陳玲，宋亞芬，張兵，蔣桃珍

(中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，北京 100081)

雞傳染性貧血(Chicken infectious anemia)是由雞傳染性貧血病毒(Chicken infectious anemia virus, CAV)引起，其病原CAV屬于圓環(huán)病毒科，基因組由單鏈、環(huán)狀、共價封閉的負(fù)鏈DNA組成[1-2]。該病最早由Yuasa等[3]報道，主要特征是導(dǎo)致感染雞出現(xiàn)再生障礙性貧血和伴有免疫抑制的胸腺萎縮和淋巴細(xì)胞流失，并伴隨著病毒、細(xì)菌或真菌感染。自從雞傳染性貧血病毒在日本首次分離以來[4]，該病毒已在幾乎所有擁有家禽產(chǎn)業(yè)的國家被分離出來。除了貧血和相關(guān)癥狀外，在商品雞群中經(jīng)常觀察到無貧血但死亡率增加的亞臨床CAV感染[5]。

自2014年以來，從我國黑龍江、吉林、遼寧、寧夏、江蘇等地的雞群中分離出CAV的報道增加，且毒株多從混合感染雞病料中分離，這些研究報道表明我國部分地區(qū)商品雞中CAV感染比例較高，且可能也是導(dǎo)致雞群一些相關(guān)疫病發(fā)生的誘因。但是在相關(guān)研究人員的報道中，沒有發(fā)現(xiàn)對近些年分離毒株致病性的研究數(shù)據(jù)[6-7]。為進(jìn)一步了解近期國內(nèi)CAV分離株的分子生物學(xué)特征和對雞的致病力，本研究采用2016年從北京平谷某雞場死亡雞肝臟中分離的一株CAV對1日齡SPF雞進(jìn)行致病性研究，同時進(jìn)行了全基因組測序和特征性氨基酸位點(diǎn)分析。

1 材料與方法

1.1 病料 北京平谷某雞場死亡雞肝臟。

1.2 SPF雞胚和雞 6日齡SPF雞胚和1日齡SPF雞，均購自北京勃林格殷格翰維通實(shí)驗(yàn)動物有限公司。

1.3 引物設(shè)計與合成 參照美國CVB《外源性雞傳染性貧血病毒檢測和鑒定的PCR方法》[6]，設(shè)計一對CAV特異性引物CAV F/R；根據(jù)GenBank中CAV全基因組，設(shè)計兩對引物CAV F1/R1和CAV F2/R2, 引物序列見表1，由中美泰和生物技術(shù)有限公司合成。

1.4 主要試劑 大腸桿菌JM109感受態(tài)細(xì)胞、病毒DNA提取試劑盒、DNA Marker、Ex Taq Mix購自Takara公司；pGEM-T載體購自Promega公司; 瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒購自O(shè)mega公司。

表1 PCR擴(kuò)增的引物序列Tab 1 Primer sequences for PCR amplication

1.5 病毒分離 將肝臟組織剪成小塊后置于研缽中，倒入適量液氮，充分研磨，按1∶5的體積比加入含雙抗(1000 U/mL)的生理鹽水，-80 ℃反復(fù)凍融三次，8000 r/min離心10 min，取上清，經(jīng)0.22 μm濾膜過濾除菌。取研磨液經(jīng)卵黃囊接種6日齡SPF雞胚，0.2 mL/胚。37 ℃繼續(xù)孵育14 d，無菌收獲胚體放入勻漿杯中，加入適量生理鹽水(25 mL/胚)，10000 r/min勻漿2 min，間隔1 min，再次以相同速度勻漿2 min，經(jīng)64目銅網(wǎng)過濾，收獲含毒濾液，標(biāo)記為CAV E1。將收獲濾液再次接種雞胚，并連續(xù)進(jìn)行5次傳代(CAV E1-E5)，每個代次病毒分裝后保存在-80 ℃。

1.6 病毒鑒定和特異性檢測

1.6.1 PCR檢測CAV病毒 參照Takara MiniBEST Viral RNA/DNA Extraction Kit Ver.5.0說明書，提取CAV E2-E4代病毒基因組。以CAV F/R為引物檢測雞傳染性貧血病毒，反應(yīng)體系：2×Ex Taq Mix 25 μL，CAV F/CAV R(10 μmol/L)各1 μL, 模板10 μL, ddH2O 13 μL；反應(yīng)條件：95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s，51.5 ℃ 45 s，72 ℃ 1 min，30個循環(huán)；72 ℃ 10 min。取5 μL PCR產(chǎn)物，用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢查PCR擴(kuò)增結(jié)果。

1.6.2 純凈性檢測 取CAV E4病毒液經(jīng)滴鼻、點(diǎn)眼接種20只3周齡SPF雞，0.2 mL/只，同時肌肉注射，0.5 mL/只。21d后按上述方法和計量重復(fù)接種一次。試驗(yàn)期間進(jìn)行臨床觀察，第一次接種后42 d采血，參照《中國獸藥典》方法，進(jìn)行相關(guān)病毒(表2)的抗體檢測。

表2 相關(guān)病毒抗體檢測方法Tab 2 Detection method of related viral antibody

1.7 致病性試驗(yàn) 將60只1日齡SPF雞隨機(jī)分為3組，每組20只。第1組和第2組為試驗(yàn)組，分別經(jīng)胸部肌肉接種100和10000 EID50CAV E4病毒，第3組為空白對照組，接種等量的生理鹽水。分別在接種當(dāng)天、接種后7 d、14 d、24 d、28 d和35 d對試驗(yàn)雞進(jìn)行稱重，并在接種后14 d時采血測定其紅細(xì)胞壓積。

1.8 病毒全基因組的擴(kuò)增、克隆和測序 以CAV E4 DNA為模板，分別以CAV F1/R1和CAV F2/R2為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將PCR產(chǎn)物回收后，與pGEM-T載體連接，轉(zhuǎn)化到JM109細(xì)胞，取100 μL涂布含有氨芐的LB瓊脂，37 ℃過夜培養(yǎng)。利用菌落PCR的方法鑒定重組子，挑選3個陽性克隆送往中美泰和生物技術(shù)有限公司測序。

1.9 序列比對與分析 將CAV E4的全基因組序列和VP1、VP2、VP3序列分別與國內(nèi)外已發(fā)表的CAV分離株(毒株信息見表3)進(jìn)行比對和分析[4]。

2 結(jié)果與分析

2.1 PCR鑒定 CAV E2-E4代病毒均能擴(kuò)增出特異性的419 bp條帶(圖1)。

2.2 純凈性檢測 接種的所有雞除產(chǎn)生CAV特異性抗體外，其他所檢測病原抗體均為陰性，也無雞痘臨床癥狀，表明所分離的CAV毒株是純凈的，

表3 序列信息表Tab 3 sequence information list

無其他病毒性病原污染。因此將毒株命名為AV1550，真空冷凍干燥后保藏在中國獸醫(yī)微生物菌種保藏管理中心(CVCC)。

M: DNA Marker; 1-3：CAV E2、E3、E4 的CAV特異性片段 M: DNA Marker; 1-3：CAV specific fragment of E2、E3、E4圖1 CAV E2、E3和E4 PCR檢測Fig 1 Identification of CAV E2、E3、E4 by PCR

2.3 致病性試驗(yàn)

2.3.1 臨床觀察 攻毒后2 d，對照組1只雞出現(xiàn)非特異性死亡。10000 EID50感染組在攻毒后8 d開始出現(xiàn)死亡，在觀察期內(nèi)死亡率為50%；100 EID50感染組在攻毒后13 d開始出現(xiàn)死亡，在觀察期內(nèi)死亡率為25%。接種雞出現(xiàn)死亡的高峰期在13～20 d。結(jié)果見表4。

表4 1日齡SPF雞接種后死亡結(jié)果Tab 4 Deaths of 1-day-old SPF chicken inoculation

2.3.2 攻毒后不同時間試驗(yàn)雞體重變化 不同劑量接種后7 d，各組試驗(yàn)雞平均體重?zé)o明顯差異。10000 EID50感染組在接種后14～35 d間，平均體重與對照組相比，具有極顯著性差異(P<0.01)；100 EID50感染組在接種后21 d～28 d，平均體重與對照組相比，具有顯著性差異(P<0.05)，接種后14 d和35 d平均體重也低于對照組，但差異不顯著(P>0.05)。具體數(shù)據(jù)見表5。

表5 不同時間雞體重結(jié)果(n=10)Tab 5 Weight of SPF chicken at different time(n=10)

不同的大寫字母表示差異顯著(P<0.05)，*表示差異極顯著(P<0.01)

Different capital letters indicate significant differences(P<0.05)，*means the difference is very significant(P<0.01)

2.3.3 對SPF雞的致貧血作用 攻毒后14 d采血測定紅細(xì)胞數(shù)量和壓積(表6)，10000 EID50感染組紅細(xì)胞數(shù)量及紅細(xì)胞壓積與對照組相比具有極顯著性差異 (P<0.01)；100 EID50感染組紅細(xì)胞數(shù)量也低于對照組，但差異不顯著，紅細(xì)胞壓積與對照組相比具有顯著差異(P<0.05)。

表6 紅細(xì)胞數(shù)量和紅細(xì)胞壓積結(jié)果(n=10)Tab 6Record of erythrocyte and packed cell volume(n=10)

不同的大寫字母表示差異顯著(P<0.05)，*表示差異極顯著(P<0.01)

Different capital letters indicate significant differences(P<0.05)，* means the difference is very significant(P<0.01)

2.4 AV1550全基因組序列分析 AV1550 E4基因組全長為2298 bp，非編碼區(qū)含有4個21 bp的直接重復(fù)序列(Direct Repeat, DR)，編碼區(qū)有3個部分重疊的開放閱讀框(Open Reading Frame, ORF)，分別編碼VP2(651 bp)、VP3(366 bp)和VP1(1350 bp)。CAV參考株全基因組序列可分為A、B和C 3個群(圖2)，AV1550株屬于A群，基因同源性分析顯示，AV1550株與中國分離株LN15170的親緣關(guān)系最近，基因同源性為99.7%，與TR20株親緣關(guān)系最遠(yuǎn)，同源性僅91.7%。

圖2 AV1550毒株的全基因組進(jìn)化樹Fig 2 Phylogenic tree based on whole genome of AV1550 and reference strains

2.5 AV1550與其它CAV參考株VP1、VP2和VP3序列比較 將AV1550株與NCBI上其它CAV毒株的VP1、VP2和VP3核苷酸和氨基酸序列進(jìn)行同源性分析，VP1核苷酸序列與已發(fā)表的CAV毒株的同源性在94.0%～99.6%之間，同源性最高的毒株為LN15170，最低的為FAdV-N22株；VP2核苷酸同源性在98.9%～99.8%；VP3核苷酸同源性為98.9%～100%。VP1氨基酸與已發(fā)表的CAV毒株的同源性在96.7%～99.6%，同源性最高的毒株為LN15170，最低的為SH11株和SDLY08株；VP2氨基酸同源性在98.2%～99.5%；VP3氨基酸同源性為97.5%～99.2%。CAV毒株的VP2和VP3序列非常保守，基因差異主要在VP1編碼區(qū)。

2.6 AV1550株特征性氨基酸位點(diǎn)分析 AV1550株在VP1的75、89、125、141和394位均為強(qiáng)毒株特征性氨基酸；在VP1的高變區(qū)(aa139-aa151)的139和144位氨基酸分別為K和E，推測該毒株有較高的復(fù)制和傳播能力。AV1550株VP1上特征性氨基酸位點(diǎn)見表7。

表7 AV1550 VP1特征性氨基酸位點(diǎn)Tab 7 Characteristic amino acids on VP1 of AV1550

3 討論與結(jié)論

自Yuasa等[9]發(fā)現(xiàn)雞T淋巴細(xì)胞系(如MDCC-MSB1)和B淋巴細(xì)胞系(如LSCC-1104B1)可用于培養(yǎng)CAV以來，細(xì)胞培養(yǎng)已成為CAV分離和繁殖的優(yōu)選方法[5]。但不同亞型的MSB1對CAV感染的敏感性不同，部分CAV毒株(如CIA-1)不能在MSB1上復(fù)制[11]；此外，MSB1細(xì)胞有時經(jīng)連續(xù)傳代后對CAV的敏感性降低，甚至僅傳代8周后病毒就不能在其上增殖[12]。有些通過細(xì)胞培養(yǎng)或PCR檢測為陰性的樣品，接種1日齡易感雞后可產(chǎn)生CAV感染臨床癥狀，已有研究表明用1日齡易感雞進(jìn)行病毒分離的敏感性是細(xì)胞培養(yǎng)的100倍以上。本研究采用雞胚卵黃囊接種的方法成功分離出一株CAV毒株，且增殖的病毒滴度較高，這為某些不能適應(yīng)細(xì)胞培養(yǎng)的田間CAV毒株的分離提供參考。

AV1550毒株的基因組大小為2298 bp，與國內(nèi)外其它35個毒株的核苷酸相似性在91.7%～99.7%之間，與國內(nèi)分離的大多數(shù)毒株的同源性均較高，與遼寧分離株LN15170同源性最高(99.7%)。不同毒株VP1核苷酸同源性在94.0%～99.6%之間，VP2核苷酸同源性在98.9%～99.8%之間，VP3核苷酸同源性為98.9%～100%?？傮w而言，CAV全基因及VP1、VP2和VP3的序列分析，表明其基因組變異很小，且VP2和VP3高度保守，VP1作為唯一的結(jié)構(gòu)蛋白且刺激宿主免疫應(yīng)答反應(yīng)，其氨基酸差異相對較大[5]，這與國內(nèi)外學(xué)者的研究報道一致。

Yamaguchi等[13]報道VP1中394位的氨基酸可能是毒力的主要決定因素。如果該位點(diǎn)為谷氨酰胺(Q)，則該分離毒株可能具有較高的致病性，如果該位點(diǎn)為組氨酸(H)，則其致病性相對較低。林歡等[14]對CAV全基因組序列分析后發(fā)現(xiàn)，除日本毒株C369外，絕大部分毒株在394位氨基酸均為Q。早期研究報道[15]，75V、89T、125I、141Q和144Q氨基酸同時發(fā)生突變，毒力會明顯減弱，不會引起貧血、骨髓和胸腺萎縮。本研究中，為進(jìn)一步明確氨基酸序列與致病性之間的關(guān)系，對分離鑒定的AV1550毒株進(jìn)行了測序和致病性試驗(yàn)，AV1550毒株394位的氨基酸為Q，僅在125L和144E發(fā)生基因突變，表明毒株可能具有較高的致病性，且毒力不會發(fā)生明顯減弱。而1日齡雞的致病性試驗(yàn)證實(shí)AV1550毒株低劑量和高劑量接種組都可以導(dǎo)致雞發(fā)病死亡，且高劑量組(每只雞接種10000 EID50)可引起50%的死亡率，明顯高于一般毒株感染引起的死亡率(通常不超過30%)，試驗(yàn)雞有明顯的貧血癥狀，增重遲緩。初步研究試驗(yàn)結(jié)果也表明，毒株的致病性與VP1特定位點(diǎn)的氨基酸具有相關(guān)性。

Renshaw等[16]報道VP1蛋白跨13個氨基酸(139 -151)的高變區(qū)(HVR)中139和144位的氨基酸在病毒的生長和傳播中起重要作用，如果VP1 Q-139和/或Q-144時，病毒的復(fù)制和傳播效率就會有所下降。AV1550毒株在139和144位氨基酸分別為賴氨酸(K)和谷氨酸(E)，推測其在機(jī)體的復(fù)制和傳播能力可能較強(qiáng)，但毒株的該生物學(xué)特性還需要進(jìn)一步試驗(yàn)研究。