李 芬，范玉堂，王麗娟，王寧寧，張 娟，王 妍，李勤凡

(1.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院，烏魯木齊 830052；2.西北農(nóng)林科技大學(xué) 動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，陜西楊凌 712100)

奶牛乳房炎是影響全球乳業(yè)發(fā)展的重要疾病之一，每年給養(yǎng)殖業(yè)造成極大的經(jīng)濟(jì)損失[1]。在中國奶牛養(yǎng)殖中，大腸桿菌(Escherichiacoli)是引起奶牛乳房炎最重要的病原菌之一[2]。目前國內(nèi)主要使用抗生素治療奶牛乳房炎，但抗生素的不合理使用導(dǎo)致病原菌產(chǎn)生耐藥性，給治療增加了難度[3]。隨著對(duì)大腸桿菌耐藥機(jī)制的研究，發(fā)現(xiàn)細(xì)菌耐藥與生物被膜(Biofilms,BF)的形成緊密相關(guān)[4]。

大腸桿菌易附著于物體表面形成BF[5]，BF的形成影響細(xì)菌對(duì)抗生素的敏感性，使細(xì)菌出現(xiàn)耐藥[6]。此外，BF對(duì)抗生素具有很強(qiáng)的抵抗性，一經(jīng)形成就很難被徹底清除，易導(dǎo)致反復(fù)感染[7]。因此，如何有效突破大腸桿菌BF的保護(hù)作用殺滅細(xì)菌，對(duì)于治療產(chǎn)BF的大腸桿菌引起的感染非常重要。

本試驗(yàn)對(duì)陜西關(guān)中地區(qū)分離的35株大腸桿菌進(jìn)行BF形成能力鑒定、藥物敏感性及抗生素對(duì)BF干預(yù)作用的檢測(cè)，旨在了解奶牛乳房炎大腸桿菌BF的形成對(duì)耐藥性的影響及抗生素對(duì)BF形成的影響，為合理選擇藥物控制大腸桿菌BF的形成提供資料。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 菌株及來源 35株大腸桿菌從陜西省楊凌區(qū)、華陰市、寶雞市3 個(gè)規(guī)模化奶牛場(chǎng)乳房炎奶牛的乳樣中分離鑒定，保存于西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)醫(yī)學(xué)院生物毒素實(shí)驗(yàn)室，檢測(cè)其BF陽性的菌株數(shù)、BF的成分和BF的形成能力及抗生素對(duì)BF形成的作用[8]。

1.1.2 主要試劑及儀器 剛果紅、考馬斯亮藍(lán)均為Sigma公司產(chǎn)品；Spark多功能酶標(biāo)儀為瑞士帝肯有限公司產(chǎn)品，熒光顯微鏡為Olympus 公司產(chǎn)品。

1.2 方 法

1.2.1 BF陽性菌檢測(cè) 復(fù)蘇待測(cè)菌株后，接種于LB肉湯中，37 ℃培養(yǎng)過夜，轉(zhuǎn)接于剛果紅瓊脂固體培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)48 h后觀察菌落顏色，黑色菌落為BF陽性菌，紅色菌落為BF陰性菌[9]。

1.2.2 BF中卷曲菌毛及胞外纖維素的檢測(cè) 參照文獻(xiàn)[10]，用剛果紅考馬斯亮藍(lán)固體培養(yǎng)基檢測(cè)菌株BF的成分，取5 μL 1.5×108CFU/mL的菌液滴加到含30 mg/mL考馬斯亮藍(lán)和40 mg/mL剛果紅的無鹽LB固體培養(yǎng)基中央， 28 ℃培養(yǎng)72 h后觀察菌落形態(tài)、顏色。

1.2.3 菌株BF形成能力檢測(cè) 參照文獻(xiàn)[11]的方法將BF陽性菌株接種至LB肉湯中，37 ℃培養(yǎng)過夜，將菌液濃度調(diào)至1.5×108CFU/mL，于96孔板中每孔加入200 μL LB肉湯和10 μL菌液，空白對(duì)照組加入210 μL LB肉湯，每株菌做5個(gè)重復(fù)，37 ℃連續(xù)培養(yǎng)48 h；經(jīng)甲醇固定，結(jié)晶紫染色，冰乙酸脫色后，測(cè)定其OD570值。

結(jié)果判定：以空白對(duì)照組的2倍OD值作為臨界值(ODC)，根據(jù)OD570值將BF形成能力強(qiáng)弱分為以下幾類：OD≤ODC，不能形成BF(-)；ODC 4ODC，BF形成能力強(qiáng)(+++)。

根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果篩選1株強(qiáng)成膜能力的菌株進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

1.2.4 浮游菌最小抑菌質(zhì)量濃度和最小殺菌質(zhì)量濃度的測(cè)定 以大腸桿菌ATCC 25922作為質(zhì)控菌，按照微量肉湯稀釋法測(cè)定頭孢噻呋、鏈霉素、四環(huán)素、環(huán)丙沙星、慶大霉素、青霉素這6 種抗生素的最小抑菌質(zhì)量濃度(MIC)及最小殺菌質(zhì)量濃度(MBC)，結(jié)果判定參照CLSI(2015)標(biāo)準(zhǔn)[12]。

1.2.5 BF菌最小抑菌質(zhì)量濃度和最小殺菌質(zhì)量濃度的測(cè)定 試驗(yàn)菌株在96 孔板上培養(yǎng)48 h 形成BF后，用無菌PBS輕柔漂洗除去浮游菌，用微量肉湯二倍稀釋法倍比稀釋各個(gè)抗生素，使得各個(gè)抗生素終質(zhì)量濃度依次為1.25、2.5、5、…、2 560 μg/mL，取200 μL不同質(zhì)量濃度的抗生素分別加入到具有BF的96孔板中，每個(gè)質(zhì)量濃度3 個(gè)重復(fù)，對(duì)照組加等量MH肉湯。結(jié)果判定：測(cè)定OD600值，培養(yǎng)24 h后再次測(cè)定OD600值，當(dāng)培養(yǎng)前后的OD600值相近時(shí)判定為BF的最小抑菌質(zhì)量濃度(MBIC)；將高于BF菌最小抑菌質(zhì)量濃度孔中的混合液混勻，依次吸取100 μL 混合液，分別均勻涂布于LB 瓊脂培養(yǎng)基中，培養(yǎng)24 h后測(cè)定的OD600值判定為BF菌最小殺菌質(zhì)量濃度(MBBC)。

1.2.6 不同質(zhì)量濃度抗生素對(duì)被膜態(tài)大腸桿菌形成的抑制作用 根據(jù)上述所測(cè)得的最小抑菌質(zhì)量濃度，將頭孢噻呋、鏈霉素、四環(huán)素、環(huán)丙沙星、慶大霉素、青霉素這6 種抗生素配制成1/2 MIC、MIC、2 MIC、4 MIC、8 MIC的質(zhì)量濃度，96 孔板每孔加入100 μL稀釋好的菌液和100 μL配制好的不同質(zhì)量濃度抗生素，空白對(duì)照組加入200 μL菌液，37 ℃培養(yǎng)24 h后，參照結(jié)晶紫染色法進(jìn)行處理，測(cè)定其OD570值。抑制率=(空白對(duì)照組OD值-試驗(yàn)組OD值)/空白對(duì)照組OD值×100%。

1.2.7 不同質(zhì)量濃度抗生素對(duì)被膜態(tài)大腸桿菌BF的清除作用 在96 孔板中培養(yǎng)試驗(yàn)菌株形成BF后，棄去殘存培養(yǎng)液，用無菌PBS輕柔漂洗除去浮游菌，分別取200 μL質(zhì)量濃度為1/2 MIC、MIC、2 MIC、4 MIC、8 MIC的頭孢噻呋、鏈霉素、四環(huán)素、環(huán)丙沙星、慶大霉素、青霉素加入到具有BF的96孔板中，同時(shí)加入等量MH肉湯作為對(duì)照，每組3 個(gè)重復(fù)，37 ℃培養(yǎng)24 h，參照結(jié)晶紫染色法處理，測(cè)定其OD570值，計(jì)算清除率。清除 率=(空白對(duì)照組OD值-試驗(yàn)組OD值)/空白對(duì)照組OD值×100%。

2 結(jié)果與分析

2.1 BF的形成能力檢測(cè)

結(jié)果表明，試驗(yàn)株中有19株為BF陽性菌(54.29%)，16株為BF陰性菌(45.71%)(圖1)。BF陽性菌中有6株(31.58%)BF形成能力強(qiáng)，10株(52.63%)BF形成能力中等，3株(15.79%)BF形成能力弱。

2.2 BF中卷曲菌毛及胞外纖維素的檢測(cè)

19株BF陽性菌在剛果紅考馬斯亮藍(lán)固體培養(yǎng)基上可以形成4種顏色的菌落，其中紅色粗糙干燥型12株(63.16%)，表示BF同時(shí)含有卷曲菌毛和胞外纖維素；棕色干燥粗糙型1株 (5.26%)，表示BF含有卷曲菌毛；粉色干燥粗糙型2株(10.53%)，表示BF只含胞外纖維素；白色光滑型4株(21.05%)，表示BF不含胞外纖維素和卷曲菌毛；此外，BF同時(shí)含有卷曲菌毛和胞外纖維素的紅色粗糙干燥型的菌株成膜能力最強(qiáng)(圖2)。

2.3 BF形成前后的耐藥性

通過對(duì)大腸桿菌BF的形成時(shí)間測(cè)定，發(fā)現(xiàn)該形成是個(gè)動(dòng)態(tài)過程，72 h內(nèi)BF形成量先增加后減少，48 h時(shí)BF形成量最大，因此BF形成的最佳培養(yǎng)時(shí)間為48 h。

由表1可知，BF形成前，大腸桿菌對(duì)環(huán)丙沙星及頭孢噻呋這2種抗生素較敏感，對(duì)其余幾種抗生素顯示不同程度耐藥；BF形成后，大腸桿菌對(duì)這6種抗生素的最小抑菌質(zhì)量濃度及最小殺菌質(zhì)量濃度分別提高4～16倍、8～64倍。

A.BF陰性菌; B.BF陽性菌

A. 紅色干燥粗糙型; B. 棕色干燥粗糙型; C. 粉色干燥粗糙型; D. 白色光滑型

表1 大腸桿菌BF形成前后耐藥性的變化Table 1 Changes of drug resistance before and after BF formation in E. coli

2.4 不同質(zhì)量濃度抗生素對(duì)被膜態(tài)大腸桿菌形成BF的抑制作用

抗生素質(zhì)量濃度越大對(duì)BF形成的抑制率越高；在抗生素質(zhì)量濃度小于MIC時(shí)，只有環(huán)丙沙星的抑制作用較明顯，其余5種抗生素的抑制作用均不明顯；當(dāng)抗生素質(zhì)量濃度大于MIC時(shí)，所有抗生素對(duì)BF的形成均產(chǎn)生明顯的抑制作用，其中頭孢噻呋及環(huán)丙沙星的抑制效果較好，鏈霉素和青霉素的效果較差(圖3)。

2.5 不同質(zhì)量濃度抗生素對(duì)被膜態(tài)大腸桿菌BF的清除作用

抗生素質(zhì)量濃度越大對(duì)BF的清除率越高；抗生素質(zhì)量濃度為MIC時(shí)，環(huán)丙沙星和頭孢噻呋對(duì)BF的清除效果較好，青霉素和鏈霉素的清除效果較差(圖4)。

2.6 抗生素對(duì)被膜態(tài)大腸桿菌的殺滅效果

熒光染料PI可以進(jìn)入死菌內(nèi)發(fā)出紅色熒光，從圖5可以看出，環(huán)丙沙星、頭孢噻呋組的死菌數(shù)多，青霉素和鏈霉素組中的死菌數(shù)最少。說明環(huán)丙沙星、頭孢噻呋對(duì)被膜態(tài)大腸桿菌的殺滅效果較好。

圖3 不同抗生素對(duì)被膜態(tài)大腸桿菌的抑制作用Fig.3 Inhibition effect of different antibiotics on biofilm of E. coli

圖4 不同抗生素對(duì)被膜態(tài)大腸桿菌的清除效果Fig.4 Clear effect of different antibiotics on biofilm of E.coli

3 討 論

奶牛乳房炎是全球范圍內(nèi)最常見且位居奶牛四大疾病之首的疾病[13]。大腸桿菌是常見的成膜致病菌，作為引起奶牛乳房炎的重要病原菌嚴(yán)重阻礙畜牧業(yè)的健康發(fā)展[14]。臨床上抗生素大多是針對(duì)浮游微生物的，然而環(huán)境中大腸桿菌主要以集落或者BF的形式存在，常規(guī)劑量很難起到有效作用[15-16]。

本研究對(duì)從患乳房炎的奶牛樣中分離的35株大腸桿菌BF檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，BF陽性率為 54.29%，以強(qiáng)、中成膜能力為主(84.21%)。大腸桿菌BF的檢出率和成膜能力可能與宿主、地域、疾病類型以及用藥種類等有關(guān)。夏琦琦等[17]從水貂腸道中分離的54株致病性大腸桿菌BF陽性率為 90.70%，以強(qiáng)成膜能力為主(81.50%)；喻華英等[18]從犢牛糞便中分離的 60株大腸桿菌BF陽性率為15.0%，以中等成膜能力為主，僅有1株BF呈強(qiáng)陽性。卷曲菌毛和胞外纖維素是影響細(xì)菌在接觸面附著和BF形成能力的兩個(gè)重要表面成分，在BF形成過程中發(fā)揮特定的作用[19]。本研究對(duì)19株菌的BF成分卷曲菌毛和胞外纖維素進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)63.16%的菌株BF同時(shí)含有卷曲菌毛和胞外纖維素，且這部分菌株BF的形成能力較強(qiáng)。

A. 對(duì)照組; B. 鏈霉素組; C. 頭孢噻呋組; D. 四環(huán)素組; E. 慶大霉素組; F. 青霉素組; G. 環(huán)丙沙星組

BF是導(dǎo)致大腸桿菌耐藥性增加的一個(gè)重要因素，BF的形成可降低其對(duì)抗生素的敏感性[3]。Tremblay等[20]研究發(fā)現(xiàn)，BF形成后，被膜菌較浮游菌的耐藥性提高4～2 048倍。本研究選取臨床上治療乳房炎常用的頭孢噻呋、鏈霉素、青霉素、環(huán)丙沙星、慶大霉素和四環(huán)素這6種抗生素作為試驗(yàn)藥物，檢測(cè)大腸桿菌BF形成前后的耐藥性，發(fā)現(xiàn)大腸桿菌BF形成后6種抗生素的最小抑菌質(zhì)量濃度和最小殺菌質(zhì)量濃度分別提高4～16倍、8～64倍。

細(xì)菌BF給醫(yī)療、環(huán)境衛(wèi)生以及養(yǎng)殖業(yè)等許多領(lǐng)域帶來嚴(yán)重的危害，因此研究有效抑制BF形成的方法很有必要。本研究選擇臨床常用的6種抗生素研究其對(duì)BF的抑制作用發(fā)現(xiàn)，隨抗生素質(zhì)量濃度的增大，對(duì)BF形成的抑制率越高，其中環(huán)丙沙星抑制效果較好，可以控制BF的早期形成，這與環(huán)丙沙星等喹諾酮類的滲透性較強(qiáng)有關(guān)[21]。

本研究同時(shí)進(jìn)行6種抗生素對(duì)BF的清除效果和對(duì)BF內(nèi)細(xì)菌的殺滅作用研究，發(fā)現(xiàn)環(huán)丙沙星對(duì)BF內(nèi)細(xì)菌的殺滅效果和BF的清除效果最好，在質(zhì)量濃度為MIC時(shí)清除率達(dá)50%以上，這與相關(guān)文獻(xiàn)中報(bào)道的相對(duì)高質(zhì)量濃度環(huán)丙沙星可以破壞BF的結(jié)果一致[22]。本研究中，即使環(huán)丙沙星質(zhì)量濃度達(dá)到4 MIC時(shí)，對(duì)BF的清除率也僅為64.9%，因此要想徹底清除BF，可以其他參考文獻(xiàn)報(bào)道的方法考慮聯(lián)合用藥[23-24]。