李文輝，李 建，孫志文*

(1.北京市獸藥監(jiān)察所，北京102600；2.國家糧食和物資儲備局科學(xué)研究院，北京100037)

泰樂菌素是一種大環(huán)內(nèi)酯類抗生素，常以酒石酸鹽、磷酸鹽的形式存在，泰樂菌素因酒石酸腸道吸收好、抗菌譜廣普遍應(yīng)用于防治畜禽呼吸道、胃腸道感染等疾病，同時(shí)也可作生長促進(jìn)劑。但其容易在機(jī)體或雞蛋中殘留, 即使加熱也不易分解, 間接加劇細(xì)菌耐藥性[1-3]。但畜牧業(yè)中該類藥物的濫用或違規(guī)使用易造成食品中獸藥高殘留問題，進(jìn)而引起人體胃腸道的不良反應(yīng)，損害耳蝸神經(jīng)，甚至造成肝腎損傷[4]。為保障食品安全和人類健康，各國政府均對動物源性食品中大環(huán)內(nèi)酯類藥物的最大殘留限量作出規(guī)定[5-6]，我國農(nóng)業(yè)農(nóng)村部2019年頒布的食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)GB31650-2019《食品中獸藥最大殘留限量》規(guī)定[7]，泰樂菌素的ADI為0～30 μg/kg，在雞的肌肉、脂肪、肝臟腎臟中的最大殘留限量為100 μg/kg。近年來國內(nèi)外對大環(huán)內(nèi)酯類藥物的關(guān)注逐漸增加，但對于大環(huán)內(nèi)酯類殘留檢測的研究較少，國外的檢測方法是利用毛細(xì)管氣相色譜法和紫外檢測法共同測定食品中的泰樂菌素[8]，固相萃取-液相色譜-大氣壓化學(xué)電離質(zhì)譜法測定泰樂菌素殘留量[9]，國內(nèi)沒有專門檢測泰樂菌素的檢測方法，大環(huán)內(nèi)酯類藥物的檢測方法以液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法為主[10-12]，但這些方法具有前處理步驟多，效率低、檢測組織等局限，為更全面監(jiān)測雞產(chǎn)品中的泰樂菌素藥物殘留，本研究建立了一種快速高效的超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜方法，通過對儀器分析條件，凈化方式和提取溶劑進(jìn)行優(yōu)化，使所建方法能夠滿足現(xiàn)行檢測需求，充實(shí)檢測方法，對檢測方法的研究提供現(xiàn)實(shí)指導(dǎo)意義。

1 材料和方法

1.1 儀器和耗材 Waters Acquity UPLC-Xevo TQ-S 超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀，Waters公司；XP-205電子天平，METTLER公司；24位水浴型氮吹儀，Organomation Associates公司；3-30K型冷凍離心機(jī)，Sigma公司；MS 3 basic旋渦混勻器，IKA公司；C18固相萃取柱(500 mg/6cc)，Waters公司；溶劑過濾器，美國PALL公司；超純水儀,美國Millipore公司；微量加樣器，Eppendorf 公司。

1.2 藥品和試劑 泰樂菌素標(biāo)準(zhǔn)品購自Dr公司，含量為99.5%；甲醇、乙腈為質(zhì)譜純，購自賽默飛公司；氨水，分析純，購自北京化工試劑廠；所有水均為超純水。

1.3 樣品制備 試驗(yàn)所采用的樣品， 來自北京市場，經(jīng)檢測無藥物殘留， 分別取雞肉、雞肝、雞腎、雞脂肪部分， 均質(zhì)勻漿，置于50 mL離心管中備用。

1.4 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制 用精度為0.01 mg的天平精密稱取泰樂菌素標(biāo)準(zhǔn)品約50 mg，于50 mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，配制成1 mg/mL的泰樂菌素標(biāo)準(zhǔn)儲備液；準(zhǔn)確吸取0．1 mL標(biāo)準(zhǔn)儲備液至另一10 mL容量瓶中，用乙腈溶解并稀釋至刻度，配制成10 g/mL標(biāo)準(zhǔn)工作液。

1. 5 樣品的前處理 提?。悍Q取1 g均質(zhì)的組織，加入甲醇(含2%氨水)10 mL，渦旋1 min，300 r/min振蕩10 min，4000 r/min離心5 min。收集上清液，下層用甲醇(含2%氨水)10 mL重復(fù)提取1次。合并提取液，混勻，10000 r/min離心5 min。取上清液2 mL，加水15 mL。混勻，備用。

凈化：C18固相萃取柱，依次用乙腈5 mL、甲醇5 mL、水5 mL活化平衡，取全部備用液上樣，然后用甲醇：水(35∶65，V/V)5 mL洗滌，抽干5 min，最后用5 mL甲醇：乙腈(20∶80,V/V)(含2%氨水)洗脫。收集洗脫液，35 ℃水浴氮?dú)獯蹈?。加? mL 20%乙腈，渦旋1 min，14000 r/min離心10 min，用0.22 μm濾膜過膜，供液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測定。

1.6 儀器條件

1.6.1 超高效液相色譜參考條件 色譜柱：BEH C18，2.1×50 mm, 1.7 μm;流動相：A相為0.1%甲酸水溶液；B相為0.1%甲酸乙腈溶液；流速：0.3 mL/min；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：10 μL；梯度洗脫程序見表1。

表1 梯度洗脫條件Tab 1 gradient elution conditions

1.6.2 質(zhì)譜參考條件 離子源：電噴霧離子源；掃描方式：正離子掃描；檢測方式：多反應(yīng)監(jiān)測；電離電壓：3.0 kV；源溫：100 ℃；霧化溫度：350 ℃；錐孔氣流速：30 L/h；霧化氣流速：600 L/h，測試藥物定性、定量離子對及對應(yīng)的錐孔電壓、碰撞能量見表2。

表2 泰樂菌素的定性、定量離子及錐孔電壓、碰撞能量Tab 2 qualitative and quantitative ion and hole voltage, collision energy of Tylosin

a定量離子

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立 每種組織取5份空白樣品，按實(shí)驗(yàn)操作步驟提取，洗脫液氮?dú)獯蹈珊?，分別移取5、10、50、100、200、400、1000 ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)工作液各1000 μL溶解殘余物，過濾后供液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀測定。以特征離子質(zhì)量色譜峰面積為縱坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為橫坐標(biāo)，繪制基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線，回歸方程及相關(guān)系數(shù)見表3，從中可以看出各樣品中泰樂菌素5～1000 μg/kg的濃度范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。

表3 線性回歸方程及相關(guān)系數(shù)Tab 3 linear regression equations and Correlation Coefficients

2.2 方法的檢出限和定量限(靈敏度) 采用空白組織中添加目標(biāo)化合物的方法，依據(jù)特征離子質(zhì)量色譜峰信噪比S/N≥3為方法檢測限，S/N≥10為方法定量限，添加適量標(biāo)準(zhǔn)溶液于1 g空白試樣中，分別制備得到4 μg/kg和10 μg/kg的添加樣品，經(jīng)前處理后檢測，在相應(yīng)的保留時(shí)間，空白試樣對所測藥物無干擾，檢測限(LOD)滿足信噪比 S/N=3，定量限(LOQ)滿足信噪比S/N =10，本測定方法測得泰樂菌素在雞肉、雞肝、雞腎、雞脂肪中的檢測限為4 μg/kg，定量限為10 μg/kg。其中50 μg/kg泰樂菌素基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液MRM色譜圖如圖1所示。

圖1 基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液MRM色譜圖(50μg/kg)Fig 1 MRM Chromatogram of Matrix matching standard solution(50μg/kg)

2.3 回收率實(shí)驗(yàn)(精密度和準(zhǔn)確度) 采用標(biāo)準(zhǔn)添加法，分別準(zhǔn)確稱取空白樣品2 g，添加一定體積的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，使組織中泰樂菌素濃度分別為10、50、100、200 μg/kg，按上述樣品前處理方法處理后進(jìn)行測定，一日內(nèi)每種藥物的每個(gè)添加濃度取5個(gè)平行樣品分別進(jìn)行測定，每個(gè)添加濃度設(shè)5個(gè)平行，重復(fù)測定3 d，計(jì)算回收率和批間相對標(biāo)準(zhǔn)偏差。試驗(yàn)結(jié)果表明，在10～200 μg/kg添加濃度范圍內(nèi)，在雞的不同基質(zhì)中，平均添加回收率在85.9%～110.4%之間，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差在1.2%～4.0%之間。結(jié)果表明添加回收率及相對標(biāo)準(zhǔn)偏差均滿足殘留檢測的相關(guān)要求，且方法的重現(xiàn)性很好。結(jié)果見表4。

表4 雞組織中泰樂菌素的添加回收率Tab 4 The recovery of Tylosin in chicken tissues

3 討論和結(jié)論

由于國內(nèi)外對泰樂菌素檢測方法的研究比較少，因此，可對比性不強(qiáng)，本研究跟國內(nèi)外文獻(xiàn)相比的優(yōu)勢在于，采用液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法測定泰樂菌素采用MRM掃描方式，可以同時(shí)對母離子和子離子進(jìn)行掃描，去除干擾離子，提高靈敏度和重復(fù)性。液相色譜法、毛細(xì)管氣相色譜法和紫外檢測法、固相萃取-液相色譜-大氣壓化學(xué)電離質(zhì)譜法測定泰樂菌素不具備這樣的特點(diǎn)[3,8-9]。本研究簡化處理方法，僅需要經(jīng)過兩次甲醇提取，本試驗(yàn)采用氨化甲醇跟單獨(dú)用甲醇和乙腈相比更能高效結(jié)合在C18柱上[4]，使殘留藥物更好的保留，再過C18柱凈化即可，大大縮短了檢測時(shí)間，本研究采用固相萃取技術(shù)，同液-液提取相比[11]，能更好的去除雜質(zhì)，特別是基質(zhì)復(fù)雜的組織，C18柱跟HLB萃取柱相比，在活化過程中不適用酸性試劑，酸性試劑會造成待測藥物的降解和破壞，而且跟國外使用復(fù)雜的耗材相比，價(jià)格適中，方便購買；使用35 ℃水浴氮吹，保護(hù)待測物不被分解。在檢測方法的適用性方面，跟國內(nèi)外檢測方法相比[4，10-12]，適應(yīng)更多可食的雞組織，其他方法只能測定其他屬種或單一組織，雞組織中有很復(fù)雜的基質(zhì)，單獨(dú)只檢測雞肉不能滿足檢測人員同時(shí)檢測同一屬種的多種不同組織的需求，本研究也會進(jìn)一步加大適應(yīng)多種大環(huán)內(nèi)酯類藥物的檢測方法的研究，以滿足更多藥物高通量的檢測需求。

本研究建立的雞組織中泰樂菌素殘留的超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測方法，采用基質(zhì)匹配外標(biāo)法進(jìn)行定量，樣品經(jīng)提取、凈化處理等有效的降低了基質(zhì)干擾，方法具有較高的靈敏度，通過優(yōu)化前處理方法獲得了良好的回收率，具有高效、準(zhǔn)確的特點(diǎn)，本方法的檢出限、定量限、回收率、線性、RSD值等指標(biāo)均能滿足檢測要求，適用于雞組織中泰樂菌素的測定。