田雨晴，周煒，婁兆文

(湖北大學化學化工學院，湖北 武漢 430062)

0 引言

癌癥是威脅人類健康的最嚴重的疾病之一[1].由于療效及毒副作用等問題，抗癌化療藥物臨床應用的實際效果并不顯著，還遠遠不能滿足人類的需求.開發(fā)較氟尿嘧啶(5-FU)[2]，順鉑(DDP)[3],紫杉醇(TAX)[4]和木豆素衍生物[5]等臨床用藥更有效、更安全、更廉價的新型抗腫瘤藥物，意義重大.

在長期研究季鏻鹽化合物的抗腫瘤活性[6]基礎上，本研究對前期報道[7]合成的兩個合成路線相對簡單、預計成本低廉、初篩藥效明顯的季鏻鹽化合物進行了進一步研究，以間三氟甲基苯胺為原料，氯代烷酰氯為連接基團，通過優(yōu)化合成方法，以期提高目標物產率，尤其是提高產物純度；以5-FU為陽性對照，通過CCK8法，測試氯化-N-間三氟甲基苯基-3-丙酰胺基三苯基鏻和氯化-N-間三氟甲基苯基-4-丁酰胺基三苯基鏻對人表皮癌細胞(A431)、人腦星形膠質母細胞瘤細胞(U87-MG)、人肝永生化細胞(THLE-2)、人肝癌細胞(QGY-7701)、人肺退行性癌細胞(CALU-6)、人結腸癌細胞(SW-480)、人子宮內膜癌細胞(ISHIKAWA)、人胃癌細胞(NCI-N87)、人乳腺癌細胞(MDA-MB-231)和人肝癌細胞(Hep G2)的毒性，以期進一步評價化合物的抗腫瘤活性.

圖1 氯化-N-間三氟甲基苯基-3-丙酰胺基三苯基鏻

圖2 氯化-N-間三氟甲基苯基-4-丁酰胺基三苯基鏻

1 合成方法優(yōu)化

1.1 儀器與材料INOVA 600MHZ核磁共振儀(美國瓦里安生產)，Spectrum one型紅外分光光度計(美國 PE公司)，LCMS-8040三重四極桿液相色譜質譜聯(lián)用儀(日本島津).所有化學試劑均為市售化學純或分析純試劑.

圖3 氯化-N-間三氟甲基苯基-3-丙酰胺基三苯基鏻合成路線

1.2 氯化-N-間三氟甲基苯基-3-丙酰胺基三苯基鏻的合成取0.646 g(4.01 mmol)間三氟甲基苯胺溶于15 mL氯仿，加入0.405 g(4.00 mmol)三乙胺.冰水浴，攪拌，滴加經20 mL氯仿稀釋的0.559 g(4.40 mmol)3-氯丙酰氯.反應20 min后，依次用飽和碳酸鈉溶液、飽和氯化鈉溶液洗滌，水相再用氯仿萃取.合并有機相，再用飽和食鹽水洗滌，無水硫酸鈉干燥，減壓蒸餾除去溶劑，得中間體3-氯丙酰間三氟甲基苯胺粗產品.中間體無需純化，直接加入0.972 g(3.71 mmol)三苯基膦和10 mL甲苯，加熱冷凝回流約48 h.減壓蒸餾除去溶劑后，用硅膠柱層析分離(先甲苯洗脫三苯基膦及易溶有機物，再以甲苯-乙醇[體積比9∶1]洗脫)，得到油狀物質0.982 g，產率47.65%(文獻[7]中為43.48%),IR(KBr)cm-1:3 406.59,2 867.24,1 680.97,1 602.95,1 568.51,1 486.64,1 449.25,1 340.65,1 282.35，1 257.87,1 171.04,1 113.60,1 069.40,722.39,692.58，527.36(文獻[7]).1H NMR(600 MHz,CDCl3,TMS)11.74(s，1H);8.21(s,1H);7.89(d,J=8.40 Hz,1H);7.89～7.81(m,15H);7.80(t，1H);7.36(d，J=4.07 Hz,1H);3.84(t,J=8.12 Hz,2H);3.24(t,J=8.44 Hz,2H)(文獻[7]).

圖4 氯化-N-間三氟甲基苯基-N-丁酰胺基三苯基鏻合成路線

1.3 氯化-N-間三氟甲基苯基-4-丁酰胺基三苯基鏻的合成取0.804 g(4.99 mmol)間三氟甲基苯胺溶于15 mL氯仿，加入0.506 g(5.00 mmol)三乙胺，冰水浴攪拌，滴加經20 mL氯仿稀釋的0.775 g(5.50 mmol)4-氯丁酰氯.反應約20 min后，依次用飽和碳酸鈉溶液、飽和氯化鈉溶液洗滌，水相再用氯仿萃取.合并有機相，再用飽和食鹽水洗滌，無水硫酸鈉干燥，減壓蒸餾除去溶劑，得中間體4-氯丁酰間三氟甲基苯胺粗產品.中間體無需純化，直接加入1.230 g(4.69 mmol)三苯基膦和10 mL甲苯.加熱冷凝回流約48 h.減壓蒸餾除去溶劑后，用硅膠柱層析分離(先甲苯洗脫三苯基膦及易溶有機物，再以甲苯-乙醇[體積比9∶1]洗脫)，得到白色固體1.12 g，產率42.43 %(文獻[7]中為11.44%).IR(KBr)cm-1:3 417.80,2 944.87,1 681.62,1 604.70,1 532.62,1 439.03,1 326.87,1 258.50,1 159.48,1 114.98,1 067.68,1 016.62,848.97,743.45,691.94,532.96(文獻[7]).1H NMR(600 MHz,CDCl3,TMS)11.53(s,1H);8.30(s,1H);7.98(d,1H);7.82～7.67(m,15H);7.32(t,1H);7.24(d,1H);3.60(m,2H);3.05(t,2H);2.08(d,2H)(文獻[7]).

1.4 合成方法改進及質譜驗證與文獻相比，為提高產品純度，本研究在減少酰氯比例基礎上，增加了溶劑稀釋活性反應物氯代烷酰氯的步驟，以便控制反應速率；取消了合成中間產物酰胺過程中加熱冷凝回流步驟，防止非?；鵆―Cl鍵的氯水解、胺解等副反應.根據產物特性，在純化最終產品時，采取了分段淋洗方案，即先用甲苯洗脫三苯基膦及其它易溶有機物雜質，再用甲苯-乙醇(體積比為9∶1)分離目標產物，提高了產率和產品純度.

兩個化合物的質譜圖見圖5、圖6.

圖5 氯化-N-間三氟甲基苯基-3-丙酰胺基三苯基鏻的質譜

圖6 氯化-N-間三氟甲基苯基-4-丁酰胺基三苯基鏻的質譜

圖5、圖6表明，氯化-N-間三氟甲基苯基-3-丙酰胺基三苯基鏻Mr為513.92，氯化N-間三氟甲基苯基-4-丁酰胺基三苯基鏻Mr為527.95，且(M―Cl)∶(M―Cl+2)≈3∶1，進一步驗證了所得化合物結構與純度.

2 細胞毒性研究

2.1 實驗材料肝臟THLE-2正常細胞株、肝癌HepG2、QGY-7701細胞株、肺癌Calu-6細胞株、胃癌NCI-N87細胞株、乳腺癌MDA-MB-231細胞株、結直腸癌SW480細胞株、宮頸癌Ishikawa細胞株、皮膚癌A431細胞株、膠質瘤U-87 MG細胞株由武漢合研生物醫(yī)藥科技有限公司提供.

2.2 CCK8法檢測前1天，將細胞接種于96孔細胞板中，每孔接種80 μL細胞懸液，37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱，孵育過夜.實驗當天，根據實驗要求，每孔加入20 μL化合物工作液,37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱，孵育48 h.結束孵育后，往細胞板中加入CCK8 10 μL/孔，置于37 ℃和5% CO2培養(yǎng)箱中孵育1～2 h.在Nivo上測定450 nm波長處的吸光度，計算活率.

計算方法(測得的各組吸光度均應減去背景空白對照孔吸光度)：

細胞活率/%=ODs/AVER(ODNC)×100%，

其中：ODS：樣品孔的吸光值(待測化合物)；ODNC：陰性孔吸光值(細胞+培養(yǎng)基+DMSO).

2.3 檢測結果檢測結果見表1.

表1 兩個季鏻鹽與細胞作用的IC50

其中，氯化-N-間三氟甲基苯基-3-丙酰胺基三苯基鏻簡稱“丙鹽”，氯化-N-間三氟甲基苯基-4-丁酰胺基三苯基鏻簡稱“丁鹽”.10種細胞分別為：人表皮癌細胞(A431)、人腦星形膠質母細胞瘤細胞(U87-MG)、人肝永生化細胞(THLE-2)、人肝癌細胞(QGY-7701)、人肺退行性癌細胞(CALU-6)、人結腸癌細胞(SW-480)、人子宮內膜癌細胞(ISHIKAWA)、人胃癌細胞(NCI-N87)、人乳腺癌細胞(MDA-MB-231)、人肝癌細胞(Hep G2).

3 結果與討論

3.1 季鏻鹽抗癌作用分析表1結果表明，氯化-N-間三氟甲基苯基-3-丙酰胺基三苯基鏻總體的IC50小于氯化-N-間三氟甲基苯基-4-丁酰胺基三苯基鏻，說明前者有更強的抗腫瘤活性.兩種季鏻鹽對THLE-2(人肝永生化細胞)、A431(人表皮癌細胞)和NCI-N87(人胃癌細胞)抑制活性較強.與文獻[8]比較，3-(鄰三氟甲基苯胺基?；?丙基三苯基膦對小鼠肉瘤細胞(S180)的IC50=23.49 μmol·L-1，而氯化-N-間三氟甲基苯基-3-氯丙酰胺基三苯基季鏻鹽對人表皮癌細胞(A431)、人胃癌細胞(NCI-N87)的IC50較前者低，說明此季鏻鹽三氟甲基位置的不同，對癌細胞的抑制作用不同，且間位的活性相對較弱.

3.2 問題分析在本研究中，共使用了9種癌細胞和1種正常細胞，其中人肝癌細胞(QGY-7701)、人肝癌細胞(Hep G2)和人肝永生化細胞(THLE-2)屬于人體相同器官，而人表皮癌細胞(A431)、人腦星形膠質母細胞瘤細胞(Μ87-MG)、人肺退行性癌細胞(CALΜ-6)、人結腸癌細胞(SW-480)、人子宮內膜癌細胞(ISHIKAWA)、人胃癌細胞(NCI-N87)、人乳腺癌細胞(MDA-MB-231)并沒有使用相對應同種部位的正常細胞進行試驗.若兩種季鏻鹽對于以上癌細胞所在同種器官或組織的正常細胞的毒性較小，則可以認為這兩種季鏻鹽對于某種癌癥的治療有較為出色的表現，這需要進行更多的細胞測試，而本研究的數據不足以說明這一點.

文獻[7]中檢測數據表明，對小鼠肉瘤細胞S180，5-氟尿嘧啶的抑制率為38.82%(50 μg/mL)，要比氯化-N-間三氟甲基苯基-3-氯丙酰胺基三苯基鏻97.54%(50 μg/mL)低很多；而本研究參照文獻[9]值，對HepG-2(人肝癌細胞)，5-氟尿嘧啶的IC50=(9.92±1.09)μmol·L-1，氯化-N-間三氟甲基苯基-3-氯丙酰胺基三苯基鏻的IC50為36.20 μmol·L-1，弱了大約314，說明尚需進行深入細致的研究.

4 結論

本研究優(yōu)化了兩個具抗腫瘤活性的季鏻化合物的合成條件，顯著提高了產品的產率和純度，為該類化合物的進一步應用研究積累了有益的數據.本研究表明，氯化-N-間三氟甲基苯基-3-丙酰胺基三苯基鏻具有較強的抗腫瘤活性；在評價這類化合物的細胞毒性時，化合物結構與活性相關但其規(guī)律性尚未明確，且生物活性的研究方法不同結果也存在明顯差異；要判斷該類化合物的藥用價值與應用前景，尚需進一步深入研究.