康利娟，金 明，張彩虹，魏玉樹,單衛(wèi)星，強(qiáng)曉玉

(西北農(nóng)林科技大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，陜西楊凌 712100)

植根于土壤中的植物會(huì)直接與豐富多樣的土壤微生物相互作用、相互適應(yīng)，利用“植物-微生物”互作實(shí)現(xiàn)互惠互利[1]。一方面，微生物可將營養(yǎng)物質(zhì)轉(zhuǎn)化，供植物直接吸收和利用；另一方面，微生物可通過根系分泌物從植物中獲得營養(yǎng)和能源物質(zhì)(單糖、多糖、氨基酸、有機(jī)酸和蛋白質(zhì)等)[2]。有益的土壤微生物還有助于植物抵抗病原體、保持水分并合成促進(jìn)生長的激素[3]。研究表明，根部相關(guān)的微生物互作可能比在土壤中大部分微生物的互作更加復(fù)雜，并且大多數(shù)互作都是積極的，說明根際具有更大的互作潛質(zhì)[4]。

近年來，高通量測(cè)序的發(fā)展為不同的植物微生物群落的組成和結(jié)構(gòu)提供了新的見解。Peiffer等[5]在不同的田塊，對(duì)種植有隨機(jī)排列的27個(gè)品種的玉米自交系地塊，進(jìn)行田塊土壤以及玉米根際土的細(xì)菌16s rRNA基因測(cè)序分析，結(jié)果表明，玉米自交系的根際土壤微生物多樣性低于田間土壤微生物多樣性，但是玉米根際微生物具有顯著的遺傳變異特性，并且發(fā)現(xiàn)，在不同地塊的同一自交系之間具有更大的遺傳變異； Keark等[6]對(duì)抗青枯病具有顯著差異的兩個(gè)番茄品種(Hawaii7996：抗病品種；Moneymaker：感病品種)的根際微生物進(jìn)行宏基因組測(cè)序分析，發(fā)現(xiàn)在抗病品種Hawaii7996的根際含有比感病品種更豐富的黃桿菌基因組，通過進(jìn)一步的功能驗(yàn)證，黃桿菌TRM1能夠有效地抑制感病番茄品種青枯病害的發(fā)生。

根部內(nèi)生菌生存于宿主植物根部組織中，與宿主之間有密切的相互作用。內(nèi)生菌能夠促進(jìn)宿主植物從周圍環(huán)境中獲取營養(yǎng)物質(zhì)并促進(jìn)其生長[7]，提高宿主植物對(duì)干旱、低溫等非生物逆境的適應(yīng)能力[8]。同時(shí)，內(nèi)生菌還能夠協(xié)助宿主植物抵抗病、蟲害等生物迫害，例如，印度梨形孢Piriformosporaindica是最早從印度沙漠的灌木根部分離獲得的根部內(nèi)生真菌，其具有廣泛的寄主范圍，能夠定殖于植物的根部細(xì)胞，進(jìn)而促進(jìn)植物的生長以及抗逆性；同時(shí)，印度梨形孢對(duì)植物根部的定殖還可增強(qiáng)寄主植物的誘導(dǎo)系統(tǒng)抗性，從而有效抵御葉部病原菌對(duì)寄主植物的侵染[9-10]。

不同的耕作模式會(huì)形成不同的土壤環(huán)境，影響土壤微生物的數(shù)量與結(jié)構(gòu)，進(jìn)而影響地上植物的生長發(fā)育。土壤微生物是維持土壤肥力的重要組成部分，也是土壤物質(zhì)循環(huán)的主要推動(dòng)者。同時(shí)，土壤環(huán)境的變化，例如作物類型、施肥、灌溉、覆蓋及種植模式等因素的變化，會(huì)對(duì)土壤微生物的數(shù)量和結(jié)構(gòu)產(chǎn)生顯著影響，進(jìn)而影響土壤養(yǎng)分的轉(zhuǎn)化與釋放[11]。通過玉米-大豆間作[12]、大豆連作[13]、小麥-豌豆輪作[14]等不同的耕作模式的研究表明，不同的耕作模式會(huì)影響土壤微生物的數(shù)量與分布，從而影響土壤肥力與植物的生長。一個(gè)典型的關(guān)于太子參耕作模式對(duì)于土壤微生物影響的研究表明[15]，連作導(dǎo)致太子參根際土壤細(xì)菌和好氣性自生固氮菌數(shù)量極顯著下降，相反，真菌、放線菌、厭氣性纖維素分解菌數(shù)量極顯著增加，而硝化細(xì)菌數(shù)量變化不顯著；與太子參-水稻輪作的土壤相比，太子參連作的土壤細(xì)菌種(屬)略有減少，其中致病菌和病原菌種(屬)增多，并出現(xiàn)一些具有拮抗功能的鏈霉菌屬(種)；真菌種(屬)則表現(xiàn)出上升的趨勢(shì)，然而，不同的耕作模式是否直接或間接地影響植物根內(nèi)微生物的多樣性特征及群落組成尚有待深入研究。

馬鈴薯(SolanumtuberosumL.)屬茄科1a生草本植物，是繼水稻、小麥、玉米之后的第四大主糧作物。而我國近年來種植面積600萬 hm2左右，占世界的近1/3，在農(nóng)村經(jīng)濟(jì)發(fā)展中發(fā)揮越來越重要的作用。西北地區(qū)為我國馬鈴薯主產(chǎn)區(qū)，然而該地區(qū)普遍缺水少肥，生產(chǎn)條件差，病蟲害發(fā)生嚴(yán)重，平均單產(chǎn)僅為15000kg/hm2，只有發(fā)達(dá)國家的1/3，使得糧食生產(chǎn)特別是薯類生產(chǎn)處于緊平衡狀態(tài)。因此，馬鈴薯產(chǎn)業(yè)可持續(xù)發(fā)展和農(nóng)民脫貧致富能力受到嚴(yán)重制約。目前，關(guān)于馬鈴薯的研究主要集中在馬鈴薯抗病基因挖掘和病原菌效應(yīng)蛋白-靶標(biāo)蛋白互作等機(jī)理的解析[16]，而不同耕作模式下的根系微生物多樣性特征及其如何影響和調(diào)控馬鈴薯的生長和抗逆性尚不明確。

本研究選取甘肅省天水馬鈴薯-小麥輪作模式為典型代表，以馬鈴薯-小麥輪作田塊的土壤特性和不同生長發(fā)育期的根內(nèi)微生物群落作為試驗(yàn)組，以馬鈴薯單一連作田塊的土壤特性和馬鈴薯不同生長發(fā)育期的根內(nèi)微生物群落為對(duì)照組，借助高通量測(cè)序技術(shù)比較分析不同耕作模式下，馬鈴薯主栽品種‘天薯11號(hào)’的根內(nèi)微生物多樣性特征，并進(jìn)一步明確不同耕作模式下的馬鈴薯根內(nèi)核心菌群，為推進(jìn)西北旱區(qū)馬鈴薯的綠色高效生產(chǎn)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材 料

試驗(yàn)在國家馬鈴薯產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系天水綜合試驗(yàn)站的馬鈴薯育種田和繁種田進(jìn)行，選取具有代表性的耕作模式地塊，分別于2018年7月和8月在馬鈴薯生長期和塊莖膨大期進(jìn)行了田塊土和馬鈴薯根樣品的采集，采樣地塊分別為：連作3 a的馬鈴薯地塊和“馬鈴薯-小麥”輪作5 a的馬鈴薯地塊。

馬鈴薯品種為‘天薯11號(hào)’，樣品縮寫如下：GCB表示連作種植馬鈴薯地塊，生長期根樣品；GRB表示輪作種植馬鈴薯地塊，生長期根樣品；GCC表示連作種植馬鈴薯地塊，塊莖膨大期根樣品；GRC表示輪作種植馬鈴薯地塊，塊莖膨大期根樣品。

1.2 方 法

1.2.1 采樣方法 依據(jù)5點(diǎn)取樣法分別在兩個(gè)地塊各取5個(gè)樣方作為生物學(xué)重復(fù)，每個(gè)樣方中依據(jù)“S”型采樣法取地下10～15 cm土壤，10個(gè)點(diǎn)混合在一起作為1個(gè)樣方，即為田塊土的1個(gè)生物學(xué)重復(fù)；在每個(gè)樣方中隨機(jī)選取 3～4株馬鈴薯植株連根拔起，輕輕抖落掉根上的大塊土壤，將根剪下放進(jìn)無菌塑封袋，用冰盒將土壤和根樣品運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室，根樣品保存至-80 ℃以待后續(xù) 測(cè)序。

田塊土壤一部分用于土壤含水量的測(cè)定，另一部分用于其他性質(zhì)的檢測(cè)。室溫風(fēng)干一周，研磨后分別過1 mm和0.15 mm篩，依據(jù)四分法裝于50 mL的離心管中，每個(gè)樣品裝兩管，一管備用，室溫保存。

1.2.2 理化性質(zhì)測(cè)定方法 土壤含水量的測(cè)定(烘干法)：將采回的土壤捏碎混勻后，稱20 g左右(精確至0.01 g)鮮土樣放入稱量好的鋁盒中，做好標(biāo)記，在105 ℃的高溫烘箱中干燥24 h，取出樣品，待鋁盒放涼后稱量鋁盒和土樣干質(zhì)量，用土樣鮮質(zhì)量和干質(zhì)量之差來計(jì)算水分含量。計(jì)算公式為：土壤水分含量=[(鮮土樣質(zhì)量+鋁盒質(zhì) 量)-(烘干土質(zhì)量+鋁盒質(zhì)量)] /[(烘干土質(zhì) 量+鋁盒質(zhì)量 g)-(鋁盒質(zhì)量 g)]× 100%。

土壤pH的測(cè)定：①試劑準(zhǔn)備。無CO2去離子水，將去離子水煮沸10 min去除CO2，冷卻時(shí)用保鮮膜封住燒杯口，隔絕空氣。②測(cè)定方法。稱取過1 mm孔徑篩的風(fēng)干土8.0 g于小燒杯中，加入20 mL的事先準(zhǔn)備好的無CO2去離子水，置于磁力攪拌器上攪拌1 min，使土粒充分分散，放置30 min后用pH計(jì)測(cè)定土壤pH。

土壤有機(jī)質(zhì)測(cè)定(國標(biāo)法)：①儀器設(shè)備。萬分之一天平、鐵絲籠、油浴鍋、滴定劑、移液槍。②所需試劑。0.8 mol/L K2Cr2O7標(biāo)準(zhǔn)溶液：稱取130 ℃烘干的K2Cr2O7(GB642-77，分析純) 39.224 5 g溶于蒸餾水中，定容至1 000 mL，貯于試劑瓶中，備用；H2SO4：濃硫酸(H2SO4，GB625-77，分析純)；0.2 mol/L FeSO4溶液：稱取硫酸亞鐵(FeSO4·7H2O，GB664-77，分析純)56.0 g溶于蒸餾水中，加5 mL H2SO4，水稀釋至1 000 mL；鄰菲羅啉指示劑：稱取鄰菲羅啉(GB1293-77，分析純)1.485 g和FeSO4·7H2O 0.695 g，溶于100 mL蒸餾水中，貯于棕色滴瓶中，備用；SiO2：二氧化硅(SiO2，Q/HG22-562-76，分析純)。③測(cè)定方法。用分析天平準(zhǔn)確稱取過0.15 mm篩孔的土樣0.3～0.5 g(精確到 0.000 1)，放入干燥的硬質(zhì)試管中(應(yīng)直接倒入試管底部避免粘在管壁上)。用移液槍加入0.8 mol/L K2Cr2O7標(biāo)準(zhǔn)溶液5 mL，輕輕搖動(dòng)試管，使試管內(nèi)土樣分散。再沿管壁緩慢加入濃H2SO45 mL，充分搖勻；把試管插入鐵絲籠中并放入預(yù)先加熱至185～190 ℃的油浴鍋中，此時(shí)油溫下降至170～180 ℃，保持此溫度。當(dāng)試管內(nèi)容物開始沸騰產(chǎn)生氣泡時(shí)，計(jì)時(shí)煮沸5 min(溫度和時(shí)間對(duì)測(cè)定結(jié)果影響較大，應(yīng)準(zhǔn)確計(jì)時(shí))，取出試管，稍冷卻后擦凈管外油液；將試管內(nèi)容物用蒸餾水洗入三角瓶中，瓶內(nèi)總體積不要超過60～70 mL，加入2～3滴鄰菲羅啉指示劑，用0.2 mol/L FeSO4溶液滴定，溶液顏色由橙黃變綠再突變到棕紅色即為終點(diǎn)，記錄FeSO4滴定的體積(V)；每一批(即上述每鐵絲籠或鋁塊中)樣品測(cè)定的同時(shí)，進(jìn)行兩個(gè)空白試驗(yàn)，即取0.500 g粉狀SiO2代替土樣，其他步驟與試樣測(cè)定相同。記錄FeSO4滴定的體積(V0)取其平均值。計(jì)算方法為：土壤有機(jī)質(zhì)(g/kg)=[(c×5/V0)×(V0-V)×10-3×3.0×1.1×1.724]×1 000/(M×k)，式中：c=0.8 mol/L,為K2Cr2O7標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度；5表示重鉻酸鉀標(biāo)準(zhǔn)溶液加入5 mL；V0為空白滴定用去FeSO4的體積(mL)；V為樣品滴定用去FeSO4的體積(mL)；3.0表示1/4碳原子的摩爾質(zhì)量為3.0 g/mol； 1.1為氧化校正系數(shù)；M為風(fēng)干土樣質(zhì)量(g)；k為將風(fēng)干土樣換算成烘干土的系數(shù)；10-3表示將mL換算為L時(shí)的進(jìn)率。

土壤全氮、磷、鉀的測(cè)定：①儀器設(shè)備。萬分之一天平、消煮管、消煮管架、渦旋振蕩儀。②所需試劑有濃硫酸和過氧化氫。③土樣消煮。稱樣及加酸：稱取磨好的0.15 mm土樣0.499 1～ 0.500 9 g(精確至0.000 1 g)于100 mL消煮管中，加入5 mL濃硫酸，在渦旋振蕩器上震蕩搖勻，過夜放置，以提高消煮速度和效果。消煮：當(dāng)消煮爐升溫到375 ℃后開始加熱消煮，加熱3～ 4 h至土樣為灰白色。具體操作方法為：給消煮管中加入少許過氧化氫，待爐溫升至375 ℃時(shí)，加入過氧化氫適量，搖勻；之后，每隔30 min加入1次過氧化氫催化劑，直至土壤消煮溶液變?yōu)榛野咨６ㄈ蒉D(zhuǎn)移：待消煮管溫度稍冷卻后，可先加入少量的ddH2O，此后依次增多，但不能超過100 mL；將上述溶液搖勻，轉(zhuǎn)移至新的100 mL容量瓶，加入ddH2O定容至100 mL；將上述溶液充分搖勻，可上下顛倒混勻；將上述定容好的溶液依次過濾至50 mL的離心管中(需待消煮液完全冷卻至室溫后再定容，將消煮好的樣品在4 ℃下保存?zhèn)溆?。④測(cè)定。全氮和全磷用高分辨自動(dòng)化學(xué)分析儀測(cè)定，全鉀用火焰光度計(jì)測(cè)定。全氮含量 (g/kg)=(機(jī)測(cè)值-空白值)×10-3×100×10-3/(m×10-3)，機(jī)測(cè)值和空白值的單位為 mg/L，10-3為mL與L間的換算進(jìn)率，m為稱量樣品的質(zhì)量。全鉀、全磷計(jì)算公式和全氮計(jì)算公式一致。

土壤速效氮的測(cè)定：①準(zhǔn)備工作：在浸提前計(jì)算好所需濾紙和KCl的試劑用量，并配置好1 mol/L 的KCl浸提液，備用。將所需的震蕩瓶提前用自來水和去離子水洗干凈、晾干，做好標(biāo)記，備用。②浸提：采回的新鮮土樣捏碎、充分混勻(難以捏碎的干土樣應(yīng)過1 mm篩)后，稱取5 g新鮮土壤，加入1 mol/L 的KCl溶液50 ml(土液比1∶10)，在120 r/min下震蕩60 min，取出過濾，裝入50 mL平底離心管中，蓋緊瓶蓋(一起震蕩的每批樣品應(yīng)包括3個(gè)空白作對(duì)照和1個(gè)標(biāo)準(zhǔn)土樣的2個(gè)重復(fù)。若浸提液不能及時(shí)測(cè)定，應(yīng)及時(shí)放入4 ℃冰箱冷藏，最好不超過兩周)。③測(cè)定：用高分辨自動(dòng)化學(xué)分析儀測(cè)定硝銨態(tài)氮含量，計(jì)算前將每一批的測(cè)定值減去同一批的空白平均值，土壤硝銨態(tài)氮的計(jì)算公式為：土壤硝銨態(tài)氮含量(mg/kg)=浸提液硝銨態(tài)氮含量×浸提液體積/[土壤稱樣質(zhì)量/(1+土壤含水量)]，式中浸提液硝銨態(tài)氮含量單位為μg/mL，浸提液體積單位為mL，土壤稱樣質(zhì)量單位為g，土壤含水量單位為%。

土壤速效磷的測(cè)定：①準(zhǔn)備工作。在浸提之前計(jì)算好所需的無磷定量濾紙和NaHCO3試劑用量，并配置0.5 mol/L的NaHCO3浸提液備用，如上準(zhǔn)備所需震蕩瓶。②浸提。稱取過 1 mm篩子的風(fēng)干土樣2.5 g于震蕩瓶中，再加入 1 g無磷活性炭粉，加入50 mL的0.5 mol/L的NaHCO3浸提液(水土比20∶1)，擰緊瓶蓋，室溫25 ℃、120 r/min震蕩30 min，取下靜置30 min后過濾，濾液放于50 mL平底離心管中(由于溫度對(duì)土壤有效磷的浸提影響顯著，要求土壤有效磷的稱樣、浸提均在有空調(diào)的房間進(jìn)行)。③測(cè)定。用高分辨自動(dòng)化學(xué)分析儀測(cè)定土壤速效磷的含量，計(jì)算前將每一批的測(cè)定值減去同一批的空白平均值，計(jì)算公式為：土壤速效磷含量 (mg/kg)=(浸提液速效磷含量×浸提液體積)/風(fēng)干土壤稱樣質(zhì)量，式中浸提液速效磷含量單位為 μg/mL，浸提液體積單位為mL，風(fēng)干土壤稱樣質(zhì)量單位為g。

土壤速效鉀的測(cè)定：①準(zhǔn)備工作。計(jì)算好所需的濾紙和NH4OAc試劑用量，并配置足量的 1 mol/L的NH4OAc浸提液，將所需的震蕩瓶提前用自來水和蒸餾水洗干凈，晾干，備用。②浸提。稱取過1 mm篩子的風(fēng)干土樣5.00 g，倒入震蕩瓶中，加入50 mL的1 mol/L的NH4OAc浸提液(水土比10∶1)，擰緊瓶蓋，放于振蕩器上，在120 r/min下震蕩30 min，取下靜置20 min后過濾，保存至50 mL的平底離心管中。③測(cè)定。用火焰光度計(jì)測(cè)定土壤速效鉀含量，計(jì)算前將每一批的測(cè)定值減去同一批的空白平均值，計(jì)算公式為： 土壤速效鉀含量(mg/kg)=(浸提液速效鉀含量×浸提液體積)/風(fēng)干土壤稱樣質(zhì)量，式中浸提液速效鉀含量單位為μg/mL，浸提液體積單位為mL，風(fēng)干土壤稱樣質(zhì)量單位為g。

1.2.3 Illumina HiSeq測(cè)序和分析方法 引物335F (5′-CADACTCCTACGGGAGGC-3′)和769R (5′-ATCCTGTTTGMTMCCCVCRC-3′)用來擴(kuò)增植物的內(nèi)生細(xì)菌；引物ITS1F (5′-TGCGTTCTTCATCGATGC-3′)和ITS1R (5′-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3′)用來擴(kuò)增真菌的ITS1高變區(qū)。利用雙末端測(cè)序(Paired-End)的方法，構(gòu)建小片段文庫，基于Illumina HiSeq測(cè)序平臺(tái)進(jìn)行測(cè)序。對(duì)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行拼接(FLASH，version 1.2.11)，將拼接得到的序列進(jìn)行質(zhì)量過濾(Trimmomatic，version 0.33)，并去除嵌合體(UCHIME，version 8.1)，進(jìn)而得到高質(zhì)量的Tags序列。在相似性97 %的水平上對(duì)序列進(jìn)行聚類(USEARCH，version 10.0)，以測(cè)序所有序列數(shù)的0.005 %作為閾值過濾OTUs(Operational Taxonomic Units)。通過細(xì)菌Silva和真菌Unite數(shù)據(jù)庫對(duì)OTUs進(jìn)行聚類分析，進(jìn)一步進(jìn)行α多樣性分析(Alpha Diversity)、β多樣性分析(Beta Diversity)和顯著物種差異分析等來挖掘樣品之間的差異。另外，將環(huán)境因子和特有的核心菌群進(jìn)行關(guān)聯(lián)性分析，解析環(huán)境因子-核心菌群之間的關(guān)系。

2 結(jié)果與分析

2.1 馬鈴薯連作與馬鈴薯-小麥輪作田塊中的馬鈴薯根內(nèi)微生物多樣性分析

稀釋性曲線結(jié)果表明，在一定范圍內(nèi)，隨著測(cè)序條數(shù)的加大，曲線趨于平緩，樣品序列充分，足以反映樣品的物種多樣性，可以進(jìn)行后續(xù)的數(shù)據(jù)分析(圖1)。Alpha多樣性是對(duì)樣本內(nèi)多樣性或物種豐度的評(píng)估，可通過Chao1、Ace、Shannon和Simpson等指標(biāo)進(jìn)行衡量，其中，Chao1和Ace指數(shù)用于衡量物種豐度，即物種數(shù)量的多少。Shannon和Simpson指數(shù)用于衡量物種多樣性，受樣品群落中物種豐度和物種均勻度的影響。Shannon指數(shù)值越大，Simpson指數(shù)值越小，說明樣品的物種多樣性越高。本試驗(yàn)依據(jù)Ace和inverse Simpson指數(shù)來衡量物種豐度和多樣性(圖2)，Ace指數(shù)表明：輪作地塊的馬鈴薯根內(nèi)微生物(細(xì)菌和真菌)豐度高于連作地塊但不顯著；處于馬鈴薯生長期的根內(nèi)細(xì)菌豐度顯著高于馬鈴薯塊莖膨大期的根內(nèi)細(xì)菌豐度(圖2-a)，而處于馬鈴薯塊莖膨大期的根內(nèi)真菌豐度相比較馬鈴薯生長期雖有下降但不明顯(圖2-b)。inverse Simpson指數(shù)表明：輪作地塊的根內(nèi)細(xì)菌多樣性大于連作地塊，并且處于馬鈴薯生長期的根內(nèi)細(xì)菌多樣性大于馬鈴薯塊莖膨大期的根內(nèi)細(xì)菌多樣性，但是都不顯著(圖2-c)；輪作地塊和連作地塊的根內(nèi)真菌多樣性無顯著差異，但處于馬鈴薯塊莖膨大期的輪作地塊中，根內(nèi)真菌多樣性呈上升趨勢(shì)(圖2-d)。用binary jaccard算法來比較不同耕作模式下的根內(nèi)微生物beta多樣性，結(jié)果表明：不同耕作模式下的馬鈴薯處于不同生長發(fā)育期時(shí)，其根內(nèi)微生物多樣性具有顯著差異(圖3)。

每條曲線代表1個(gè)樣本，用不同的顏色標(biāo)記。a和b分別為細(xì)菌和真菌樣品稀釋性曲線

a和c分別為細(xì)菌Ace指數(shù)和inverse Simpson指數(shù)分析結(jié)果；b和d分別為真菌Ace指數(shù)和inverse Simpson指數(shù)分析結(jié)果；*.表示兩地塊的樣品差異顯著(P<0.05)

a和b分別為根樣品細(xì)菌和真菌Beta多樣性

2.2 馬鈴薯連作與馬鈴薯-小麥輪作田塊中的馬鈴薯根內(nèi)微生物群落組成分析

為了進(jìn)一步揭示耕作模式對(duì)馬鈴薯根內(nèi)微生物群落組成的影響，對(duì)馬鈴薯根內(nèi)的微生物OTUs進(jìn)行物種豐度的比較分析(門水平前10；綱水平前15；科水平前20；屬水平前20)(圖4，表1，表2)。細(xì)菌豐度分析結(jié)果顯示，無論是輪作還是連作種植馬鈴薯地塊，Proteobacteria是細(xì)菌門水平上豐度最高、占絕對(duì)優(yōu)勢(shì)的一類，處于馬鈴薯生長期時(shí)，輪作地塊和連作地塊的根內(nèi)Proteobacteria豐度基本一致(66.2% / 65.8%)，而到馬鈴薯塊莖膨大期時(shí)，輪作地塊的根內(nèi)Proteobacteria豐度明顯上升(66.2%→72.0%)，連作地塊雖有上升但不明顯(67.1%)；此外，Actinobacteria和Bacteroidetes的豐度也占有優(yōu)勢(shì)(圖4-a)。Gammaproteobacteria、Alphaproteobacteria和Actinobacteria是兩個(gè)地塊綱水平上占優(yōu)勢(shì)的一類，從馬鈴薯生長期到塊莖膨大期，根內(nèi)Gammaproteobacteria的豐度水平在輪作地塊中表現(xiàn)為上升趨勢(shì)(31.1%→35.5%)，而在連作地塊中表現(xiàn)為下降趨勢(shì)(32.0%→27.8%)；根內(nèi)Alphaproteobacteria的豐度水平在輪作和連作地塊均表現(xiàn)為上升趨勢(shì)；根內(nèi)Actinobacteria的豐度水平在輪作地塊表現(xiàn)為下降趨勢(shì) (17.4%→14.9%)，而在連作地塊表現(xiàn)為上升趨勢(shì) (17.7%→22.9%)(圖4-c)。Burkholderiaceae、 Rhizobiaceae、 Sphingomonadaceae、 Streptomycetaceae和Pseudonocardiaceae是兩個(gè)地塊科水平上占優(yōu)勢(shì)的一類，從馬鈴薯生長期到塊莖膨大期，根內(nèi)Burkholderiaceae的豐度水平在輪作地塊無明顯變化，而在連作地塊表現(xiàn)為下降趨勢(shì)(15.00%→12.8%)；根內(nèi)Rhizobiaceae的豐度水平在兩地塊均上升，且在連作地塊中的豐度略高于輪作地塊；根內(nèi)Sphingomonadaceae的豐度水平在兩地塊均表現(xiàn)為下降趨勢(shì)，且在連作地塊中的豐度水平高于輪作地塊；根內(nèi)Streptomycetaceae的豐度水平在輪作地塊變化不明顯 (4.90%→4.60%)，而在連作地塊呈較高水平 (6.80%→8.6%)；根內(nèi)Pseudonocardiaceae的豐度水平在輪作地塊表現(xiàn)為下降趨勢(shì)(5.40%→ 4.20%)，而在連作地塊表現(xiàn)為上升趨勢(shì)(5.90%→ 8.70%)(表1)。Rhizobium、Streptomyces、Lechevalieria、Sphingomonas和Methylotenera是兩個(gè)地塊屬水平上占優(yōu)勢(shì)的一類，從馬鈴薯生長期到塊莖膨大期，根內(nèi)Rhizobium的豐度水平在兩地塊均明顯上升，且輪作地塊的上升幅度大于連作地塊；根內(nèi)Streptomyces的豐度水平在輪作地塊變化不明顯，而在連作地塊表現(xiàn)為上升趨勢(shì) (6.80%→ 8.6%)；根內(nèi)Lechevalieria的豐度水平在輪作地塊表現(xiàn)為下降趨勢(shì)(4.80%→ 3.30%)，而在連作地塊呈上升趨勢(shì)(5.30%→ 7.60%)；根內(nèi)Sphingomonas的豐度水平在兩地塊均表現(xiàn)為下降趨勢(shì)，且在連作地塊中的下降幅度高于輪作地塊；根內(nèi)Methylotenera的豐度水平在兩地塊變化不明顯，但在輪作地塊中的水平顯著高于連作地塊(表1)。

a和b分別代表細(xì)菌和真菌門水平上排列前10的門； c和d分別代表細(xì)菌和真菌綱水平上排列前15的物種

表1 細(xì)菌科水平和屬水平上排列前20的物種Table 1 Top twenty bacteria species in the family and genus levels

真菌豐度分析結(jié)果表明，Ascomycota和Basidiomycota是兩地塊門水平上占優(yōu)勢(shì)的一類，從馬鈴薯生長期到塊莖膨大期，根內(nèi)Ascomycota的豐度水平在兩地塊中均上升，且在輪作地塊中的上升幅度顯著高于連作地塊(輪作：39.10%→90.46%；連作：43.32%→71.52%)；而根內(nèi)Basidiomycota的豐度水平在兩地塊中均表現(xiàn)為下降趨勢(shì)，且在輪作地塊中的下降幅度顯著高于連作地塊(輪作：59.76%→7.14%；連作55.42%→24.72%)(圖4-b)。Sordariomycetes和Agaricomycetes是兩地塊綱水平上占優(yōu)勢(shì)的一類，從馬鈴薯生長期到塊莖膨大期，根內(nèi)Sordariomycetes的豐度水平在兩地塊中均表現(xiàn)為上升趨勢(shì)，且在連作地塊中的水平高于輪作地塊；根內(nèi)Agaricomycetes的豐度水平在兩地塊中均呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，且在輪作地塊中的下降幅度顯著高于連作地塊(圖4-d)。Plectosphaerellaceae和Ceratobasidiaceae是兩地塊科水平上占優(yōu)勢(shì)的一類，從馬鈴薯生長期到塊莖膨大期，根內(nèi)Plectosphaerellaceae的豐度水平在兩地塊中表現(xiàn)為顯著上升趨勢(shì)(輪作：21.0%→48.7%；連作：33.7%→60.8%)，且在連作地塊中的水平顯著高于輪作地塊(輪作：48.7%；連作60.8%)；根內(nèi)Ceratobasidiaceae的豐度水平在兩地塊中均表現(xiàn)為顯著下降趨勢(shì)(輪作：59.1%→5.9%；連作：53.4%→19.8%)，且在輪作地塊中的下降幅度顯著高于連作地塊(輪作：53.2%；連作：33.6%)(表2)。Plectosphaerella是兩地塊屬水平上具有顯著優(yōu)勢(shì)的一類，從馬鈴薯的生長期到塊莖膨大期，其豐度水平在兩地塊中均表現(xiàn)為顯著上升趨勢(shì)，且在連作地塊中的水平明顯高于輪作地塊(表2)。

綜上可以得出，從馬鈴薯生長期到塊莖膨大期，連作和輪作模式下的根內(nèi)微生物組成和豐度水平具有顯著差異。

表2 真菌科水平和屬水平上排列前20的物種Table 2 Top twenty fungi species in family and genus levels

2.3 馬鈴薯連作與馬鈴薯-小麥輪作田塊中的馬鈴薯根內(nèi)微生物群落組成差異分析

利用de-seq對(duì)處于馬鈴薯生長期和塊莖膨大期的連作與輪作地塊的根內(nèi)微生物群落進(jìn)行差異比較分析(同一采樣時(shí)期不同耕作模式下的比較)(表3，表4)。處于馬鈴薯生長期的輪作地塊根內(nèi)細(xì)菌含量增加的OTUs(log2差異倍數(shù)>0)有190個(gè)，其中豐度提高且達(dá)到極顯著差異(log2差異倍數(shù)>2，F(xiàn)DR adjustedPvalue<0.01)的細(xì)菌有Clostridium、 o-211ds20、Terrisporobacter和Nocardioides；而處于馬鈴薯生長期的連作地塊根內(nèi)細(xì)菌含量增加的OTUs(log2差異倍數(shù)>0)有221個(gè)，其中豐度提高且達(dá)到極顯著差異(log2差異倍數(shù)>2，F(xiàn)DR adjustedPvalue< 0.01)的細(xì)菌有Chitinophaga、Luteimonas、Niastella、Micromonosporaceae、Chryseobacterium、Falsirhodobacter、Pedobacter、Flavobacterium、Pseudonocardia、Nocardioides、Taibaiella、Actinophytocola、Phaselicystis、Pseudoflavitalea、Pseudomonas、Rhizorhapis和Ellin6067。處于馬鈴薯塊莖膨大期的輪作地塊根內(nèi)細(xì)菌含量增加的OTUs(log2差異倍數(shù)>0)有231個(gè)，其中豐度提高且達(dá)到極顯著差異(log2差異倍數(shù)>2，F(xiàn)DR adjustedPvalue< 0.01)的細(xì)菌有Azospirillales、Pelomonas、Methylobacillus、Uliginosibacterium、Flavobacterium、Microvirga、Lachnoclostridium、Clostridium、Thermoleophilia、Emticicia、 Colwelliaceae、Terrisporobacter、Cytophaga、Nocardioides、Methylophilus和Asticcacaulis；而處于馬鈴薯塊莖膨大期的連作地塊根內(nèi)細(xì)菌含量增加的OTUs(log2差異倍數(shù)>0)有176個(gè)，其中豐度提高且達(dá)到極顯著差異(log2差異倍數(shù)>2，F(xiàn)DR adjustedPvalue< 0.01)的細(xì)菌有Micromonosporaceae、Nonomuraea、Phreatobacter、Mycobacterium、Pseudonocardia、Nocardioides、Actinomadura、Chitinophaga、Phaselicystis、Rhizorhapis、Inquilinus和Lysobacter(表3)。

表3 細(xì)菌de-seq分析結(jié)果Table 3 Results of bacteria de-seq analysis

處于馬鈴薯生長期的輪作地塊根內(nèi)真菌含量增加的OTUs(log2差異倍數(shù)>0)有155個(gè)，其中豐度顯著提高且達(dá)到極顯著差異(log2差異倍 數(shù)>8，F(xiàn)DR adjustedPvalue<0.01)的真菌有Colletotrichum和Boeremia；而處于馬鈴薯生長期連作地塊根內(nèi)真菌含量增加的OTUs(log2差異倍數(shù)>0)有201個(gè)，其中豐度顯著提高且達(dá)到極顯著差異(log2差異倍數(shù)>8，F(xiàn)DR adjustedPvalue< 0.01)的真菌有Sclerotiniaceae、Ascobolaceae、Colletotrichum、Coprinellus、Xylariaceae、Spizellomycetales、Humicola、Gibberella、GS16和Lasiosphaeriaceae。處于馬鈴薯塊莖膨大期的輪作地塊根內(nèi)真菌含量增加的OTUs(log2差異倍數(shù)>0)有57個(gè)，其中豐度顯著提高且達(dá)到極顯著差異(log2差異倍數(shù)>8，F(xiàn)DR adjustedPvalue<0.01)的真菌有Didymella、Colletotrichum、Boeremia、Plectosphaerellaceae和Verticillium(表4)；而處于馬鈴薯塊莖膨大期的連作地塊根內(nèi)真菌含量增加的OTUs(log2差異倍 數(shù)>0)有211個(gè)，其中豐度顯著提高且達(dá)到極顯著差異(log2差異倍數(shù)>8，F(xiàn)DR adjustedPvalue<0.01)的真菌有Colletotrichum、Humicola、 Chaetomiaceae、Gibberella、 Lasiosphaeriaceae、Naganishia和Sordariales(表4)。

表4 真菌de-seq分析結(jié)果Table 4 Results of fungal de-seq analysis

2.4 環(huán)境因子對(duì)馬鈴薯根內(nèi)微生物群落的影響

土壤有機(jī)質(zhì)含量、硝銨態(tài)氮、速效磷和速效鉀含量在馬鈴薯處于生長期和塊莖膨大期的連作與輪作田塊土壤中均無顯著差異(P>0.05)。相比之下，土壤總鉀、磷含量在馬鈴薯生長期和塊莖膨大期有顯著差異；而總氮含量則在連作與輪作田塊土壤中有顯著差異；土壤酸堿度和含水量則因耕作模式差異和馬鈴薯的生長期及塊莖膨大期而有顯著差異。土壤酸堿度從馬鈴薯生長期到塊莖膨大期顯著增加且輪作地塊顯著高于連作地塊，而土壤含水量從馬鈴薯生長期到塊莖膨大期顯著下降(表5)。

通過RDA(Redundancy analysis)解析馬鈴薯根內(nèi)微生物群落與環(huán)境因子之間的相關(guān)性(圖5)，結(jié)果表明，處于馬鈴薯生長期的連作與輪作地塊中的根內(nèi)細(xì)菌微生物群落主要受到土壤含水量、速效磷和有機(jī)質(zhì)等因素的影響；其中，根內(nèi)細(xì)菌微生物群落在連作地塊中主要受到土壤含水量的顯著影響，而在輪作地塊受到土壤含水量、速效磷和有機(jī)質(zhì)的顯著影響。處于馬鈴薯塊莖膨大期的連作和輪作地塊中的根內(nèi)細(xì)菌微生物群落主要受到土壤pH、銨態(tài)氮、有機(jī)質(zhì)和總氮等因素的影響；其中，根內(nèi)細(xì)菌微生物群落在連作地塊中主要受到土壤銨態(tài)氮的顯著影響，而在輪作地塊中受到土壤pH、總氮和有機(jī)質(zhì)等的共同影響(圖5-a)。相比之下，處于馬鈴薯生長期和塊莖膨大期的根內(nèi)真菌微生物群落主要受到土壤有機(jī)質(zhì)、總氮含量和pH等因素的影響(圖5-b)。

表5 土壤理化性質(zhì)差異性分析結(jié)果Table 5 Result of difference analysis of soil physicochemical properties

橫縱坐標(biāo)上的刻度為每個(gè)樣品與環(huán)境因子進(jìn)行回歸分析計(jì)算時(shí)產(chǎn)生的值；點(diǎn)代表樣品，字體表示環(huán)境因子，箭頭代表不同的環(huán)境因子；a和b分別代表根樣品中細(xì)菌和真菌微生物與環(huán)境因子的關(guān)聯(lián)性分析 結(jié)果

3 討論與結(jié)論

根際是植物根系與微生物相互作用的土壤生物活性區(qū)，對(duì)植物的生長發(fā)育、養(yǎng)分循環(huán)和生態(tài)系統(tǒng)功能具有重要意義[15]。研究表明，植物根際土壤和根內(nèi)微生物群落的組成主要受到植物基因型和土壤環(huán)境因子的影響[17-22]。然而，耕作模式對(duì)作物根內(nèi)微生物群落的影響機(jī)制尚不明確，尤其是針對(duì)西北旱區(qū)的典型耕作模式影響馬鈴薯根際微生態(tài)的機(jī)制研究亟需深入。在本研究中，重點(diǎn)比較分析甘肅天水馬鈴薯主栽品種‘天薯11號(hào)’在典型連作與輪作栽培模式下，其根內(nèi)微生物多樣性及群落組成的特征，并探究環(huán)境因子對(duì)馬鈴薯根內(nèi)微生物多樣性及群落組成的影響。結(jié)果表明，耕作模式能夠影響馬鈴薯根內(nèi)微生物多樣性及微生物群落的結(jié)構(gòu)組成(圖2，圖3)。通過馬鈴薯根內(nèi)微生物群落的豐度變化分析，結(jié)果表明Proteobacteria和Ascomycota是馬鈴薯根內(nèi)豐度水平最高且占絕對(duì)優(yōu)勢(shì)的一類菌群(圖4-a，圖4-b)。此外，有研究表明，Ascomycota在種植擬南芥的土壤和擬南芥根內(nèi)占優(yōu)勢(shì)[21]，而本研究發(fā)現(xiàn)Basidiomycota在處于馬鈴薯生長期的根內(nèi)占優(yōu)勢(shì)，而Ascomycota則在馬鈴薯塊莖膨大期的根內(nèi)占絕對(duì)優(yōu)勢(shì)(圖4-b)。同時(shí)，門水平(圖4-a，圖4-b)、綱水平(圖4-c，圖4-d)、科水平(表1，表2)、屬水平(表3)上的物種豐度以及不同耕作模式下的de-seq差異性分析結(jié)果表明，馬鈴薯根內(nèi)微生物的豐度水平及群落組成在不同耕作模式之間以及馬鈴薯不同生長發(fā)育時(shí)期具有明顯差異。據(jù)此，本研究得出：根內(nèi)微生物群落組成和豐度差異可能因?yàn)橹参锓N類、耕作模式和植物生長發(fā)育時(shí)期的不同而有差異。

研究表明，Pseudomonadaceae是對(duì)植物多方面有益(解磷、固氮、合成細(xì)胞分裂素、植物激素吲哚乙酸和赤霉素)且能促進(jìn)植物生長的細(xì)菌[23]；Rhizobiaceae具有抗真菌、促進(jìn)植物生長、解磷和固氮的特性[24]；Bacteroidetes中的Chitinophaga和Flavobacterium能夠抑制病原菌的生長[25]，并且Flavobacterium能夠抑制致病疫霉菌的生長[25]；Mortierella和Trichoderma是能夠抑制疫霉菌生長的有益真菌[25]，其中Trichoderma已作為生防菌對(duì)作物病原真菌和卵菌進(jìn)行生物防治[26-27]。本研究表明，在馬鈴薯生長期，根內(nèi)Pseudomonadaceae在連作地塊中的豐度水平 (1.6%)顯著高于輪作地塊(0.2%)；而到馬鈴薯塊莖膨大期時(shí)，其在輪作地塊中的豐度水平明顯上升(1.3%)，而在連作地塊中有所下降(1.0%) (表1)。根內(nèi)Rhizobiaceae的豐度水平從馬鈴薯生長期到塊莖膨大期呈顯著上升；在馬鈴薯塊莖膨大期時(shí)，根內(nèi)Bacteroidetes在輪作地塊中的豐度水平從8.01%上升到8.57%，而在連作地塊中從10.06%下降為6.16%；Mortierella和Flavobacterium在輪作地塊中的豐度水平高于連作地塊。綜上，相比連作地塊，處于馬鈴薯塊莖膨大期的輪作地塊中具有豐度水平更高的有益微生物菌群。由此推斷：輪作模式下形成的馬鈴薯根內(nèi)微生物群落更有利于馬鈴薯的生長、抗逆能力的提高以及耕地地力的提升。

之前的研究表明，植物通過根系分泌物對(duì)其周圍的微生物具有強(qiáng)烈影響，然而，土壤類型或者寄主植物的選擇是否為根際和根內(nèi)微生物區(qū)系組成的主要因素目前還不清楚[28]。在本研究中，土壤組分和馬鈴薯品種是相同的，只有耕作模式存在差異，根據(jù)環(huán)境因子與微生物的關(guān)聯(lián)性分析結(jié)果，環(huán)境因子(尤其是土壤含水量、pH和銨態(tài)氮含量)對(duì)微生物的群落組成具有顯著影響(表5，圖5)。

本研究聚焦西北旱區(qū)馬鈴薯綠色生產(chǎn)這一關(guān)鍵科學(xué)問題，通過解析甘肅天水典型耕作模式下(馬鈴薯-小麥輪作地塊、馬鈴薯連作地塊)的馬鈴薯主栽品種‘天薯11’根內(nèi)微生物多樣性及微生物群落組成特征，并結(jié)合環(huán)境因子進(jìn)行相關(guān)性分析，揭示耕作模式對(duì)馬鈴薯根內(nèi)微生物多樣性、以及微生物群落組成與結(jié)構(gòu)特征的影響，并明確環(huán)境因子與馬鈴薯根內(nèi)微生物多樣性具有顯著的相關(guān)性。進(jìn)一步對(duì)輪作和連作地塊的根內(nèi)核心菌群的差異分析表明，輪作地塊中形成的根內(nèi)微生物群落更有利于馬鈴薯的生長和抗逆性，這為后續(xù)核心菌群的生物學(xué)功能研究奠定基礎(chǔ)，并為推進(jìn)西北旱區(qū)馬鈴薯的綠色高效生產(chǎn)提供理論 依據(jù)。