馬云帆，蘇曉桉，周銀曦，張慧鑫

肺癌是全球癌癥相關(guān)死亡的主要原因。肺癌高死亡率的主要原因是就診時(shí)，80%的患者已處于晚期，預(yù)后普遍較差，5年生存率約為15%[1]。非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)約占肺癌的80%以上，其中肺腺癌所占比例已超越肺鱗癌，成為發(fā)病率最高的NSCLC[2]。因此，肺腺癌的早期診斷和早期治療對改善肺癌患者的預(yù)后極其重要。目前除了低劑量螺旋CT掃描之外，還沒有更為有效的方法能夠早期發(fā)現(xiàn)肺癌，但LDCT有輻射、假陽性率高等不足之處[3]。因此，臨床中迫切需要無創(chuàng)性生物標(biāo)志物檢測可以補(bǔ)充，甚至取代LDCT進(jìn)行肺癌的篩查和早期診斷。液態(tài)活檢屬于新型無創(chuàng)性分子病理檢測方式，循環(huán)miRNA檢測是其中一種具有應(yīng)用前景的方法[4]。但外周血中的miRNA，易受RNA酶的降解，而外泌體的膜結(jié)構(gòu)可增強(qiáng)循環(huán)miRNA分子的穩(wěn)定性，具有作為疾病生物標(biāo)志物的潛力[5]。本研究根據(jù)既往研究報(bào)道，篩選miR-17-5p、miR-100-3p和miR-30a-3p三個(gè)肺腺癌血漿外泌體中表達(dá)明顯變化的miRNA作為標(biāo)志物[6-7]，在54例I期肺腺癌患者和45例健康個(gè)體中進(jìn)行外泌體miRNA驗(yàn)證分析，判斷這三個(gè)miRNA診斷早期肺腺癌的準(zhǔn)確性，以期為肺癌的早期無創(chuàng)篩查提供新的依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料

1.1.1 研究對象：選擇寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院普胸外科2017年10月-2019年10月54例I期肺腺癌手術(shù)患者(術(shù)后病理確認(rèn))和45例健康志愿者(性別與年齡匹配)，采集其外周血，提取血漿外泌體，以驗(yàn)證所選擇的miRNA診斷模板的準(zhǔn)確性。具體臨床資料見表1。本研究嚴(yán)格按照《涉及人體的生物醫(yī)學(xué)研究國際倫理指南》(CIOMS)進(jìn)行，研究方案經(jīng)過寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院醫(yī)學(xué)科研倫理審查委員會的批準(zhǔn)(2018-283)。所有志愿者均書面同意其血漿樣本、基本信息及病理信息用于本研究。

1.1.2 主要試劑與儀器：Trizol試劑(Invitrogen公司 美國)，miRNA cDNA第一鏈合成試劑盒、miRNA 熒光定量試劑盒、hsa-miR-17-5p 、hsa-miR-30a-3p、hsa-miR-100-3p和內(nèi)參U6(天根生化科技有限公司 北京)，SDS-PAGE凝膠配制試劑盒、BCA 蛋白測定試劑盒(凱基生物有限公司 南京)，β-actin抗體、CD9、CD63抗體(博奧森生物技術(shù)有限公司 北京)；H7650透射電子顯微鏡(Hitachi公司 日本)，熒光定量 PCR 儀(ABI 公司 美國)，超速冷凍離心機(jī)(Thermo Scientific公司 美國)，電泳儀和電泳槽、轉(zhuǎn)膜槽、Western blot曝光儀(Bio-Rad公司 美國)。

1.2 方法

1.2.1 血漿采集：肺腺癌患者于術(shù)前1 h 內(nèi)用真空抽血管采集全血2 mL，健康志愿者采集方法相同，加入枸櫞酸鈉抗凝血?jiǎng)o置30 min后，在離體3 h 內(nèi)完成血漿分離，保存于-80 ℃冰箱。

1.2.2 血漿外泌體提取：1 mL血漿4 ℃溶解后，用磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)1∶10稀釋后離心，在4 ℃，10 000 g下離心30 min；收集上清液，轉(zhuǎn)移至超速離心管，在超速離心機(jī)4 ℃，100 000 g離心2 h；棄去上清液，并將沉淀重懸于適量的PBS中。取少量樣品行外泌體鑒定，其余樣品于-80 ℃保存。

1.2.3 外泌體鑒定：透射電子顯微鏡鑒定外泌體的形態(tài)，即取制備好的外泌體樣品，滴于銅網(wǎng)上并靜置10 min后，以2%磷鎢酸染色10 min；在80 kV的加速電壓下用H7650透射電子顯微鏡觀察樣品的形態(tài)，AMT數(shù)碼相機(jī)拍攝透射電子顯微鏡觀察到的圖像。Western blot檢測外泌體樣本中的特異性蛋白CD9(24 kD)和CD63(53 kD)：轉(zhuǎn)膜后，取出PVDF膜，加入配置好的熒光發(fā)光劑溶液，在Western blot曝光儀中進(jìn)行曝光，采集圖像。

1.2.4 外泌體中RNA提?。簩⑻崛〉耐饷隗w沉淀重懸于適量的PBS中，再向EP管中加入200 μl氯仿，顛倒混勻數(shù)次后于室溫靜置3 min，離心。將EP管上層RNA水相轉(zhuǎn)移至新的無RNA酶EP管中，加入500 μl異丙醇，混勻后于室溫靜置10 min，離心；棄去上清液，加入1 mL DEPC水配制的75%無水乙醇，渦旋振蕩沖洗沉淀，離心；棄去上清液，干燥5 min。根據(jù)RNA沉淀大小加入50～100 μl DEPC水，吹打混勻沉淀，置于水浴鍋中55 ℃水浴10～15 min；取1 μl 制備好的RNA 進(jìn)行核酸超微量測定RNA純度和濃度，其余RNA于-80 ℃保存。

1.2.5 miR-17-5p、miR-100-3p和miR-30a-3p的qPCR引物制備：在miRBase數(shù)據(jù)庫中獲得miR-17-5p、miR-100-3p和miR-30a-3p的成熟序列，qPCR引物由北京天根生化科技有限公司制備提供。miR-17-5p:5-GTCAGAATAATGTCAAAGTGCTTACAGTGCAGGTAGTGATATGTGCATCTACTGCAGTGAAGGCACTTGTAGCATTATGGTGAC-3’；miR-100-3p:5-CCTGTTGCCACAAACCCGTAGATCCGAACTTGTGGTATTAGTCCGCACAAGCTTGTATCTATAGGTATGGTCTGTTAGG-3’；miR-30a-3p:5-GCGACTGTAAACATCCTCGACTGGAAGCTGTGAAGCCACAGATGGGCTTTCAGTCGGATGTTTGCAGCTGC-3’。

1.2.6 qPCR檢測miRNA的相對表達(dá)量：采用miRcute增強(qiáng)型miRNA cDNA第一鏈合成試劑盒操作合成cDNA，完成RNA反轉(zhuǎn)錄。采用miRcute增強(qiáng)型miRNA熒光定量檢測試劑盒進(jìn)行qPCR，檢測外泌體樣品中miR-17-5p、miR-100-3p和miR-30a-3p的相對表達(dá)量。檢測重復(fù)三次，取CT值的均值進(jìn)行最終計(jì)算。使用內(nèi)參U6進(jìn)行校準(zhǔn)，2-△CT法分析數(shù)據(jù)結(jié)果。根據(jù)相對定量公式計(jì)算檢測結(jié)果，最終計(jì)算公式：改變的倍數(shù)(fold change)= 2-△CT；△△CT =(CT靶基因-CT內(nèi)參)處理組-(CT靶基因-CT內(nèi)參)未處理組。

2 結(jié)果

2.1 早期肺腺癌組和健康對照組臨床資料比較：早期肺腺癌組患者54例，平均年齡(59.22±7.81)歲，其中原位癌11例、Stage IA 19例、Stage IB 24例；健康志愿者組48例，平均年齡(53.93±8.96)。2組間年齡、性別和吸煙史比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P>0.05)，見表1。

表1 肺腺癌患者和健康個(gè)體的臨床特征

2.2 血漿外泌體特征：根據(jù)MISEV 2018[8]，使用Western blot檢測了肺腺癌患者與健康志愿者血漿外泌體樣本中的2個(gè)標(biāo)志物：CD9和CD63。WB結(jié)果均可見到明顯的CD63和CD9條帶，見圖1a(目錄后)。透射電鏡結(jié)果表明，肺腺癌患者與健康志愿者血漿中分離出的囊泡大部分在100 nm左右，均有一個(gè)杯狀雙層膜結(jié)構(gòu)，為典型的外泌體圖像，見圖1b(目錄后)。

2.3 qPCR驗(yàn)證miR-17、miR-100和miR-30a-3p相對表達(dá)水平：肺腺癌組與健康志愿者組中miR-17-5p、miR-100-3p和miR-30a-3p的相對表達(dá)水平，見表2。分析結(jié)果顯示，肺腺癌患者組血漿外泌體中的miR-17-5p較健康志愿者組相對表達(dá)水平高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；肺腺癌患者組血漿外泌體中的miR-100-3p較健康志愿者組相對表達(dá)水平低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；肺腺癌患者血漿外泌體中miR-30a-3p較健康志愿者的相對表達(dá)水平升高，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

表2 2組miR-17-5p、miR-100-3p和miR-30a-3p相對表達(dá)水平比較

2.4 血漿外泌體miR-17-5p和miR-100-3p診斷早期肺腺癌的ROC曲線分析：ROC曲線分析評價(jià)血漿外泌體miR-17-5p、miR-100-3p及其二者聯(lián)合診斷早期肺腺癌的準(zhǔn)確性。miR-17-5p的AUC值為0.870，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，診斷靈敏度和特異度分別為88.9%和71.1%；miR-100-5p的AUC值為0.777，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，診斷靈敏度和特異度分別為70.4%和77.8%；使用miR-17-5p/miR-100-3p聯(lián)合診斷早期肺腺癌(通過miR-17-5p/miR-100-3p△Ct的差值來計(jì)算)，AUC值為0.905，診斷靈敏度和特異度分別為83.3%和88.9%，見表3。

表3 血漿外泌體miRNA診斷早期肺腺癌的ROC曲線分析

3 討論

本研究通過提取血漿外泌體miRNA并經(jīng)qPCR檢測，驗(yàn)證了早期肺腺癌患者與健康個(gè)體相比，血漿外泌體中miR-17-5p相對表達(dá)升高，miR-100-3p相對表達(dá)下降，而miR-30a-3p雖然較健康志愿者的相對表達(dá)水平升高，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。此外，ROC曲線分析顯示，血漿外泌體miR-17-5p診斷早期肺腺癌的靈敏度和特異度分別為88.9%和71.1%，miR-100-5p診斷靈敏度和特異度分別為70.4%和77.8%，miR-17-5p/miR-100-3p聯(lián)合診斷的靈敏度和特異度分別為83.3%和88.9%。以上結(jié)果表明miR-17-5p和miR-100-3p這兩種血漿外泌體miRNA可能在肺腺癌的早期篩查中發(fā)揮作用，而且二者聯(lián)合應(yīng)用診斷的準(zhǔn)確性更優(yōu)。

外泌體是一種雙層膜結(jié)構(gòu)的囊性小泡，直徑30～100 nm[9]，廣泛存在于人體體液中，包括血液、唾液、尿液等[10]。外泌體中含有蛋白質(zhì)、細(xì)胞因子、轉(zhuǎn)錄因子受體、mRNA和miRNA等多種生物活性物質(zhì)。外泌體攜帶和傳遞重要的信號分子，形成了一種全新的細(xì)胞間信息傳遞系統(tǒng)，影響細(xì)胞的生理狀態(tài)并與多種疾病的發(fā)生與進(jìn)程密切相關(guān)。相比正常細(xì)胞，腫瘤細(xì)胞會分泌更多的外泌體，并且含有與腫瘤相關(guān)的遺傳信息。血液中含有豐富的RNA酶，循環(huán)miRNA在血液中可能被降解，影響其檢測的穩(wěn)定性。有研究發(fā)現(xiàn)外周血中存在的外泌體因其特有的膜狀結(jié)構(gòu)，可以保護(hù)其內(nèi)部的循環(huán)miRNA，使其免受RNA酶的降解[11]。由于外泌體miRNA的穩(wěn)定性和miRNA的富集，可能更適合開發(fā)診斷性生物標(biāo)志物。

miR-17-5p和miR-100-3p在腫瘤發(fā)生的相關(guān)機(jī)制中，發(fā)揮著不同的作用。miR-17-92簇是由多順反子RNA編碼的6種不同的miRNA組成，它們異常表達(dá)與多種癌癥的病理過程相關(guān)，可以通過多種分子機(jī)制來調(diào)節(jié)其靶基因[12-13]。miR-17-5p是miR-17-92簇的一員，有研究報(bào)道非小細(xì)胞肺癌患者血外泌體源性miR-17-5p 表達(dá)較健康個(gè)體明顯升高[14]。既往研究發(fā)現(xiàn)，肺癌中miR-100的表達(dá)下調(diào)，表明其可能發(fā)揮了腫瘤抑制功能[15]。另有研究報(bào)道，在非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞中過表達(dá)miR-100可通過FGFR3抑制腫瘤的生長、遷移和化療敏感性[16]。

盡管miR-30a-3p在本研究中是非特異性增高的指標(biāo)，但仍有研究顯示肺腺癌患者與健康個(gè)體相比，血漿外泌體中此miRNA表達(dá)量較高，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[7]。這可能是因?yàn)樗芯康娜巳翰町?，或是本研究樣本量較小導(dǎo)致結(jié)果不符，因此，對于miR-30a-3p仍需要進(jìn)行大樣本驗(yàn)證，來判定此miRNA是否可作為檢測早期肺腺癌的合適的生物標(biāo)志物。在有關(guān)疾病特異的循環(huán)外泌體miRNA種類及表達(dá)水平的研究中，結(jié)果往往并不一致，肺癌的研究同樣如此[6-7,17-18]，究其原因與檢測方法和檢測人群的差異等多種因素有關(guān)。因此外泌體miRNA作為診斷標(biāo)志物的應(yīng)用可能會受到一定限制，改進(jìn)外泌體miRNA檢測方法和尋找表達(dá)更為穩(wěn)定、特異的miRNA指標(biāo)是今后研究的一個(gè)方向。