祝連彩 唐士金 周麗

[摘 要] 該文研究之目的：考馬斯亮藍(lán)G250法測(cè)定蛋白質(zhì)含量是生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)的基本實(shí)驗(yàn)之一。為了更好地開展實(shí)驗(yàn)教學(xué)，對(duì)實(shí)際教學(xué)中發(fā)現(xiàn)的該方法組間穩(wěn)定性及線性相關(guān)性存在的問題進(jìn)行研究和探討。之方法：在對(duì)問題出現(xiàn)原因進(jìn)行解析的基礎(chǔ)上，對(duì)影響實(shí)驗(yàn)穩(wěn)定性的因素和線性范圍進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)研究。之結(jié)果：發(fā)現(xiàn)該方法的顯色穩(wěn)定時(shí)間為60min，線性范圍為1.0-30.0μg/mL。之結(jié)論：將研究成果引入實(shí)驗(yàn)教學(xué)，將有利于學(xué)生對(duì)于實(shí)驗(yàn)原理的理解，并消除學(xué)生對(duì)組間實(shí)驗(yàn)結(jié)果差異大的疑慮，提高實(shí)驗(yàn)教學(xué)效果。

[關(guān)鍵詞] 蛋白質(zhì)含量;考馬斯亮藍(lán)G250;顯色穩(wěn)定性;Lambert—Beer定律;線性范圍

[作者簡(jiǎn)介] 祝連彩（1975—），女，山東費(fèi)縣人，工學(xué)博士，重慶大學(xué)生物工程學(xué)院、現(xiàn)代實(shí)驗(yàn)教學(xué)中心高級(jí)實(shí)驗(yàn)師，主要從事生物化學(xué)實(shí)

驗(yàn)、生物制藥工程領(lǐng)域教學(xué)與研究。

[中圖分類號(hào)] G642? ? [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A? ? [文章編號(hào)] 1674-9324（2020）23-0266-04? ? [收稿日期] 2019-10-16

蛋白質(zhì)是生命的物質(zhì)基礎(chǔ)，是構(gòu)成細(xì)胞的基本有機(jī)物，是生命活動(dòng)的主要承擔(dān)者。蛋白質(zhì)含量測(cè)定法，是生物科學(xué)研究中最常用、最基本的分析方法之一，也是“生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)”的重要教學(xué)內(nèi)容之一。目前，常用蛋白質(zhì)含量測(cè)定方法有凱氏定氮法、雙縮脲法、Folin-酚試劑法、紫外吸收法和考馬斯亮藍(lán)法（Bradford法）[1-3]。其中考馬斯亮藍(lán)法是由Bradford于1977年根據(jù)蛋白質(zhì)與染料相結(jié)合的原理設(shè)計(jì)的[4]。這一方法是目前靈敏度最高的蛋白質(zhì)測(cè)定法，因而得到了廣泛的應(yīng)用[5-7]。考馬斯亮蘭G-250染料，在酸性溶液中通過氫鍵和范德華力與蛋白質(zhì)結(jié)合，染料蛋白質(zhì)復(fù)合物的最大吸收峰的波長(zhǎng)由染料的465nm變?yōu)?95nm，溶液的顏色也由棕黑色變?yōu)榱撂m色[4]。在595nm下測(cè)定的吸光度值A(chǔ)595，與蛋白質(zhì)濃度成正比。

一、學(xué)生實(shí)驗(yàn)結(jié)果的數(shù)據(jù)分析

（一）標(biāo)準(zhǔn)曲線制作方法

1.0～100微克/毫升標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作。

取6支試管，按表1數(shù)據(jù)配制0～100微克/毫升牛血清白蛋溶液各1毫升：

準(zhǔn)確吸取所配各管溶液0.1毫升，分別放入10毫升具塞試管中，加入5毫升考馬斯亮藍(lán)G-250試劑，蓋塞，將試管中溶液縱向倒轉(zhuǎn)混合，放置2分鐘后用10毫米光徑的比色杯在595nm下比色。繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2.0～1000微克/毫升標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作。

另取6支試管，按表2數(shù)據(jù)配制0～1000微克/毫升牛血清白蛋白溶液各1毫升，按前述方法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

（二）實(shí)驗(yàn)結(jié)果

共有10組同學(xué)開展實(shí)驗(yàn)，5個(gè)組進(jìn)行0～100微克/毫升標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作，另5個(gè)組進(jìn)行0～1000微克/毫升標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作。進(jìn)行0～100微克/毫升標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作的有2組同學(xué)出現(xiàn)操作失誤，進(jìn)行0～1000微克/毫升標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作的有1組出現(xiàn)操作失誤。我們對(duì)不存在操作失誤的同學(xué)的數(shù)據(jù)進(jìn)行了分析，結(jié)果見表3和表4。

從表3、表4的RSD項(xiàng)看，實(shí)驗(yàn)的標(biāo)準(zhǔn)偏差在13.6%～27.3%，在相同試劑和相同儀器條件下，組間的實(shí)驗(yàn)結(jié)果相差大，組間穩(wěn)定性不好。從表3我們可以看到在反應(yīng)體系蛋白質(zhì)濃度0.39～1.96μg/mL范圍內(nèi)，溶液的吸光度值較小，除1個(gè)以外都在0.100以下，且在該濃度范圍內(nèi)，吸光度和蛋白質(zhì)濃度的線性相關(guān)性低，第2組同學(xué)的線性相關(guān)系數(shù)最大，也僅是0.9711。表4的相關(guān)系數(shù)結(jié)果表明在反應(yīng)體系蛋白質(zhì)濃度3.92～19.61μg/mL范圍內(nèi)，吸光度和蛋白質(zhì)濃度具有較好的線性相關(guān)性。

（三）存在問題

通過對(duì)操作過程和實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析，我們認(rèn)為造成組間實(shí)驗(yàn)結(jié)果差異大，線性相關(guān)性低的原因可能有：

1.顯色時(shí)間不一樣。同學(xué)們需要在規(guī)定的課堂時(shí)間完成實(shí)驗(yàn)，所以基本上是同時(shí)開始實(shí)驗(yàn)的。但由于實(shí)驗(yàn)室只有1臺(tái)分光光度計(jì)，顯色完成后測(cè)定的時(shí)間就無法控制一致。因此考馬斯亮藍(lán)G250與蛋白質(zhì)的顯色反應(yīng)的時(shí)間穩(wěn)定性可能是造成組間差異的重要因素。

2.操作方法。在兩個(gè)濃度范圍的標(biāo)準(zhǔn)曲線制作方法中，均是先配制系列蛋白質(zhì)濃度的1mL的蛋白質(zhì)溶液，再取0.1mL加入反應(yīng)體系。由于0.1mL的量太少，而在本科實(shí)驗(yàn)教學(xué)中又不可能使用進(jìn)口的高精度的移液器，易于造成誤差。特別是在0～100微克/毫升牛血清白蛋溶液的配制中，移液量為20μL～100μL，更易造成組間差異。

3.線性范圍。分光光度法被用來測(cè)定溶液中存在的光吸收物質(zhì)的濃度，其理論依據(jù)是Lambert和Beer定律。而Lambert—Beer定律具有一定的適用范圍，一般情況下，吸光值在0.2-0.8時(shí)，濃度與吸光度才具有良好的線性范圍[ 10 ]。在吸光度小于0.2和大于0.8的情況下，線性是否良好，需要進(jìn)行試驗(yàn)研究和探討。

二、方法學(xué)探討

針對(duì)上述問題，我們對(duì)考馬斯亮藍(lán)G-250法測(cè)定蛋白質(zhì)含量的線性范圍、顯色穩(wěn)定性、染料用量進(jìn)行了研究。

（一）主要儀器和試劑

T6型紫外可見分光光度計(jì)，北京普析通用儀器有限責(zé)任公司，標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液：稱取牛血清白蛋白（Sigma公司），用蒸餾水配制成250μg/ml、250μg/ml和10μg/ml標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液?？捡R斯亮藍(lán)G-250試劑：考馬斯亮藍(lán)G-250（進(jìn)口分裝，上海進(jìn)出口試劑公司）100mg溶于50ml 95%乙醇，加入100ml 85%磷酸，用蒸餾水稀釋至1000ml，濾紙過濾。

（二）試驗(yàn)方法

1.顯色穩(wěn)定性。取50.0微克/毫升牛血清白蛋白標(biāo)準(zhǔn)溶液1.0mL加入10毫升具塞試管中，在加入4.0mL考馬斯亮藍(lán)溶液，將試管中溶液縱向倒轉(zhuǎn)混合，分別放置10min、20min、30min、40min、50min、60min、90min、120min后，在595nm下測(cè)定吸光度。每個(gè)時(shí)間點(diǎn)做3個(gè)平行，取平均值。

2.考馬斯亮藍(lán)G-250染色液的用量。在反應(yīng)體系蛋白質(zhì)濃度為10μg/mL的條件下，按表5考察染料用量對(duì)吸光值的影響。每管做3個(gè)平行，取平均值。

3.線性范圍。按表6進(jìn)行試驗(yàn)，考察蛋白質(zhì)濃度0.2μg/mL～50.0μg/mL范圍的線性。每管做3個(gè)平行，取平均值。

（三）數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差（x±SD）表示，應(yīng)用SPSS 16.0 for Windows進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。兩組間比較采用t檢驗(yàn)，P<0.05被認(rèn)為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

（四）試驗(yàn)結(jié)果與討論

1.顯色穩(wěn)定性。從圖1可知，在蛋白質(zhì)濃度為10μg/ml時(shí)，顯色時(shí)間在20min時(shí)，吸光度達(dá)到最大，為0.423。20min后，隨顯色時(shí)間的延長(zhǎng)，吸光度降低，60min時(shí)降至0.361，與20min時(shí)的吸光度相比差異顯著（P≤0.05）。顯色60min后，吸光度趨于穩(wěn)定，90min和120min的吸光度值與60min的相比無顯著差異性。表明蛋白質(zhì)與考馬斯亮藍(lán)G250的顯色反應(yīng)要達(dá)到60min后才能達(dá)到穩(wěn)定。以往的生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)教材中指出該顯色反應(yīng)在2min達(dá)到穩(wěn)定，這導(dǎo)致很多方法學(xué)探討的文獻(xiàn)忽略了顯色時(shí)間的研究。我們?cè)谝酝慕虒W(xué)中也忽略了對(duì)學(xué)生實(shí)驗(yàn)顯色時(shí)間的嚴(yán)格控制，這可能是造成在學(xué)生實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)偏差大的主要原因。在學(xué)生實(shí)驗(yàn)中由于實(shí)驗(yàn)條件的限制（儀器的數(shù)量），可以要求學(xué)生控制標(biāo)準(zhǔn)曲線制作和樣品測(cè)定的顯色時(shí)間保持一致來確保含量測(cè)定的準(zhǔn)確性。但在科學(xué)研究中，最好將顯色時(shí)間控制在60min，顯色穩(wěn)定后再進(jìn)行測(cè)定。

2.考馬斯亮藍(lán)G-250染色液用量的影響。在不同的實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)教材中，染料的用量也存在不同。有些是0.1mL樣品液加5mL染料;有些是1.0mL樣品液加4mL或5mL染料[2，11，12]。為使實(shí)驗(yàn)結(jié)果穩(wěn)定，利于實(shí)驗(yàn)教學(xué)，我們對(duì)染料用量進(jìn)行了考察。

由圖2可知，在顯色體系蛋白質(zhì)濃度一定的情況下，考馬斯亮藍(lán)G250用量為4.0mL、4.5mL和4.8mL時(shí)的吸光度顯著高于3.0mL時(shí)的吸光度，p<0.05;而考馬斯亮藍(lán)G250用量為4.0mL、4.5mL和4.8mL時(shí)，三者間無顯著差異，p>0.05。這表明染料用量過少會(huì)影響體系的吸光度，需達(dá)到4.0mL以上。染料用量過少會(huì)影響實(shí)驗(yàn)的穩(wěn)定性，用量過多在大規(guī)模的教學(xué)實(shí)驗(yàn)中又會(huì)增加成本和和廢液的處理量，因此實(shí)驗(yàn)中選擇4mL的染料比較合適。

3.線性范圍。為考察吸光度與顯色體系蛋白質(zhì)濃度間的線性關(guān)系，我們?cè)?.2～50μg/mL范圍內(nèi)設(shè)置了13個(gè)濃度，顯色后測(cè)定吸光度值，將數(shù)據(jù)進(jìn)行線性回歸，回歸方程和標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖3.由圖3可知，在0.2～50.0μg/mL、5.0～50.0μg/mL和0.1～1.0μg/mL的濃度范圍內(nèi)，蛋白質(zhì)濃度和吸光度不具有良好線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)均小于0.99;在1.0～30.0μg/mL范圍內(nèi)，蛋白質(zhì)濃度和吸光度具有良好線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)大于0.999。表明，蛋白質(zhì)濃度大于30.0μg/mL或小于1.0μg/mL，蛋白質(zhì)與考馬斯亮藍(lán)G250的顯色反應(yīng)都不再遵循Lambert-Beer定律，即考馬斯亮藍(lán)G250法測(cè)定蛋白質(zhì)含量的線性范圍為1.0～30.0μg/mL。文獻(xiàn)中關(guān)于該方法線性范圍有著很大的差別，有0～1000g/mL的，也有10～100μg/mL的[1，13]，這些表述都是基于蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)樣品的濃度，而非顯色反應(yīng)體系中蛋白質(zhì)的實(shí)際濃度。我們的實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)也采用了相同表述，比如在1.1和1.2中0～100μg/mL標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作。線性范圍應(yīng)以顯色反應(yīng)體系的蛋白質(zhì)濃度范圍表示較為規(guī)范，利于學(xué)生對(duì)實(shí)驗(yàn)原理，特別是Lambert-Beer定律的理解。

三、結(jié)語

在實(shí)驗(yàn)教學(xué)過程中發(fā)現(xiàn)了學(xué)生實(shí)驗(yàn)組間穩(wěn)定性差和低濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線線性相關(guān)系數(shù)低的問題。在對(duì)問題出現(xiàn)原因進(jìn)行解析的基礎(chǔ)上，對(duì)影響實(shí)驗(yàn)穩(wěn)定性的因素和線性范圍進(jìn)行了研究，確定了顯色劑用量、顯色穩(wěn)定時(shí)間和該方法的線性范圍。

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Teaching Practice and Methodological Investigation of Protein Content Determination Using Coomassie Brilliant Blue G250

ZHU Lian-cai，TANG Shi-jin，ZHOU Li

（Modern Experiment Teaching Center，Bioengineering College，Chongqing University，Chongqing 400030，China）

Abstract：The Coomassie Brilliant Blue Method is widely used for the determination of protein and is also one of the basic experiments of biochemistry experiment teaching.In order to carry out the experimental teaching effectively，we studied the factors affecting the stability of the experiment and the linear range.The results show that the chromogenic reaction reaches to stability after 60 min and the linear range of this method is 1.0-30.0μg/mL.The results of the study will be beneficial to understanding the experimental principle，eliminating the bewilderment of students on the large difference among difference groups，and improving the effect of experiment teaching.

Key words：protein content;Coomassie Brilliant Blue G250;chromogenic stability;Lambert Beer's law;linear range