭氧型微生物。因此,在四川泡菜的家庭制作和工業(yè)生產(chǎn)中都應(yīng)當最大可能保證四川泡菜的封閉發(fā)酵,避免空氣滲入影響四川泡菜品質(zhì)。