盛耀瑩，鄭晟靖，庭禹潔，金 英，唐軍榮

(1.紅河哈尼族彝族自治州林業(yè)工作站，云南 蒙自 661100；2.紅河州林業(yè)和草原調(diào)查規(guī)劃隊，云南 蒙自 661100；3.西南林業(yè)大學(xué)西南地區(qū)生物多樣性保育國家林業(yè)和草原局重點實驗室，云南 昆明 650224)

大葉石蝴蝶(PetrocosmeagrandifoliaW.T.Wang)是苦苣苔科(Gesneriaceae)石蝴蝶屬(Petrocosmea)的多年生草本植物，分布于云南省鎮(zhèn)康縣[1]。石蝴蝶屬植物葉形優(yōu)美，植株花多且艷麗，近年來隨著人為活動的影響，大多數(shù)本屬植物均處于亟待保護狀態(tài)[2]。大葉石蝴蝶作為該屬植物中的一員，其葉片紙質(zhì)，層疊分布，貼近土壤，并呈蓮座狀，其花色迷人且花期長，具有較高的觀賞價值。大葉石蝴蝶分布區(qū)域窄，數(shù)量少，且在自然條件下繁殖速度慢。如何保護和利用好這一野生資源，最好的辦法之一就是掌握其繁殖方法，擴大其種群數(shù)量。

植物組織培養(yǎng)作為植物的一種繁殖方法，具有繁殖速度快，所需材料少，能夠保持母本的優(yōu)良性狀等諸多優(yōu)點，已廣泛應(yīng)用于珍稀、優(yōu)良材料擴繁[3]。采用植物組織培養(yǎng)技術(shù)對大葉石蝴蝶進行快繁，解決其種苗繁育慢的問題，為其野生資源數(shù)量的擴大提供技術(shù)支撐，同時有助于其開發(fā)利用，加速其產(chǎn)業(yè)化發(fā)展。目前關(guān)于大葉石蝴蝶的繁殖研究則未見相關(guān)報道。而在石蝴蝶屬植物的組織培養(yǎng)研究方面僅見秦嶺石蝴蝶、中華石蝴蝶的研究報道[4-5]?；诖?，以大葉石蝴蝶的葉片為外植體，開展其植株高效再生體系的建立研究，最終建立大葉石蝴蝶的離體快繁體系，為大葉石蝴蝶資源保護、產(chǎn)業(yè)發(fā)展提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料

以大葉石蝴蝶的葉片為外植體，采自云南省鎮(zhèn)康縣。

1.2 方法

1.2.1無菌體系的建立

取大葉石蝴蝶的葉片，用洗潔精溶液清洗葉片表面的污垢，并在流水下沖洗干凈，用75%的酒精進行表面消毒，然后轉(zhuǎn)移至超凈工作臺內(nèi)的無菌瓶中。倒入0.1%的升汞溶液振蕩消毒，12 min后用無菌水沖洗3次，最后置于無菌紙上備用。切除外植體原有傷口，將葉片切成2 cm左右的方塊，接種在MS+0.5 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA+30 g/L蔗糖+5.0 g/L瓊脂的分化培養(yǎng)基中，每瓶接種1個，共接種30瓶。培養(yǎng)室溫度為25 ± 2℃，光照強度為2000 Lx，光照12 h/d(下同)。

1.2.2無菌苗葉片分化培養(yǎng)基的篩選

以上述啟動培養(yǎng)基中獲得的不定芽葉片為材料，進行植株再生體系的構(gòu)建，所用基本培養(yǎng)基為MS，并附加不同濃度的激素。其中 6-BA(0.5 mg/L、1.0 mg/L、1.5 mg/L、2.0 mg/L)、NAA(0.1 mg/L、0.5 mg/L)進行兩兩組合，共8個處理，每個處理3次重復(fù)，每個重復(fù)接種20個葉片，50 d后對葉片分化情況進行統(tǒng)計。

1.2.3葉片切割方式及朝向?qū)M培苗葉片分化的影響

以再生的大葉石蝴蝶試管苗葉片為材料，選取寬度大于1 cm 的葉片，對其進行橫切(傷口垂直于葉片主脈)、縱切(傷口平行于葉片主脈)、斜切(傷口傾斜于葉片主脈)等3種方式制造傷口，比較不同切口方式對葉片分化的影響。此外，在葉片橫切方式下比較葉片近軸面或遠軸面朝下對葉片分化的影響。每個處理各接種5瓶，每瓶接種5個葉片。

1.2.4葉片大小對組培苗葉片分化的影響

以再生的大葉石蝴蝶試管苗的葉片為材料，分別選取寬度為0.5 cm左右以及寬度大于1 cm的葉片進行接種；各接種5瓶，每瓶接種5片葉片，觀察葉片大小對大葉石蝴蝶葉片分化的影響。

1.2.5不定芽生根

以1/2MS為基本培養(yǎng)基，并附加不同濃度的NAA或IBA，選取高度在1 cm以上的單芽進行生根，培養(yǎng)基中均添加0.2 g/L 的活性炭(AC)。每種生長素分別設(shè)置4個濃度梯度(0.3 mg/L、0.6 mg/L、0.9 mg/L、1.2 mg/L)，共8個處理。每個處理接種8瓶，每瓶接種6株，放入培養(yǎng)室中培養(yǎng)50 d，觀察其生根率。

1.2.6生根苗的煉苗移栽

將生根的大葉石蝴蝶生根瓶苗從培養(yǎng)室轉(zhuǎn)至室內(nèi)自然光下培養(yǎng)10 d左右，取出生根苗，洗凈附著在組培苗根部的培養(yǎng)基，移栽至準備好的基質(zhì)上(腐殖土∶珍珠巖=5∶1)，溫度25℃左右，濕度80%左右。

1.2.7數(shù)據(jù)處理

采用IBM SPSS Statistics 22進行數(shù)據(jù)單因素方差分析(ANOVA)，采用Duncan檢驗進行差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 啟動培養(yǎng)

將葉片接種培養(yǎng)15 d后，未發(fā)生污染，但部分葉片由于消毒后受傷害開始失綠；繼續(xù)培養(yǎng)30 d后，大部分葉片變成褐色并死亡，但其余存活葉片則在傷口處形成白綠色芽點；連續(xù)培養(yǎng)4個月后，不定芽逐漸發(fā)育長大，部分葉片舒展(圖1)。獲得不定芽的葉片作為離體快繁的再生材料，繼續(xù)用于后續(xù)植株再生，從而實現(xiàn)材料的無限循環(huán)擴繁。

2.2 不同激素配比對大葉石蝴蝶組培苗葉片分化的影響

獲得的無菌苗，其葉片與野生植株的葉片在生理結(jié)構(gòu)上存在較大差別，因此，無菌苗葉片再生對分化的培養(yǎng)基與啟動培養(yǎng)時的培養(yǎng)基會存在一定的差別。因此，為了優(yōu)化無菌苗葉片再生體系，需要進一步優(yōu)化6-BA與NAA的配比組合。將葉片接種在不同分化培養(yǎng)基中，培養(yǎng)21 d后，葉片傷口處出現(xiàn)白綠色芽點，即無菌苗葉片直接分化出不定芽。隨著培養(yǎng)時間的延長，分化更加明顯，培養(yǎng)至50 d時，可見大量的綠色不定芽產(chǎn)生(圖2)。不同處理組合對葉片的分化結(jié)果見表1。

表1 不同激素配比對大葉石蝴蝶葉片分化的影響

注：表中同列不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。

由表1可知，經(jīng)過分化培養(yǎng)，A1、A2、A4、A8葉片的分化率可達到100%，但A4的長勢差，分化的植株不具備生根能力。此外，對每個葉片的有效不定芽數(shù)進行分析比較，其中處理A2的數(shù)量顯著高于其它處理，為6個，同時，不定芽葉片舒展，適合用于后續(xù)不定芽葉片再生的循環(huán)材料。綜上所述，最適合無菌苗葉片分化的培養(yǎng)基配方為:MS+1.0 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA+30 g/L蔗糖+5.0 g/L瓊脂。

2.3 葉片切口方式對大葉石蝴蝶葉片分化的影響

橫切、縱切、斜切的分化率分別為84%、80%、72%，可見橫切的分化率更高，可形成大量芽叢(圖3)；斜切的分化率最低，芽叢稀疏。橫切傷口垂直于主脈，每條傷口都經(jīng)過主脈；縱切平行于主脈，部分傷口直接位于主脈；斜切時，部分傷口會經(jīng)過主脈，但大部分傷口較短，未傷及主脈。綜上所述，葉片橫切更有利于葉片傷口處形成不定芽。

a：橫切；b：縱切；c：斜切

2.4 葉片朝向?qū)Υ笕~石蝴蝶葉片分化的影響

葉片遠軸面朝下和近軸面朝下分化效果如圖4所示。

由圖4可以看出，葉片遠軸面朝下，其分化效果明顯要優(yōu)于近軸面朝下。遠軸面朝下的接種方式在培養(yǎng)21 d時出現(xiàn)綠色團狀物，40 d時形成大量芽叢，其分化率達88%；近軸面朝下的接種方式形成的芽叢極少，其分化率為60%。由此可見，遠軸面朝下更有利于葉片傷口處形成不定芽。

2.5 葉片大小對大葉石蝴蝶葉片分化的影響

接種40 d后，寬度大于1 cm的幼嫩葉片分化效果優(yōu)于寬度為0.5 cm左右的葉片(圖5)。較大葉片的分化率為88%，較小葉片的分化率為80%。說明葉片大小即葉片的發(fā)育程度會影響不定芽的分化效果。這可能是由于小的葉片來自頂部第一片或第二片，過于幼嫩，在培養(yǎng)過程中葉片易失綠，導(dǎo)致不能分化，而較大的葉片則呈半木質(zhì)化，對激素的適應(yīng)能力更強，更適于葉片的不定芽分化。綜上所述，寬度大于1 cm的葉片更利于植株再生。

2.6 不同生長素對大葉石蝴蝶組培苗生根的影響

將葉片分化得到的增殖苗，切取叢生芽上的單芽，選取高約1 cm的單芽作為生根苗接入生根培養(yǎng)基。20 d后根系開始生長，再經(jīng)過30 d生根誘導(dǎo)后，可形成發(fā)達的根系(圖6)。

a：遠軸面朝下；b：近軸面朝下

a：寬度大于1 cm的葉片；b：寬度在0.5 cm左右的葉片

圖6 大葉石蝴蝶生根苗

由表2可知，8個處理的生根率均達到100%，但在添加了同濃度的NAA或IBA的培養(yǎng)基中，其形成的根系形態(tài)也會存在差別。觀察其根系形態(tài)，在NAA的處理中，當NAA濃度為0.9 mg/L時根系生長狀況最好，根系形態(tài)為主根粗壯，須根多且密，長度相近；在IBA的處理中，當IBA濃度為0.9 mg/L時根系生長狀況最好，根系須根數(shù)量較少，根長較長，長度差異較大。綜合根系粗度、根系數(shù)量綜合分析認為 1/2 MS+0.9 mg/L NAA+15 g/L白砂糖+6.0 g/L瓊脂+ 0.2 g/L AC為最優(yōu)的生根配方。

表2 不同激素濃度對植株生根率的影響

2.7 大葉石蝴蝶試管苗的移栽煉苗

移栽使用的土壤為腐植土，共移栽30株，移栽基質(zhì)為腐殖土∶珍珠巖=5∶1。移栽完成后進行保濕處理，1個月后組培苗即可成活(圖7)。在頂芽處可形成新的葉片，再經(jīng)過一段時間的細心管護，待根系完全與土壤結(jié)合后則可完全適應(yīng)外界環(huán)境。

圖7 大葉石蝴蝶煉苗移栽(50 d)

3 結(jié)論與討論

外植體消毒是植物組織培養(yǎng)中的首要環(huán)節(jié)，直接影響無菌體系能否成功建立[6]。在外植體的消毒過程中可用的消毒劑種類較多，但以升汞的消毒效果最佳[7]。外植體消毒過程中，在材料較多的情況下常會開展不同消毒劑種類、消毒時間、消毒劑組合的篩選試驗，以期篩選出最佳的消毒方法[8-10]。但是在外植體數(shù)量有限的情況下，則只能通過少量的材料去建立無菌體系。為確保消毒效果，則多會選用升汞進行消毒。本試驗過程中，由于收集到的野生大葉石蝴蝶數(shù)量較少，因而未能開展外植體的消毒方法比較。此外，在外植體選擇中，頂芽或莖段是最為理想的材料，但大葉石蝴蝶的頂芽或莖段不明顯，故以葉片為外植體作為啟動材料。而在僅添加了0.5 mg/L 6-BA、0.1 mg/L NAA 的MS培養(yǎng)基中則能分化出不定芽，表明大葉石蝴蝶的葉片再生能力較強。

在成功獲得無菌材料后，只有讓獲得的材料呈幾何指數(shù)增長，才能真正地實現(xiàn)植物的離體快繁。而離體快繁的途徑常涉及側(cè)芽增殖途徑、不定芽增殖途徑、體細胞胚增殖途徑等[11]。其中在不定芽增殖中，不定芽可經(jīng)外植體直接形成不定芽，也可經(jīng)過分化形成愈傷組織后再分化出不定芽。而葉片在傷口處直接形成不定芽，其效率要優(yōu)于通過愈傷組織間接再生不定芽的方式[12]。大葉石蝴蝶在葉片傷口處未見明顯的愈傷組織，而是直接形成了芽點，屬于不定芽直接發(fā)生型。離體葉片的這種直接形成不定芽的方式，一般認為屬于多起源，認為其分生組織起源于切口附近與維管束相鄰的上表皮細胞、維管組織薄壁細胞及周圍薄壁細胞，通過細胞分裂和分化最終形成分生細胞團，從而直接形成芽[13]，而在此過程中，激素充當著重要角色，合理的激素配比是確保葉片分化的關(guān)鍵[14-15]。大葉石蝴蝶同大多數(shù)苦苣苔科植物一樣，NAA和6-BA對其分化起決定性作用，添加6-BA的同時配合NAA使用，并使其達到合適的比例，才能達到較為理想的分化效果。

此外，在試驗過程中發(fā)現(xiàn)，葉片過于幼嫩以及切口方式和葉片朝向均會對大葉石蝴蝶組培苗的葉片再生產(chǎn)生影響。過于幼嫩的無菌苗葉片在培養(yǎng)過程中易褐化、死亡，而相對成熟的葉片適應(yīng)性強，且處于代謝旺盛時期，再生率較高[16]。而葉片接種前垂直于主脈橫切更有利于傷口處形成不定芽或愈傷，這與灰棗樹、楊樹葉片再生研究結(jié)果較為一致[17-18]。而葉片的放置式，以遠軸面接觸培養(yǎng)基更利于愈傷組織誘導(dǎo)和不定芽分化。這與紅掌、梨、藍漿果等植物的葉片再生研究結(jié)果一致[19-21]。

在組培生根階段，添加一定濃度的生長素有助于試管苗的生根[22]。不同種類及濃度的生長素對試管苗的生根效果會存在一定的差異[23-24]。在大葉石蝴蝶的生根過程中，NAA能夠促進須根的生長，IBA能促進主根的伸長。NAA與IBA相比，更能顯著促進根系的增粗生長[25]。在卷莢相思的組培苗生根過程中，IBA的生根效果要顯著優(yōu)于NAA或ABT1，且單株生根苗的根系數(shù)量最多[26]。而在龍腦樟的組培苗生根時，IBA與IAA組合生根效果要顯著優(yōu)于單一激素的生根效果[27]。因此，在生根過程中要根據(jù)生根率及根系形態(tài)來選用合適的激素類型及配比?？偟膩碇v，大葉石蝴蝶對于添加NAA或IBA均能達到理想的生根效果，特別是在NAA的誘導(dǎo)下形成的發(fā)達根系有利于移栽煉苗。因此，在移栽過程中采用常見的腐質(zhì)土，注意控制好溫濕度，即可獲得大葉石蝴蝶移栽成活。

綜上所述，葉片消毒后接種在MS+0.5 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA+30 g/L蔗糖+5.0 g/L瓊脂的培養(yǎng)基上可獲得無菌苗；無菌苗葉片橫切后以遠軸面朝下接種在MS+1.0 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA+30 g/L蔗糖+5.0 g/L瓊脂的培養(yǎng)基中即可再分化；生根則選用1/2MS+0.9 mg/L NAA+15 g/L白砂糖+6.0 g/L瓊脂+ 0.2 g/L AC培養(yǎng)基；移栽選用基質(zhì)為腐殖土∶珍珠巖=5∶1。大葉石蝴蝶的植株再生體系的建立為今后大葉石蝴蝶的繁育和產(chǎn)業(yè)化開發(fā)提供了重要的技術(shù)支撐。