寇川，梁艷，張暢，秦楠，段宏泉，陳瑩

（天津醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院天然藥物化學(xué)系，天津300070）

糖尿病的發(fā)病原因錯綜復(fù)雜，但是臨床上都具有一個共同特征：血糖的病理性升高。慢性高血糖癥導(dǎo)致易感組織的病理損傷，并可能最終導(dǎo)致繼發(fā)性并發(fā)癥，如視網(wǎng)膜病變、腎病和神經(jīng)病變、心血管疾病和卒中[1-3]。通常，胰島素的釋放減少和作用受到抑制會導(dǎo)致糖異生作用增加，糖攝取降低，從而導(dǎo)致血糖水平升高。肝臟在維持2 型糖尿病的葡萄糖穩(wěn)態(tài)中起重要作用。當(dāng)血糖升高時，肝臟會增強肝臟對葡萄糖的吸收，吸收糖原存儲，合成脂肪酸并改善胰島素敏感性。因此，改善肝葡萄糖代謝穩(wěn)態(tài)可能是治療2 型糖尿病的潛在策略。

3-O-[（E）-4-（4-cyanophenyl）-2-oxobut-3-en-1-yl] kaempferol（Fla-CN）是委陵菜黃酮Tiliroside 的衍生物，通過激活A(yù)MP 活化蛋白激酶（AMPK），增強HepG2 細(xì)胞的葡萄糖消耗[4]。本課題組以高脂飲食誘導(dǎo)的肥胖小鼠模型為研究對象，發(fā)現(xiàn)Fla-CN不僅具有抗肥胖作用，而且可提高肥胖小鼠的胰島素敏感性[5]。糖尿病C57BL/KsJ-db/db 小鼠是瘦素受體基因突變導(dǎo)致的，是目前廣泛應(yīng)用于研究人類2型糖尿病的動物模型之一[5-6]。本研究旨在以2 型糖尿病模型db/db 小鼠為研究對象，評價Fla-CN 對糖代謝的調(diào)節(jié)作用及其機制。

1 材料和方法

1.1 黃酮衍生物Fla-CN 化合物Fla-CN 的結(jié)構(gòu)（圖1）通過1H、13C NMR 和2D NMR 波譜數(shù)據(jù)分析確定，包括COSY、HSQC、HMBC 和ROESY 光譜。通過HPLC 分析Fla-CN 的純度≥95%。

圖1 Fla-CN 的化學(xué)結(jié)構(gòu)Fig 1 The chemical structure of Fla-CN

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) 人肝癌細(xì)胞株HepG2 細(xì)胞購自美國模式培養(yǎng)物集存庫（ATCC）。細(xì)胞培養(yǎng)于10%胎牛血清100 IU/mL 青霉素、0.1 mg/mL 鏈霉素的α-MEM 培養(yǎng)基中，置CO2培養(yǎng)箱中，于37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)。在顯微鏡下觀察、計數(shù)，根據(jù)實驗需要，調(diào)整細(xì)胞密度，接種于培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)板中，同樣條件下繼續(xù)培養(yǎng)，待細(xì)胞融合形成連續(xù)單層后即可用于實驗。

1.3 葡萄糖生成測定 取對數(shù)生長期的HepG2 細(xì)胞接種于6 孔板，細(xì)胞密度為2×105個細(xì)胞/孔，培養(yǎng)24 h 后，棄去原培養(yǎng)基，PBS 洗2 次，更換為無血清培養(yǎng)基，加入Fla-CN（1、2、5 和10 μmol/L）及二甲雙胍（1 mmol/L），同時設(shè)立空白對照組，孵育24 h。用PBS 洗滌兩次以除去葡萄糖，然后更換葡萄糖生成測定培養(yǎng)基（含有1 mmol/L 丙酮酸鈉，20 mmol/L乳酸鈉和15 mmol/L HEPES 的無葡萄糖和酚紅的DMEM），溫育4 h[7-8]。使用Amplex Red Glucose /葡萄糖氧化酶測定試劑盒（Sigma，St.Louis，USA），取上清液用于測量葡萄糖濃度。通過Thermo Scientific BCA 蛋白測定試劑盒測定細(xì)胞蛋白濃度。

1.4 葡萄糖攝取測定 取對數(shù)生長期HepG2 細(xì)胞以3×105個細(xì)胞/孔的密度接種到6 孔板中，待12 h貼壁后，加入不同濃度Fla-CN，預(yù)留空白對照組、陽性對照組（Ins 組）。24 h 后，PBS 洗3 遍，更換為無糖無血清的DMEM 培養(yǎng)基饑餓3 h，PBS 洗2 遍，每孔加入300 μL 的無糖無血清DMEM 培養(yǎng)基，同時加入1.5 μL 濃度為20 mmol/L 的2-NBDG，陽性對照組加入100 nmol/L 短效人胰島素，作用30 min。實驗結(jié)束，消化細(xì)胞，收集細(xì)胞至Ep 管中，5 000 r/min（離心半徑6.2 cm）4℃離心5 min，小心吸棄上清液，同時加入200 μL PBS 重懸細(xì)胞沉淀，于熒光酶標(biāo)儀激發(fā)波/發(fā)射波為488/520 nm 的條件下讀取數(shù)值。

1.5 糖原含量測定 將對數(shù)生長期HepG2 細(xì)胞接種到6 孔板中，待12 h 貼壁后，吸棄舊培養(yǎng)基，PBS洗2 遍，每孔分別加入無血清高糖DMEM 培養(yǎng)基以及Fla-CN（1、2、5 和10 μmol/L）及胰島素（100 nmol/L），24 h 后吸棄上清液，消化細(xì)胞，收集細(xì)胞，在30%KOH 中勻漿。將樣品煮沸20 min，加入1.5 mL 乙醇，然后以12 000 r/min（離心半徑6.2 cm）離心15 min。將沉淀物溶于0.5 mL 蒸餾水中，并加入0.2%的蒽酮（用98%的硫酸稀釋）稀釋后煮沸20 min。在620 nm 處檢測并記錄OD 值，通過Thermo Scientific BCA 蛋白測定試劑盒測定細(xì)胞蛋白濃度。

1.6 動物與干預(yù) C57BL/KsJ-db/db 和C57BL/KsJ-db/m 雄性小鼠42 只，SPF 級，6～8 周齡，由南京大學(xué)模型動物研究中心提供[批號：SCXK（蘇）2018-0008]。小鼠飼養(yǎng)于天津市南開醫(yī)院動物實驗中心[飼養(yǎng)許可證號：SYXK（津）2015-0007]，按照SPF 飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周，期間自由進(jìn)食、進(jìn)水。1 周后稱重并按照隨機數(shù)字表法隨機分組。以C57BL/KsJ-db/m 小鼠為對照組，灌胃給予生理鹽水（db/m）。C57BL/KsJ-db/db 小鼠根據(jù)體重和血糖水平按照隨機數(shù)字表法隨機分為不同的治療組。為期4 周的研究分組如下：db/db（生理鹽水溶液）、Fla-CN 高劑量組（Fla-CNH）、中劑量組（Fla-CNM）及低劑量組（Fla-CNL），給藥劑量分別為15 mg/kg、8 mg/kg、2.3 mg/kg，陽性對照組給予鹽酸二甲雙胍150 mg/kg。灌胃，每天1 次。在研究結(jié)束時，所有小鼠禁食12 h。在處死之前收集空腹血液以測量空腹血糖。將組織和血清保持在-80℃直至進(jìn)一步分析。

1.7 口服葡萄糖耐量試驗（OGTT）和腹腔內(nèi)胰島素耐量試驗（IPITT） 禁食過夜的動物在第12 周末通過口服2 g/kg 葡萄糖進(jìn)行OGTT，固定小鼠，75%醫(yī)用酒精對尾部消毒后，剪尾0.5 mm 讓血液自然滴于血糖試紙上，測量空腹血糖水平，記為OGTT 試驗0 min 血糖水平。給予20%葡萄糖灌胃后，記錄小鼠在30、60、90 和120 min 血糖水平，繪制血糖曲線，計算血糖-時間曲線下面積。

IPITT 在間隔3 d 后進(jìn)行。小鼠禁食2 h，鼠尾取血記錄血糖水平，記為0 min 血糖水平，腹腔注射0.75 IU/kg 人短效胰島素。胰島素注射后記錄30、60、90 和120 min 血糖濃度。繪制血糖曲線，計算血糖-時間曲線下面積。

1.8 免疫印跡 細(xì)胞達(dá)到匯合后，將培養(yǎng)基替換為補充有0.2%BSA 的DMEM。12 h 后，除去培養(yǎng)基，并加入含有不同濃度的Fla-CN 和（或）20 μmol/L AICAR 和（或）20 μmol/L compound C 的培養(yǎng)基。孵育24 h 后，使用蛋白質(zhì)提取試劑盒提取總蛋白質(zhì)和核蛋白。將肝組織在含有蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑的冰冷RIPA 緩沖液中勻漿。將組織勻漿離心[13 000 r/min（離心半徑6.2 cm），20 min，4℃]，并將上清液用于蛋白質(zhì)印跡分析。通過Thermo Scientific BCA 蛋白測定試劑盒測定蛋白濃度。通過10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）分離蛋白質(zhì)樣品（60 μg/泳道），并轉(zhuǎn)移至PVDF 膜（Millipore，Bedford.MA）。將膜用含10%脫脂奶粉的的TTBS 封閉1 h，并在4℃下與磷酸化AMPK、磷酸化乙酰輔酶A 羧化酶（p-ACC）、磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶（PEPCK），葡萄糖-6-磷酸酶（G6Pase）、過氧化物酶體增殖物激活受體γ 協(xié)同刺激因子1α（PGC-1α）、AMPK 和β-肌動蛋白（β-actin）孵育過夜。TTBS 洗3 次，每次10 min。之后，辣根過氧化物酶耦聯(lián)的二抗孵育1 h。通過使用增強的化學(xué)發(fā)光Western 印跡檢測系統(tǒng)（GE Healthcare Life Sciences，英國）對條帶進(jìn)行可視化。應(yīng)用NIH Image J 軟件分析，進(jìn)行定量分析。所有抗體均購自Cell Signaling Technology。

2 結(jié)果

2.1 Fla-CN 對肝HepG2 細(xì)胞糖代謝的影響 如圖2A 所示，研究首先觀察了Fla-CN 對HepG2細(xì)胞中葡萄糖攝取的影響。HepG2 細(xì)胞分別與Fla-CN（1、2.5、5、12.5 μmol/L）以及胰島素（100 nmol/L）孵育后，與對照組相比，5、12.5 μmol/L 的Fla-CN以及胰島素均顯著增加了肝細(xì)胞對2-NBDG 的攝?。‵=33.50，P＜0.01）。

研究通過蒽酮法測定HepG2 細(xì)胞內(nèi)糖原含量，結(jié)果如圖2B 所示，與對照相比，胰島素刺激后HepG2細(xì)胞內(nèi)的糖原含量顯著增加。不同濃度的Fla-CN孵育的HepG2 細(xì)胞內(nèi)糖原含量呈劑量依賴性增加，其中濃度分別為5、12.5 μmol/L（F=93.63，P＜0.01）的Fla-CN 明顯提高細(xì)胞內(nèi)的糖原含量。

Fla-CN 呈劑量依賴性的抑制肝葡萄糖產(chǎn)生（F=44.19，P＜0.01，圖2C）。同時Fla-CN 對HepG2細(xì)胞內(nèi)乳酸含量無顯著影響（數(shù)據(jù)未顯示）。

圖2 Fla-CN 對肝細(xì)胞HepG2 細(xì)胞內(nèi)糖攝取、糖原合成以及糖異生過程的影響Fig 2 Effect of Fla-CN on hepatic glucose uptake,glycogen synthesis and gluconeogenesis in HepG2 cells

2.2 Fla-CN 對2 型糖尿病db/db 小鼠空腹血糖、口服糖耐量和胰島素耐量的影響 如圖3A 所示，在實驗結(jié)束時，模型組db/db 小鼠的空腹血糖明顯高于對照組db/m 小鼠。與模型組相比，F(xiàn)la-CNH 組空腹血糖水平顯著降低（t=3.853，P＜0.05）。在OGTT（圖3B）和IPITT（圖3D）中，F(xiàn)la-CN 干預(yù)組各個時間點血糖濃度均低于該時間點模型組的血糖濃度。在OGTT 中，與db/m 相比，模型組db/db 的曲線下面積顯著增加（t=104.6，P＜0.001）；而與db/db 組相比，F(xiàn)la-CNH 組和二甲雙胍組（F=98.40，P＜0.05）曲線下面積則明顯降低（圖3C、E）。

圖3 Fla-CN 對2 型糖尿病db/db 小鼠空腹血糖、口服葡萄糖耐量實驗及其時間-血糖曲線下面積、胰島素耐量實驗及其時間-血糖曲線下面積的影響Fig 3 Effects of Fla-CN on fasting blood glucose,oral glucose tolerance and its AUC,insulin tolerance and its AUC in mice

2.3 Fla-CN 對2 型糖尿病db/db 小鼠肝臟和肌肉組織AMPK 磷酸化的影響 如圖4 所示，與db/db組相比，不同劑量Fla-CN 均上調(diào)db/db 小鼠肝臟組織和肌肉組織中磷酸化AMPK 蛋白表達(dá)，并呈現(xiàn)濃度依賴性。同時，各給藥組小鼠肝組織和肌肉組織中AMPK的總水平?jīng)]有顯著變化。故與2 型糖尿病模型db/db組相比，肝臟組織Fla-CN 與二甲雙胍治療組的磷酸化AMPK/AMPK 比例明顯提高（F=134.7，P＜0.01），在肌肉組織中也觀察到Fla-CN 與二甲雙胍治療組磷酸化AMPK/AMPK 比例顯著提高（F=40.47，P＜0.05）。

圖4 Fla-CN 對2 型糖尿病db/db 小鼠肝臟和肌肉組織中AMPK 磷酸化的影響Fig4 Effect of Fla-CN on AMPK phosphorylation in liver and muscle of db/db mice

2.4 Fla-CN 對2 型糖尿病db/db 小鼠肝組織糖異生的影響 Western 印跡（圖5）結(jié)果顯示，db/db 組中PEPCK（t=51.53，P＜0.001）、G6Pase（t=19.47，P＜0.001）的蛋白表達(dá)顯著增加，PGC-1α 的蛋白表達(dá)也明顯升高（t=36.95，P＜0.001）。而Fla-CN 則明顯抑制PEPCK（F=54.20，P＜0.001）、G6Pase（F=36.79，P＜0.001）和PGC-1α（F=44.78，P＜0.05）的蛋白表達(dá)。

2.5 Fla-CN 通過AMPK 激活抑制糖異生 為了確認(rèn)衍生物Fla-CN 是否通過激活A(yù)MPK 調(diào)節(jié)糖異生過程，實驗采用Fla-CN（12.5 μmol/L）結(jié)合AMPK抑制劑Compound C（4 μmol/L）和激活劑AICAR（0.1 mmol/L）處理HepG2 細(xì)胞。如圖6A 所示，F(xiàn)la-CN 顯著增加了AMPK 的磷酸化，這種作用被Compound C 阻斷。Fla-CN 和AICAR 都顯著下調(diào)了HepG2 細(xì)胞中PEPCK、G6Pase 和PGC-1α 的蛋白表達(dá)。此外，與Fla-CN 組相比，F(xiàn)la-CN 和Compound C共同孵育對PEPCK（t=24.82，P＜0.01）、G6Pase（t=4.673，P＜0.05）和PGC-1α（t=10.58，P＜0.01）的抑制作用減弱。

圖5 Fla-CN 對2 型糖尿病db/db 小鼠肝組織糖異生過程中G6Pase,PEPCK and PGC-1α 蛋白表達(dá)的影響Fig 5 Effect of Fla-CN on the protein expression of G6Pase,PEPCK and PGC-1α in the liver of db/db mice

圖6 Fla-CN 通過AMPK 信號通路對肝糖異生的抑制作用Fig 6 Fla-CN exerts an inhibitory effect on hepatic gluconeogenesis via the AMPK signaling pathway

3 討論

血糖穩(wěn)態(tài)是機體通過調(diào)節(jié)內(nèi)源性葡萄糖的產(chǎn)生以及對胰島素敏感的外周組織的葡萄糖攝取來實現(xiàn)的。正常機體攝食后，胰島素抑制肝臟中糖異生和糖原分解，并增強周圍組織對血液中葡萄糖的利用，如糖原合成、糖酵解等。然而，在2 型糖尿病患者體內(nèi)，肝臟的糖異生明顯增加、糖原合成降低；血液中葡萄糖的攝取作為骨骼肌、肝臟等組織對葡萄糖利用的起始，在機體胰島素抵抗情況下受到抑制[10]。這些變化導(dǎo)致葡萄糖的生成率超過血液循環(huán)中葡萄糖的清除率，引起血液循環(huán)中血糖升高[11]。近年來，在對2 型糖尿病的藥物研發(fā)中，尋找能夠調(diào)節(jié)葡萄糖代謝、恢復(fù)血糖穩(wěn)態(tài)的活性天然產(chǎn)物已經(jīng)成為治療2 型糖尿病藥物研發(fā)的熱點。據(jù)報道，小檗堿[12]、山奈酚[13]、人參皂甙[7,14]等能夠抑制肝葡萄糖生成，促進(jìn)葡萄糖攝取而表現(xiàn)出降血糖的作用。本研究發(fā)現(xiàn)，黃酮衍生物Fla-CN 在一定濃度范圍內(nèi)能夠顯著增加肝HepG2 細(xì)胞對葡萄糖的攝取，抑制糖異生，促進(jìn)糖原合成，提示Fla-CN 在調(diào)節(jié)糖代謝中具有重要作用。體內(nèi)實驗進(jìn)一步顯示，F(xiàn)la-CN 能夠明顯降低2 型糖尿病db/db 小鼠空腹血糖，改善db/db 小鼠受損的糖耐量和胰島素耐量，這些結(jié)果證明Fla-CN 具有顯著調(diào)節(jié)葡萄糖穩(wěn)態(tài)，有效提高胰島素敏感性，改善胰島素抵抗的作用。

AMPK 是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，是由α、β 和γ 亞基組成的異源三聚體，能夠維持細(xì)胞能量平衡。外周組織如骨骼肌、肝臟和脂肪組織中AMPK 的激活能夠加快新陳代謝，改善胰島素敏感性，有利于2 型糖尿病的預(yù)防和治療。AMPK 復(fù)合物不僅可以感知細(xì)胞中AMP 和ATP 的比例，而且細(xì)胞內(nèi)糖原含量的改變可影響AMPK 的活性，所以AMPK 被認(rèn)為是細(xì)胞能量代謝狀態(tài)和能量儲備狀態(tài)的感受器[15]。骨骼肌是機體餐后攝取葡萄糖的主要器官，能夠攝取80%餐后升高的血糖，對維持血糖穩(wěn)態(tài)發(fā)揮重要作用。研究表明，葡萄糖的攝取必須借助跨膜蛋白葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白（GLUT）的轉(zhuǎn)位來完成。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的GLUT 有14 種，分別是GLUT 1～14，這些GLUTs 分布在機體不同組織。其中由SLC2A4 基因編碼的GLUT4 是細(xì)胞葡萄糖攝取率的決定因素，它與2 型糖尿病的代謝異常密切相關(guān)。激活的AMPK 可以導(dǎo)致其底物AS160 磷酸化，降低AS160 的Rab-GTP 酶活性，刺激GLUT4 由細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)位至細(xì)胞膜，促進(jìn)葡萄糖的攝取[16-17]。降糖藥物二甲雙胍作為臨床一線藥物，通過促進(jìn)外周組織對葡萄糖的攝取和利用，維持血糖穩(wěn)定。研究發(fā)現(xiàn)，二甲雙胍是一種AMPK 激動劑，主要通過激活A(yù)MPK 發(fā)揮其降糖作用[18-19]。本研究結(jié)果顯示，F(xiàn)la-CN 處理后顯著增加了糖尿病db/db 小鼠肝臟和肌肉組織中AMPK 的磷酸化，表明Fla-CN 可能通過激活A(yù)MPK 促進(jìn)葡萄糖攝取。

另一方面，肝臟中AMPK 的激活可有效抑制糖異生關(guān)鍵酶PEPCK 和G6Pase 的表達(dá)，進(jìn)而抑制肝臟糖異生，降低葡萄糖生成[20]。而肝AMPK 特異性敲除小鼠后顯示糖耐量受損以及空腹高血糖，這可能是由于PEPCK 和G6Pase 活性增加，從而肝臟糖異生增加[21]。PGC-1α 是一種轉(zhuǎn)錄共激活因子，參與調(diào)節(jié)細(xì)胞能量代謝的多個方面，在1 型和2 型糖尿病中，PGC-1α 的基因表達(dá)水平均顯著升高。由腺病毒介導(dǎo)在大鼠肝臟過表達(dá)PGC-1α，其原代肝細(xì)胞和禁食動物肝臟中觀察到激活的PGC-1α 參與糖異生的整個過程。重要的是，在原代肝細(xì)胞中觀察到葡萄糖分泌增加，而大鼠禁食后體內(nèi)葡萄糖水平升高[22]。因此，肝臟中PGC-1α 活性升高很可能導(dǎo)致糖尿病的高血糖癥。最近的研究表明，PGC-1α 也是肝細(xì)胞核受體4α（HNF4α）和叉頭框蛋白O1（FOXO1）的輔激活因子，調(diào)控糖異生關(guān)鍵酶PEPCK 和G6Pase 的活性[23-25]。有研究報道，AMPK 可能導(dǎo)致共激活因子PGC-1α 的表達(dá)下調(diào)，進(jìn)而抑制PEPCK 和G6Pase 的表達(dá)[9]。在本研究中，2 型糖尿病小鼠的肝組織和HepG2 肝細(xì)胞中，F(xiàn)la-CN 顯著激活A(yù)MPK，同時抑制PEPCK、G6Pase 和PGC-1α 的表達(dá)，這可能是Fla-CN 降低db/db 小鼠空腹血糖，抑制肝細(xì)胞糖異生的作用機制。為了進(jìn)一步證實AMPK 在Fla-CN調(diào)節(jié)糖異生過程的作用，研究采用AMPK 抑制劑（Compound C）來阻斷Fla-CN 誘導(dǎo)的AMPK 活化作用。筆者發(fā)現(xiàn)Compound C 可以阻止AMPK 的活化，并且削減了Fla-CN 對PEPCK、G6Pase 和PGC-1α蛋白表達(dá)的抑制作用，表明AMPK 在Fla-CN 的調(diào)控糖異生過程機制中起關(guān)鍵作用。

本研究表明，黃酮衍生物Fla-CN 具有調(diào)節(jié)肝HepG2 細(xì)胞糖代謝的作用，并且能夠顯著降低2 型糖尿病db/db 小鼠空腹血糖，改善其受損的糖耐量，提高胰島素敏感度。進(jìn)一步研究顯示，F(xiàn)la-CN 可以通過激活A(yù)MPK 調(diào)節(jié)糖攝取和肝糖異生，從而發(fā)揮抗糖尿病作用。