徐浩文 馬銘 黃玲

摘要 [目的]分析我國8個沿海潮間帶紅條毛膚石鱉地理種群的COI基因的遺傳多樣性。[方法]利用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）技術(shù)擴(kuò)增8個地區(qū)80個紅條毛膚石鱉樣品的COI基因。使用DNASP5.10.01、MEGA7.0等軟件對所得序列進(jìn)行分析，得到片段堿基含量、遺傳距離以及遺傳多樣性參數(shù)等數(shù)據(jù)，并通過構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹的方式，結(jié)合遺傳多樣性數(shù)據(jù)分析結(jié)果。[結(jié)果]獲得的COI基因片段長度為659 bp，COI基因位于線粒體編碼區(qū)中，平均A、T、C、G的堿基含量分別20.4%、41.7%、14.9%和23.0%，存在明顯的AT偏向，結(jié)合Acanthochitona crinita為外群系統(tǒng)發(fā)育樹的結(jié)果來看，中國沿海地區(qū)紅條毛膚石鱉種群分成2個明顯的聚群，將它們定義為北方群體和南方群體，遺傳距離為0.000 66～0.087 85。單倍型遺傳多樣性數(shù)據(jù)顯示，多樣性數(shù)值較高，但核苷酸多樣性較低。[結(jié)論]紅條毛膚石鱉北方群體的遺傳多樣性與南方群體存在差異，2個群體應(yīng)該分別采取相應(yīng)措施來保護(hù)遺傳多樣性。

關(guān)鍵詞 紅條毛膚石鱉;COI基因;遺傳多樣性

Abstract [Objective] To analyze the genetic diversity of COI gene in Acanthochiton rubrolineatus from 8 littoral geographical populations of China.[Method] COI gene of 80 samples of A.rubrolineatus from 8 geographical populations were amplified by polymerase chain reaction （PCR technology）.And we used DNASP5.1001，MEGA7.0 and other softwares to analyze the sequences，calculate the data of fragment base content，distance and other genetic diversity parameters，and analyze the results by the means of constructing phylogenetic trees in combination of genetic diversity data.[Result]The length of COI gene fragment was 659 bp，COI gene was located in the encoding region of mitochondria，and the average content of bases A，T，G，C was 20.4%，41.7%，14.9%，23.0% respectively，showing a significant AT bias.Combined with the results of phylogenetic trees with the outgroup of Acanthochitona crinite，we found that all haplotypes of A.rubrolineatus populations in China coasts were clustered into two apparent geographic lineages in phylogenetic trees，named as Northern group and Southern group，the genetic distance ranged from 0.000 66 to 0.087 85.The results of haplotype genetic diversity reflected that Hd was high，but the nucleotide diversity was low.[Conclusion]There were obvious differences between the northern group and southern group of A.rubrolineatus in China，and the northern and southern group should be protected separately by taking some measures.

Key words Acanthochiton rubrolineatus;COI gene;Genetic diversity

紅條毛膚石鱉（Acanthochiton rubrolineatus）隸屬軟體動物門多板綱石鱉目毛膚石鱉科，生活在潮間帶中、低潮區(qū)巖石岸，主要分布在我國黃渤海到廣東沿岸，此外，日本也有分布[1]，是我國最常見的石鱉種群。石鱉屬于多板綱比較原始的軟體動物，包含超過940種現(xiàn)生種以及430種石鱉化石標(biāo)本，在白堊紀(jì)至今漫長的進(jìn)化歷程中，其化石形態(tài)變化不大[2-3]，在研究軟體動物的起源與進(jìn)化中有重要的地位和意義，紅條毛膚石鱉身體兩側(cè)對稱，長橢圓形，背部中央凸出，并披有8塊石灰質(zhì)的殼板[4]，上面有3道暗紅色橫紋。相對于其他物種，石鱉物種沒有明顯的經(jīng)濟(jì)價值，目前未見到人工養(yǎng)殖石鱉的相關(guān)報道，但具有重要的環(huán)境指示價值，是良好的水質(zhì)指示劑，對于保護(hù)生態(tài)環(huán)境具有重要的作用。目前對紅條毛膚石鱉的研究主要集中在形態(tài)、齒舌新型磁性納米材料、食用藥用價值等方面[5-7]，而遺傳多樣性分析并不多見。遺傳多樣性是分析生物多樣性重要的手段，通過種群遺傳多樣性的分析可以揭示進(jìn)化歷史和種群進(jìn)化的可能性[8]，具有更高遺傳多樣性的物種或者種群能夠更好地適應(yīng)環(huán)境改變[9]，遺傳多樣性越高，或者變異越強的物種，其生存能力往往越強。探究紅條毛膚石鱉遺傳多樣性對于了解石鱉乃至軟體動物進(jìn)化歷程，對維持生物多樣性具有重要的意義，同時遺傳多樣性的研究也可以對野生物種資源的保護(hù)和資源的可持續(xù)利用提供文獻(xiàn)參考。

分子標(biāo)記是以基因突變?yōu)榛A(chǔ)來分析物種遺傳與變異的方法，常見的分子標(biāo)記有RNA核糖體（16S rRNA、28S rRNA）[10]、細(xì)胞色素B（cytochrome b，Cytb）[11]、細(xì)胞色素氧化酶亞基I（cytochrome oxidase subunit I，COI）等[12]，筆者用到的分子標(biāo)記是位于線粒體DNA中的COI基因。線粒體DNA是探究動物群體遺傳學(xué)常用的分子標(biāo)記，常用來進(jìn)行群體遺傳學(xué)的分析[13]，線粒體DNA不包含內(nèi)含子、間隔區(qū)和重復(fù)序列，母系遺傳，具有較高的序列替換速率[14]。COI基因是線粒體編碼蛋白最大的一個編碼區(qū)，變化速率快，相對于線粒體rRNA基因更加保守，被廣泛應(yīng)用在生物類群的種質(zhì)鑒定和低階分類階元的系統(tǒng)學(xué)研究中[15-16]，在海洋動物遺傳群體的研究中應(yīng)用較為廣泛[17-18]。

1 材料與方法

1.1 樣品采集 樣品采集自我國沿海8個地區(qū)，包括大連（DL）、煙臺（YT）、威海（WH）、青島（QD）、連云港（LYG）、舟山（ZS）、玉環(huán)（YH）和廈門（XM）。采樣的地點多為海岸潮間帶礁石灘，采樣時間選擇退大潮時，具體采樣方法參考張楓軒[19]的方法。

1.2 試驗方法

1.2.1 DNA提取。取紅條毛膚石鱉腹部肌肉組織，每次取綠豆粒大小的肌肉組織，將組織在1.5 mL離心管中充分剪碎，用天根海洋動物組織基因組DNA提取試劑盒（TIANamp Marine Animals DNA Kit，DP324-03）提取總DNA?？侱NA使用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行DNA檢測，膠圖中出現(xiàn)清晰明亮條帶，說明提取的DNA片段質(zhì)量較高，可以進(jìn)行后續(xù)的擴(kuò)增操作，隨后按照編號將結(jié)果較好的DNA置于-20 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 PCR擴(kuò)增。通過GenBank數(shù)據(jù)庫中查找石鱉COI序列，并通過Primer5.0軟件遵循引物設(shè)計原則設(shè)計引物，得到正向反向引物序列分別為5′-GGTCAACAATCATAAAGATATTGG-3′、5′-TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATC-3′，由上海生工生物公司合成，將引物稀釋后按照22 μL水，25 μL Taq酶（TaKaRa TaqTM Version 2.0），1 μL DNA，上下游引物各1 μL的比例配成50 μL的反應(yīng)體系，具體PCR反應(yīng)程序如下：94 ℃ 預(yù)變性3 min;94 ℃變性30 s，50 ℃退火30 s，72 ℃延伸2 min，共35個循環(huán);72 ℃延伸10 min后，溫度降至室溫，10 ℃下保存。

1.2.3 序列處理和分析。PCR所得產(chǎn)物經(jīng)檢測合格后送往上海生工生物有限公司進(jìn)行測序，所得測序產(chǎn)物用DNAstar軟件中的Seqman軟件進(jìn)行剪切與拼接，使用MEGA7.0軟件對拼接序列進(jìn)行比對，所有序列均在GenBank數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行BLAST同源檢測，確定為目的紅條毛膚石鱉的DNA序列;利用MEGA7.0對序列按地區(qū)進(jìn)行分組整合，計算各組之間的遺傳距離、各組之間堿基組成以及以Acanthochitona crinita為外群構(gòu)建單倍型系統(tǒng)發(fā)育樹，利用DNASP5.10.01軟件對序列進(jìn)行遺傳多樣性數(shù)據(jù)的收集分析等。

2 結(jié)果與分析

2.1 產(chǎn)物檢測結(jié)果 PCR擴(kuò)增后的產(chǎn)物電泳檢測結(jié)果如圖1所示，表明目的基因的擴(kuò)增效果較好。

2.2 堿基含量分析 獲得的COI基因片段裁切整齊對比后長度為659 bp，作為下一步分析使用，通過MEGA7.0分析得到堿基組成結(jié)果（表1）。由表1可知，紅條毛膚石鱉的COI基因堿基片段各地區(qū)堿基組成差異不明顯，堿基A、T、C、G的平均含量分別為20.4%、41.7%、14.9%和23.0%，存在明顯的AT偏向，是一種比較普遍的堿基偏向性，其他生物的研究中也報道過這種堿基偏向[20-21]。

2.3 各地區(qū)遺傳距離分析 通過MEGA7.0軟件計算各地理種群間遺傳距離，所得結(jié)果見表2。由表2可知，各地理種群間遺傳距離為0.000 66～0.087 85，遺傳距離差距較大。北方地理種群遺傳距離為0.002 96～0.016 10，南方地理種群的遺傳距離為0.000 66～0.087 85，南北方地理種群間遺傳距離較大，說明南北方地理種群間存在較大的分化差異，南方地理種群的分化程度更大。

2.4 紅條毛膚石鱉COI基因遺傳多樣性分析 通過DNASP軟件對紅條毛膚石鱉種群進(jìn)行遺傳多樣性分析結(jié)果見表3。由表3可知，COI基因片段的變異位點（S）為8～24個，單倍型多樣性（Hd）為0.844～1.000，核苷酸多樣性（π）為0.004 07～0.012 75，各地區(qū)單倍型多樣性數(shù)值較高，但核苷酸多樣性指數(shù)較低，該結(jié)果與王儒曉等[22]的研究結(jié)果相一致。Tajimas D 檢驗[23]和Fus Fs檢驗[24]常被用于評估種群的歷史動態(tài)。Tajimas D和Fus Fs的檢驗結(jié)果如果是負(fù)數(shù)，且脫離中性檢測比較明顯，說明種群或許經(jīng)歷過群體的擴(kuò)張。從表3可以看出，南方種群的擴(kuò)張比較明顯，北方種群除威?？赡苡捎谶z傳漂變出現(xiàn)了正值，其他地區(qū)也都出現(xiàn)了不同程度的擴(kuò)張，其中，北方種群中青島的擴(kuò)張程度比較大，南方種群中玉環(huán)和廈門的擴(kuò)張程度較大，具體擴(kuò)張時間還需要借助其他手段進(jìn)行探討。

2.5 系統(tǒng)發(fā)育樹分析 系統(tǒng)發(fā)育樹常常被用來反映物種間的進(jìn)化關(guān)系，基于COI基因片段以Acanthochitona crinita為外群構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹的結(jié)果如圖2所示。從圖2可以看出，來自8地區(qū)80條序列共定義了26個單倍型，結(jié)果顯示以連云港為界限的北方與南方2個群體的單倍型分成2個明顯的進(jìn)化枝，紅色代表北方區(qū)域的單倍型集合，藍(lán)色代表南方區(qū)域的單倍型集合，2個集合之間存在明顯的遺傳差異，系統(tǒng)發(fā)育樹分析結(jié)果與遺傳距離結(jié)果相一致，說明南北方地區(qū)紅條毛膚石鱉存在較大的分化差異。

3 結(jié)論

紅條毛膚石鱉是石鱉中分布很狹隘的一個種群，由于其特殊的生活習(xí)性，人們往往容易將它忽略。這個物種具有較高的科學(xué)研究價值和生態(tài)價值，但是由于近年來頻繁的人類活動，海水污染嚴(yán)重以及生態(tài)環(huán)境被破壞等因素影響，紅條毛膚石鱉的野生種群數(shù)目正在急劇下降，為了阻止這種趨勢，對紅條毛膚石鱉進(jìn)行一個綜合的遺傳多樣性分析來尋求對策建立保護(hù)措施顯得尤為必要。筆者分析了來自我國8個地區(qū)紅條毛膚石鱉的遺傳多樣性，結(jié)果顯示出我國紅條毛膚石鱉存在明顯的南北方分化差距，在進(jìn)行生物多樣性保護(hù)時應(yīng)區(qū)分南方地區(qū)以及北方地區(qū)，分別采取對應(yīng)措施來保護(hù)野生的紅條毛膚石鱉種群。

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