郭亮 桂菲 李睿夫 于超 羅遠盟

【摘? 要】目的：評估麝香酮對原代大鼠脊髓神經(jīng)細胞的保護作用。方法：采取2mm間距行“井”法對培養(yǎng)的星形膠質(zhì)細胞進行劃傷，建立星形膠質(zhì)細胞的機械損傷模型，在模型中加入500mmol/l谷氨酸共培養(yǎng)，建立星形膠質(zhì)細胞機械-化學損傷模型，分別在6h、12h、24h、48h、72h作MTT檢測。實驗分組：A組（單純培養(yǎng)），B組（機械化學損傷組），C組（B組中加入3ug/ml麝香酮），D組（B組加入6ug/ml麝香酮），E組（B組加入12ug/ml麝香酮），在3h、6h、12h時檢測 SOD、MDA、LDH及細胞內(nèi)Ca2+。結(jié)果：獲得了95%以上的高純度的脊髓星形膠質(zhì)細胞。建立了大鼠原代脊髓星形膠質(zhì)細胞機械化學損傷模型。SOD檢測提示：A組無明顯的變化，B組明顯的下降，C、D、E組比B組高，以D組在同一時間點最明顯。MDA檢測提示A組無明顯的變化，B組比A組升高，C、D、E組比B組明顯低，D組在同一時間點最低。細胞內(nèi)鈣檢測與MDA有類似的變化，C、D、E組與A組和B組有顯著性差異（P<0.05）。結(jié)論：不同濃度的麝香酮對機械-化學損傷的星形膠質(zhì)細胞都有保護作用，以6ug/ml濃度效果最好。

【關(guān)鍵詞】麝香酮，星形膠質(zhì)細胞，炎癥反應，保護

創(chuàng)傷性脊髓損傷（trauma spinal cord injury， SCI）的發(fā)病率有逐漸升高的趨勢 [1]，SCI 及其繼發(fā)性損傷可直接導致神經(jīng)功能損傷，出現(xiàn)不同程度的功能障礙，并且脊髓損傷治療困難[2]， 因此致殘率與致死率非常高[3] 。脊髓損傷后炎癥因子會刺激星形膠質(zhì)細胞的增殖和活化[4]。過度生長的星形膠質(zhì)細胞也會形成膠質(zhì)疤痕，作為物理和化學屏障阻止神經(jīng)元軸突再生[5]。減輕繼發(fā)性損傷的關(guān)鍵是保護損傷細胞，抵抗炎癥，減少星形膠質(zhì)細胞的增殖。麝香酮具有類似糖皮質(zhì)激素的抗炎作用。它能抑制中性粒細胞釋放炎癥因子，降低鈣強度[6]。通過血腦屏障，提高中樞神經(jīng)系統(tǒng)的耐缺氧能力，減輕水腫。Yu等人的Invitro實驗表明，麝香酮可以減少LDH的釋放，抑制鈣的流入，并提高細胞在超劑量Glu處理的PC-12細胞中的存活率[7]。Jin等人的實驗表明，麝香酮可以減輕腦缺血的水腫，減輕腦細胞的病理變化[8]，說明麝香酮具有一定的抗炎作用和對中樞神經(jīng)系統(tǒng)的保護作用。

本實驗中選用大鼠脊髓原代星形膠質(zhì)細胞進行體外培養(yǎng)，并建立損傷模型，運用不同濃度的麝香酮對星形膠質(zhì)細胞損傷作用，檢測TNF-α、IL-1B、SOD、MDA，LDH、細胞內(nèi)鈣的測量及對細胞進行計數(shù)，探討麝香酮對脊髓星形膠質(zhì)細胞保護作用。

1.材料與方法

1.1原代脊髓星形膠質(zhì)細胞的分離及純化

取新生乳鼠10只無菌條件下剪刀斷頭，打開脊椎后完整取出脊髓組織。將脊髓組織剪碎致直徑0.1mm左右小塊化學消化收集細胞懸液。棄去上清液，然后每管加入2-3 ml含10%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基，接種于培養(yǎng)瓶中，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)孵育60分鐘，進行差速粘附貼壁處理，以去除成纖維細胞。 24小時后翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶收集的貼壁細胞，繼續(xù)培養(yǎng)即可得純度達到95%以上的星形膠質(zhì)細胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，生長8-10d待細胞融和，隨后使用本次獲得的細胞進行傳代，用于后繼實驗。

1.2免疫熒光染色法行細胞的鑒定：膠質(zhì)纖維酸性蛋白（GFAP）

細胞準備好后進行 細胞鋪片， 吸除培養(yǎng)瓶中舊培養(yǎng)基，用PBS洗2-3次，加入0.25%胰酶消化液約1-3ml進行消化，置37℃培養(yǎng)箱靜置約2-5分鐘，加入2-3ml完全培養(yǎng)基，收集細胞至離心管，離心5min，棄上清加培養(yǎng)液，調(diào)整細胞密度為1*106個/ml，以每孔0.5ml接種到6孔板的蓋玻片上。待細胞12h貼壁后，吸出培養(yǎng)基，生長達到70%-80%，最后爬片固定，中性樹膠封片。

1.3星形膠質(zhì)細胞的機械化學損傷模型

（1）建立星形膠質(zhì)細胞機械損傷模型

待細胞貼壁后用1ml無菌注射器針頭，在4倍放大鏡下進行直線劃傷培養(yǎng)皿中脊髓星形膠質(zhì)細胞，整個過程要求力度適中以保證損傷較為一致。于六孔板呈“井”字劃傷，劃痕線之間的平行間距為0.2mm，細胞損傷前30min加入不同濃度的麝香酮進行藥物預處理劃。傾斜培養(yǎng)皿，極其輕柔的吸去劃傷后所有的培養(yǎng)基。

（2）星形膠質(zhì)細胞的機械化學損傷模型

在機械損傷模型中加入500umol/L谷氨酸造成細胞機械化學損傷模型。常規(guī)繼續(xù)培養(yǎng)。在加入Glu前30 min加入3 ug/ml、6 ug/ml、12 ug/ml 的麝香酮進行藥物預處理。

（3）損傷模型的鑒定

臺盼藍染色法測定細胞死亡率

在三分鐘內(nèi)，分別計數(shù)活細胞和死細胞。鏡下觀察死細胞被染成明顯的藍色，而活細胞拒染呈無色透明狀。 統(tǒng)計細胞活力：活細胞率（%）= 活細胞總數(shù)/（活細胞總數(shù)+死細胞總數(shù)）×100%。細胞死亡率的計算：細胞死亡率（%）=死細胞數(shù)/（活細胞數(shù)+死細胞數(shù)）×100%。

（4）星形膠質(zhì)細胞的實驗分組

A組（單純培養(yǎng)），B組（機械化學損傷后繼續(xù)培養(yǎng)），C組（B組加入3ug/ml麝香酮500ul/孔），D組（B組加入6ug/ml麝香酮500ul/孔），E組（B組加入12ug/ml麝香酮500ul/ml孔）.

（5）監(jiān)測指標

在不時的時間點采用ELISA 法對對MDA、SOD檢測和流式檢測法細胞內(nèi)Ca2+的濃度。

（6）統(tǒng)計學處理

采用SARS9.0統(tǒng)計軟件包進行分析，所有數(shù)據(jù)以±s表示，組間比較采用單因素方差分析，P值<0.05為有統(tǒng)計學意義。

2.結(jié)果

2.1獲取高純度的脊髓星形膠質(zhì)細胞

在更換培養(yǎng)液時行10秒短期暴露與差速貼壁法相結(jié)合的方法，獲取了純化后的脊髓星形膠質(zhì)細胞。采用膠質(zhì)纖維酸性蛋白（GFAP）免疫化學細胞染色鑒定，在培養(yǎng)3天時在光鏡下觀察見星形膠質(zhì)細胞主要呈梭形、不規(guī)則形態(tài)或星形，細胞質(zhì)豐富、細胞核大，染色質(zhì)淺而均勻，多為1個核仁，偶見有2個核仁。其膠質(zhì)細胞純度達95%以上。 （圖1）。

2.2成功建立了原代星形膠質(zhì)細胞機械化學損傷模型

采用臺盼藍染色法測定細胞死亡率。正常組培養(yǎng)6小時、24小時未見死亡細胞。在6小時機械損傷模型死亡率在13.23%，細胞存活率87.73%;在機械化學損傷模型后死亡率在21.12%，細胞存活率78.88%;24小時，在機械損傷模型死亡率在23.57%，細胞存活率76.43%;在機械化學損傷模型后死亡率在36.27%，細胞存活率63.73%。

2.3細胞流式法檢測細胞內(nèi)Ca2+

正常組在同一時間點最低，有緩慢上升; 模型損傷組明顯增加，在3h、6h、12h熒光值分為22.67、30.00、31.03，處理組中都明顯的下降，以D組在同一時間點最明顯，在分別為17.21、25.21，25.31。 （圖2）

2.4 ELISA法檢測丙二醛（MDA及超氧化物歧化酶（SOD）

脊髓星形膠質(zhì)細胞在體外培養(yǎng)過程中，正常組無明顯的變化，機械化學損傷組較正常組明顯的下降在3h、6h、12h，分為72.11 ng/L、76.55ng/L、85.56ng/L，處理組中都明顯的下降，以麝香酮6ug/ml組在同一時間點最明顯，在3h、6h、12h達55.56 ng/L、51.89ng/L，78.94ng/L。處理組與正常組和損傷組有顯著性統(tǒng)計學差異（圖3）。脊髓星形膠質(zhì)細胞在體外培養(yǎng)過程中，正常組無明顯的變化，機械化學損傷組明顯下降在3h、6h、12h，分為28.52 ng/L、24.53ng/L、22.33ng/L，處理組中都明顯的提升，以麝香酮6ug/ml組在同一時間點最明顯，在3h、6h、12h達46.74 ng/L、42.01ng/L，38.33ng/L。處理組與正常組及損傷組有顯著性統(tǒng)計學差異（P<0.01）。（圖4）

3.討論

3.1細胞培養(yǎng)與鑒定

對原代神經(jīng)細胞培養(yǎng)研究，是研究脊髓損傷機制的主要方法之一[1]。脊髓損傷后所引起的一系列炎性反應及對傷脊髓的保護作用，很大程度上通過星形膠質(zhì)細胞起作用。獲得較為單一高純度的星形膠質(zhì)細胞是進行深入研究的基礎，選用新生大鼠也有利于獲得高純度的星形膠質(zhì)細胞， 因為星形膠質(zhì)細胞的分裂高峰發(fā)生在動物胚胎晚期及出生以后[9]。差速貼壁法[10]是利用星形膠質(zhì)細胞、成纖維細胞與嗅鞘細胞的貼壁時間不同而將它們分離的方法。成纖維細胞的貼壁能力強，在未被包被的光滑玻璃平面上，在細胞接種1小時之內(nèi)就可直接貼壁，星形膠質(zhì)細胞一般在接種的24h左右貼壁，而嗅鞘細胞則需要96-120h內(nèi)貼壁。本實驗選擇，通過兩次恒度搖床振蕩，神經(jīng)細胞、少軸突細胞、小膠質(zhì)細胞。星形膠質(zhì)細胞能在無培養(yǎng)液狀態(tài)下能成活40小時[11]，將培養(yǎng)液吸干換液時，使培養(yǎng)細胞暴露于空氣中10秒鐘可以除去少突膠質(zhì)細胞[12]。但是為了提高星形膠質(zhì)細胞的生存能力、活性及傳代能力，在更換培養(yǎng)液時注意避免過長的暴露時間。因為一般在原代培養(yǎng)時采用相對較低的接種密度，因神經(jīng)元不再分裂增殖，且傳代后大多會死去。

本實驗采用星形膠質(zhì)細胞標志性蛋白：膠質(zhì)纖維酸性蛋白（GFAP）行行細胞免疫化學染色來鑒定，通過計數(shù)統(tǒng)計，星形膠質(zhì)細胞的純度達95%，獲得了純度較高的星形膠質(zhì)細胞，能滿足本次實驗的要求。若要得到純度更高的星形膠質(zhì)細胞，而又不影響星形膠質(zhì)細胞的培養(yǎng)，可采用聚合酶鏈反應法 。

3.2細胞損傷模型的選擇

本實驗通過張杰敏[12]等提供的方法成功的建立體外星形膠質(zhì)細胞機械損傷模型[16]，直接的損傷致壞死，損傷緣的膠質(zhì)增生肥大明顯，對于未損傷區(qū)，細胞形態(tài)正常，說明損傷的程度不重，而選用20ul移液器吸頭作劃傷時的工具，有大量的膠質(zhì)細胞被拖至劃痕的尾端，實驗損傷的程度不重，后改用針頭后檢測量SOD、MDA較前有明顯變化?？紤]到單純機械損傷因沒有與其它細胞共培養(yǎng)，培養(yǎng)缺乏在體損傷時可因神經(jīng)元損傷，在多種因素介導下出現(xiàn)谷氨酸的增加，不能模擬其脊髓損傷后的病理狀態(tài)，同時單獨作谷氨酸誘導下的的化學損傷，可能又缺少機械因素下的細胞直接的損傷，及損傷所誘導下的病理生理變化，都不能很好的模擬臨床上的微環(huán)境變化，故本實驗選用了機械損傷后再加入谷氨酸，建立了脊髓星形膠質(zhì)細胞機械化學損傷模型，進行研究。

3.3麝香酮的作用效果

在機械化學損傷下，脊髓星形膠質(zhì)細胞出現(xiàn)機械性損傷造成細胞原發(fā)性損傷，LDH是細胞無氧酵解過程中的一種關(guān)鍵酶，在機械化學損傷的作用下，當細胞膜完整性遭到破壞時，細胞膜通透性增高，胞的大量LDH從漿中釋放到細胞外，并與細胞損傷程度呈正相關(guān)。因此，將LDH釋放量作為評價星形膠質(zhì)細胞受損傷的一般指標。同時培養(yǎng)液中大量的谷氨酸和機械損傷所引起的細胞損害，激活了細胞膜上的谷氨酸轉(zhuǎn)動蛋白，鈣內(nèi)流增加致，線料體內(nèi)的鈣增加，引起細胞膜及細胞器脂質(zhì)代謝異常，細胞膜及細胞器脂代謝產(chǎn)物MDA大量產(chǎn)生，自由基大量釋放，消耗了大量的SOD，出現(xiàn)SOD急劇下降。觸發(fā)星形膠質(zhì)細胞增生，釋放TNF-α等炎癥因子，又反饋加重細胞損傷。而這類炎癥因子可以作為炎癥反應被激活的標志物。

麝香酮是一種有效的抗炎劑，能降低免疫炎癥細胞因子，包括IL-6、IL-B、TNF-α、基質(zhì)金屬蛋白酶、環(huán)氧化酶、NO等的水平， PC12細胞降低鈣內(nèi)流。本次實驗結(jié)果顯示，3-12ug/ml麝香酮處理后都減少由機械化學損傷所致的的細胞損傷，降低了LDH漏出，抑制了MDA的釋放，增加了SOD產(chǎn)量。麝香酮能明顯抑制機械化學損傷所引起的脊髓膠質(zhì)細胞的炎癥反應。但其作用機制不清楚，需進一步深研究。

（通訊作者：桂菲）

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項目基金：課題來源于重慶市科委自然基金，基金號：cstc2016jcyjA0299。

作者簡介：郭亮，1975-，男，重慶人，博士，骨科副教授/副主任醫(yī)師，研究方向：脊柱脊髓的損傷，主要從事脊柱外科疾病的診治及髖/漆關(guān)節(jié)置換手術(shù)，頸、腰椎退變中醫(yī)藥治療。