王玲莉，于歡，張冬麗，喬衛(wèi)，唐生安

（天津醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院天然藥物學(xué)系，天津市臨床藥物關(guān)鍵技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津300070）

海綿是一種進(jìn)化了7 億~8 億年的古老多細(xì)胞動(dòng)物，廣泛分布在各種水域中。它作為一種靜止不動(dòng)的海洋生物，能產(chǎn)生多種次生代謝產(chǎn)物，作為對(duì)抗微生物及捕食者的化學(xué)防御物質(zhì)[1]。尋常海綿綱的Ircinia屬海綿能釋放低分子量的揮發(fā)性化合物，使它們具有難聞的蒜臭味[2]。目前已經(jīng)從該屬海綿分離得到甾體、萜烯、內(nèi)酯和生物堿等多種類型成分[3-5]。這些化學(xué)成分具有抗腫瘤、抗寄生蟲和抗菌等多種生物活性[5-8]。本文采用多種現(xiàn)代分離純化色譜技術(shù)及波譜解析方法，對(duì)采自中國廣西潿洲島海域的Ircinia屬海綿進(jìn)行提取分離和結(jié)構(gòu)鑒定，通過與已報(bào)道的文獻(xiàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析對(duì)比，確定了5 個(gè)化合物的結(jié)構(gòu)信息。

1 材料與方法

1.1 儀器、試劑和材料 Brucker AV 400 核磁共振儀（TMS 內(nèi)標(biāo)）；旋光儀：MC 241 digital polarimeter（PERKIN-ELMER）；液質(zhì)聯(lián)用色譜儀：Alliance 2695，Quattro Micro TM ESI（Waters）；半制備高效液相色譜儀：日本分光公司（JASCO），PU-2089（泵），RI-2031 和UV-2075（檢測(cè)器）；制備HPLC 色譜柱：YMC-Pack SIL SL12S05-2510WT（10 mm×250 mm）；有機(jī)溶劑均為天津市化學(xué)試劑一廠分析純產(chǎn)品；高效液相色譜所用試劑均為本實(shí)驗(yàn)室精餾自制；氘代試劑均為Cambrige Isotope Laboratories,Inc.USA 生產(chǎn)。

本文所用海綿采自中國廣西壯族自治區(qū)潿洲島海域，經(jīng)天津醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院唐生安副教授鑒定為南海海綿Irciniasp.，樣本編號(hào)為WZA-16，存放于天津醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院。

1.2 提取分離 將海綿Irciniasp.（干重463.0 g）粉碎，加95%乙醇進(jìn)行回流提?。? L×3），合并提取液并減壓濃縮，得到總浸膏，加水混懸，依次用水飽和的二氯甲烷、正丁醇萃取，分別得到二氯甲烷萃取物19.0 g，正丁醇萃取物6.0 g。

將WZA-16 二氯甲烷萃取物用ODS-A 柱進(jìn)行梯度洗脫，依次加入洗脫液為甲醇：水（5:5、6:4、7:3、8:2、9:1）、甲醇、乙酸乙酯、甲醇（加5%冰醋酸），得到14 個(gè)組分0101～0114。0109（5.0 g）組分經(jīng)HW-40 凝膠柱，以二氯甲烷：甲醇=2:1 為流動(dòng)相，得組分0201～0206。將0204～0206（4.0 g）合并，過正相硅膠柱，以二氯甲烷：乙酸乙酯：甲醇（8:0.3:0.1→8:1:0.5），二氯甲烷：甲醇（4:1），甲醇為流動(dòng)相，得組分0301～0315。取0306（51.3 mg）經(jīng)ODS-A 柱分離，以甲醇：水（9:1），甲醇為流動(dòng)相，得組分0501～0509。將0305（308.3 mg）合并，經(jīng)ODS-A 柱分離，以甲醇：水（85:15），甲醇為流動(dòng)相，得組分0601～0612。

將0505～0506（28.0 mg）合并后經(jīng)正相HPLC，以二氯甲烷：乙酸乙酯：甲醇（10:2:0.5）為流動(dòng)相，得單體1、2 和3。將0603 和0605 經(jīng)上述方法，分別得單體4 和5。

2 結(jié)果

從南海海綿Irciniasp. 提取物中分離得到5 個(gè)化合物，見圖1。

圖1 從南海海綿Ircinia sp.中分離得到的化合物Fig1 Compounds 1-5 isolated from the South China Sea marine sponge Ircinia sp

2.1 化合物1，白色無定形粉末 EI-MS 給出分子離子峰為m/z：432 [M]＋，結(jié)合1H NMR 和13C NMR 譜推測(cè)其分子式為：C28H48O3。分析1H NMR譜（CDCl3, 400 MHz），發(fā)現(xiàn)有1 個(gè)烯質(zhì)子信號(hào)δH5.41（1H, br d,J=2.4Hz, H-7），1 個(gè)甲氧基質(zhì)子信號(hào)[δH3.39（3H,s,6-OCH3）]，2 個(gè)含氧次甲基質(zhì)子信號(hào)[δH4.07（1H,m,H-3），3.18（1H,br d,J=4.4 Hz,H-6）]，5 個(gè)甲基質(zhì)子信號(hào)[δH0.59（3H, s, H-18），0.86（3H，d，J=6.8 Hz，H-27），0.87（3H,d,J=6.8 Hz,H-26），0.93（3H,d,J=6.4 Hz,H-21），1.00（3H,s,H-19）]。13C NMR（CDCl3, 100 MHz）譜和DEPT 譜給出了28個(gè)碳信號(hào)，其中有6 個(gè)甲基碳信號(hào)（δC12.1, 18.4, 18.8, 22.2,22.9, 58.3），10 個(gè)sp3雜化的亞甲基碳信號(hào)（δC22.2,23.0, 23.9, 27.8, 30.9, 32.8, 36.1, 39.5, 39.5, 39.6），2 個(gè)sp3雜化的含氧次甲基碳信號(hào)（δC67.9,82.5），5 個(gè)sp3雜化的次甲基碳信號(hào)（δC28.0, 36.2,43.9, 54.9, 58.2），1 個(gè)sp3雜化的含氧季碳信號(hào)（δC76.4），1 個(gè)sp2雜化的次甲基碳信號(hào)（δC115.0），1 個(gè)sp2雜化的季碳信號(hào)（δC143.7）。通過與文獻(xiàn)報(bào)道的化合物的波譜數(shù)據(jù)進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)化合物1 與已知化合物cholest-7-en-6R-methoxy-3S,5R-diol 的結(jié)構(gòu)一致，故化合物1 被鑒定為cholest-7-en-6Rmethoxy-3S,5R-diol[9]。

2.2 化合物2，無定形粉末 ESI-MS 給出準(zhǔn)分子離子峰為m/z：419[M+H]＋。1H NMR 譜（CDCl3,400 MHz）顯示，1 個(gè)烯質(zhì)子信號(hào)δH5.65（1H, br s, H-7），2 個(gè)含氧次甲基質(zhì)子信號(hào)[δH4.06（1H, m, H-3）, 3.50（1H, br s, H-6）]，5 個(gè)甲基質(zhì)子信號(hào)[δH0.59（3H, s,H-18）, 0.86（3H, d,J=6.8 Hz, H-27）, 0.87（3H, d,J=6.8 Hz,H-26）,0.93（3H,d,J=6.4 Hz,H-21）,0.95（3H,s, H-19）]?；衔? 的氫譜與碳譜與化合物1 基本一致，不同之處在于氫譜中化合物2 沒有甲氧基的信號(hào)，并且H-6 的化學(xué)位移向低場位移至3.50；另外，碳譜中C-6 的化學(xué)位移由化合物1 的δC82.5，向高場位移至化合物2 的δC77.8，并且化合物2 的碳譜中也無甲氧基碳信號(hào)存在。因此，可以推斷化合物2 的C-6 位為羥基取代，與文獻(xiàn)報(bào)道的cholest-7-en-3S,5R,6R-triol 的結(jié)構(gòu)一致，故化合物

2 被鑒定為cholest-7-en-3S,5R,6R-triol[10]。

2.3 化合物3，白色無定形粉末 ESI-MS 給出準(zhǔn)分子離子峰為m/z：431 [M+H]＋。1H NMR 譜（CDCl3,400 MHz）給出1 個(gè)甲氧基質(zhì)子信號(hào)δH3.17（3H, s,CH3O-6）], 2 個(gè)含氧次甲基質(zhì)子信號(hào)[δH4.08（1H, m,H-3）, 3.01 （1H, br d, H-6）]；5 個(gè)甲基質(zhì)子信號(hào)[δH0.59（3H, s, CH3-18）, 0.85（3H, d,J=6.4 Hz,H-27）, 0.87（3H, d,J=6.8 Hz, CH3-26）, 0.92（3H, d,J=6.8 Hz, CH3-21）, 1.02（3H, s, CH3-19）]；3 個(gè)烯質(zhì)子信號(hào)[δH5.41（1H, br d, H-7）, 5.19（2H, m, H-22, H-23）]。氫譜數(shù)據(jù)顯示化合物3 與化合物1 非常相似，區(qū)別為在于化合物3 在H-22 和H-23 位為雙鍵，多了兩個(gè)烯質(zhì)子。通過與文獻(xiàn)報(bào)道化合物的波譜數(shù)據(jù)進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)化合物3 與已知化合物cholest-7-en-6R-methoxy-3S,5R-diol 的結(jié)構(gòu)一致，故化合物3 被鑒定為cholest-7-en-6Rmethoxy-3S，5R-diol[9]。

2.4 化合物4，白色固體 EI-MS 給出分子離子峰為m/z：344 [M]＋，結(jié)合1H NMR 和13C NMR 光譜推測(cè)其分子式為：C21H44O3。1H NMR 譜（CDCl3,400 MHz）數(shù)據(jù)顯示16 個(gè)側(cè)鏈次甲基質(zhì)子信號(hào)δH1.26~1.57（32H, m），7 個(gè)連氧碳上質(zhì)子信號(hào)[δH3.86（1H, m）和3.71（1H, dd,J=3.7, 11.4 Hz），3.62（1H, dd,J=5.4, 11.4 Hz）, 3.52~3.45（4H, m）]，2 個(gè)羥基質(zhì)子信號(hào)δH2.67（2H, br s），1 個(gè)甲基質(zhì)子信號(hào)δH0.88（3H, t,J=6.4 Hz）。13C NMR（CDCl3, 100MHz）譜給出了21 個(gè)碳信號(hào)，分別為：δC72.6（C-1），71.9（C-2），64.4（C-3），70.4（C-1’），29.4（C-2’），26.1（C-3’），29.7（C-4’~C-15’），22.7（C-16’），31.94（C-17’），14.1（C-18’）。通過與文獻(xiàn)報(bào)道的化合物的波譜數(shù)據(jù)進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)化合物4 與已知化合物鯊肝醇的結(jié)構(gòu)一致，故化合物4 被鑒定為鯊肝醇[11]。

2.5 化合物5，淡黃色油狀物 ESI-MS 給出準(zhǔn)分子離子峰為m/z：279[M+H]＋，結(jié)合1H NMR 和13C NMR 光譜推測(cè)其分子式為：C16H22O4。1H NMR（400 MHz, CDCl3）譜給出4 個(gè)芳香氫質(zhì)子信號(hào)[δH7.64（2H,m,H-3,H-6）,7.46（2H,m,H-4,H-5）]，4 個(gè)連氧碳上質(zhì)子信號(hào)δH4.23（4H,t,J=6.7 Hz,H-1’,H-1”），8 個(gè)飽和碳上質(zhì)子信號(hào)[δH1.64 （4H, m, H-2’,H-2”）, 1.38 （4H, m, H-3’, H-3”）]，2 個(gè)甲基信號(hào)δH0.89（6H, t,J=7.4 Hz, H-4’, H-4”）。通過與文獻(xiàn)報(bào)道的化合物的波譜數(shù)據(jù)進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)化合物5與已知化合物鄰苯二甲酸正丁酯的結(jié)構(gòu)一致，故化合物5 被鑒定為鄰苯二甲酸正丁酯[12]。

3 討論

本實(shí)驗(yàn)運(yùn)用各種色譜分離手段，包括硅膠柱色譜、凝膠柱色譜和半制備高效液相色譜等現(xiàn)代分離技術(shù)手段，從采集自中國潿洲島海域的海綿生物Irciniasp.的二氯甲烷提取部位中獲得5 個(gè)化合物。再經(jīng)過核磁共振波譜、質(zhì)譜等方法，確定了這5 個(gè)化合物的化學(xué)結(jié)構(gòu)。通過與文獻(xiàn)數(shù)據(jù)中的氫譜、碳譜數(shù)據(jù)對(duì)比分析，確定了Irciniasp.中分離的5 個(gè)化合物分別是cholest-7-en-6R-methoxy-3S,5R-diol（1），cholest-7-en-3S,5R,6R-triol（2），cholest-7,22-dien-6R-methoxy-3S,5R-diol（3），鯊肝醇（4）和鄰苯二甲酸丁酯（5）。其中化合物1～3 為首次從該屬海綿中分離得到。本文的研究成果使Ircinia屬海綿的化學(xué)多樣性得以豐富，尤其是擴(kuò)充了甾體類化合物的結(jié)構(gòu)內(nèi)容，對(duì)進(jìn)一步研究該屬海綿的類似單體成分提供了理論支持，為尋找甾體類新藥的先導(dǎo)化合物，開發(fā)海洋藥物提供了結(jié)構(gòu)依據(jù)。