何浩延 黃恩奇 黎柱均 舒博文 徐邦牢 劉大漁

摘要現(xiàn)有細(xì)菌定量檢測多依賴專業(yè)實(shí)驗(yàn)室，檢測周期較長。針對此問題，本研究基于微流控芯片液滴數(shù)字化分析，建立了一種細(xì)菌定量檢測方法。采用具有平行液滴分析單元的微流控芯片，其特點(diǎn)在于使用了注射器真空驅(qū)動液滴產(chǎn)生方法。借助刃天青顯色反應(yīng)引起的熒光強(qiáng)度改變，可指示液滴內(nèi)活性細(xì)菌的存在。通過計算細(xì)菌陽性液滴的比例，采用泊松分布算法，計算出原始樣品中的細(xì)菌密度。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，本方法可在3.5 h內(nèi)完成細(xì)菌定量分析，動態(tài)檢測范圍為105～108 CFU/mL，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）低于5%。本方法具有操作簡便和分析速度快的優(yōu)勢，有望廣泛用于細(xì)菌快速定量檢測。

關(guān)鍵詞微流控芯片; 液滴數(shù)字化分析; 注射器真空; 細(xì)菌; 定量檢測

1引 言

細(xì)菌定量檢測對于食品安全、環(huán)境監(jiān)測和疾病診斷均具有重要作用。由于細(xì)菌定量檢測經(jīng)常在資源有限的情況下進(jìn)行，而且對于檢測時間要求很高，因此需要簡便快速的檢測方法。目前，用于細(xì)菌定量檢測的方法主要包括培養(yǎng)計數(shù)法[1，2]、熒光定量分析PCR[3]、流式細(xì)胞術(shù)[4，5]等，以及一些基于新型生物傳感器的檢測方法[6]。這些技術(shù)仍存在一定的局限性，如檢測周期較長、操作步驟繁瑣、依賴于大型設(shè)備和專業(yè)技術(shù)人員[7，8]。因此，迫切需要建立操作簡便、分析快速的細(xì)菌定量檢測方法。

液滴數(shù)字化分析是近年發(fā)展起來的一種高精度定量分析方法。液滴數(shù)字化分析的原理是利用液滴技術(shù)將待測靶標(biāo)隨機(jī)分配到大量相互獨(dú)立的微滴中，每個液滴中最多含有一個靶細(xì)胞，每個微滴相當(dāng)于一個獨(dú)立的微反應(yīng)器; 繼而針對待測靶標(biāo)在微液滴中的直接或間接信號，區(qū)分陽性和陰性液滴。陽性微滴判讀為1，陰性微滴判讀為0[9，10]，可根據(jù)泊松分布[11]原理進(jìn)行計算，實(shí)現(xiàn)待測靶標(biāo)的絕對定量分析。與傳統(tǒng)的分析技術(shù)相比，液滴數(shù)字化分析最突出的特點(diǎn)是其具有不依賴標(biāo)準(zhǔn)品的絕對定量分析能力。此外，基于大規(guī)模液滴分散體系的數(shù)字化分析在檢測靈敏度和定量分析精度等方面也顯著優(yōu)于傳統(tǒng)定量分析方法。鑒于微流控技術(shù)是大規(guī)模液滴操控的有利工具，微流控芯片成為數(shù)字化液滴分析的主要平臺[11]。

自液滴數(shù)字化分析提出以來，此技術(shù)被廣泛用于多種類型的定量生物分析中， 包括核酸[12～16]、蛋白[17～19]和細(xì)胞分析[20～23]，以及數(shù)字化細(xì)菌分析。得益于微液滴對于反應(yīng)信號的相對富集作用，以及數(shù)字化分析方法的高檢測精度，數(shù)字化細(xì)菌分析在分析時間和定量分析精度等方面均顯著優(yōu)于傳統(tǒng)的細(xì)菌定量分析。 Boedicker等[24]利用阿爾瑪藍(lán)指示細(xì)菌活性，結(jié)合液滴數(shù)字化分析技術(shù)，最快可在2 h內(nèi)檢測出樣品中的活性細(xì)菌，并且能夠在7 h內(nèi)獲得細(xì)菌的耐藥性信息。Kang等[25]結(jié)合DNA酶傳感器與液滴數(shù)字化分析技術(shù)，能夠在3 h內(nèi)得到血液樣品中的細(xì)菌定量分析信息，其實(shí)際密度與理論值的相關(guān)性良好（R2=0.999），測定下限達(dá)到1 CFU/mL。Kaushik等[26]結(jié)合刃天青顯色原理與液滴數(shù)字化分析技術(shù)，將細(xì)菌與顯色體系限制在約20 pL的液滴中，能夠在1 h內(nèi)得到細(xì)菌的耐藥性信息。Scheler等[27]用含綠色熒光蛋白的大腸桿菌驗(yàn)證了液滴數(shù)字化分析的定量分析能力，與平板計數(shù)法結(jié)果的相關(guān)性良好（R2=0.9964），結(jié)合刃天青顯色法原理，在3～4 h得到樣品中細(xì)菌的耐藥性信息。

液滴數(shù)字化分析不依賴標(biāo)準(zhǔn)品的絕對定量分析能力，以及在靈敏度和定量分析精度方面的優(yōu)勢，非常有利于現(xiàn)場快速細(xì)菌檢測，然而，此技術(shù)在該領(lǐng)域的應(yīng)用還鮮有報道。其主要原因在于微流控芯片上的液滴發(fā)生多依賴基于氣壓或注射泵等流體驅(qū)動裝置， 這類裝置體積較大且操作繁瑣，難以應(yīng)用于現(xiàn)場快速檢測[26，28]。相比較而言，正壓驅(qū)動液滴發(fā)生方式使用廣泛，文獻(xiàn)已經(jīng)報導(dǎo)了基于負(fù)壓的液滴發(fā)生方法[29～32]。在負(fù)壓驅(qū)動的液滴發(fā)生體系中，僅需要一個簡單的注射器即可驅(qū)動油水兩相液體流動，并發(fā)生液滴。這種液滴發(fā)生方法操作簡便，無需復(fù)雜結(jié)構(gòu)流體控制設(shè)備，因而有望將液滴數(shù)字化細(xì)菌分析拓展到現(xiàn)場快速檢測領(lǐng)域。

微流控芯片技術(shù)在生物樣品分析中得到廣泛的應(yīng)用[33]。 本研究基于負(fù)壓驅(qū)動液滴微流控芯片，建立了一種細(xì)菌定量檢測方法。采用具有平行液滴分析單元的微流控芯片，其特點(diǎn)在于使用了注射器真空驅(qū)動的流動聚焦式液滴發(fā)生方法[34]。利用單個注射器，即可實(shí)現(xiàn)多個分析單元中的快速平行液滴發(fā)生和捕獲。以大腸桿菌為模式分析對象，借助刃天青顯色反應(yīng)，實(shí)現(xiàn)數(shù)字化液滴細(xì)菌定量分析。依據(jù)顯色反應(yīng)陽性液滴的比例，使用泊松分布原理計算原始樣品中的大腸桿菌密度。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，本方法具有操作簡便和分析速度快的優(yōu)勢，有望用于細(xì)菌的現(xiàn)場快速定量檢測。

2實(shí)驗(yàn)部分

2.1儀器與試劑

IX71倒置熒光顯微鏡（日本Olympus公司）; 麥?zhǔn)媳葷醿x（梅里埃公司）; PH030A型干燥箱（上海一恒公司）; URE2000/35深紫外光刻機(jī)（中國科學(xué)院光電技術(shù)研究所）; KS180EI 超聲波清洗機(jī)（寧波海曙科生公司）; Spin Master51 甩膠機(jī)（上海凱美特公司）; PDCM等離子體清洗機(jī)（成都銘恒公司）。

H2SO4（98%）、H2O2（30%）（廣州化學(xué)試劑廠）; SU8 3025光刻膠及顯影液（美國Microchem公司）; 聚二甲基硅氧烷（PDMS）前體和引發(fā)劑（美國 Dow Corning公司）; 十六烷和礦物油（上海生工公司）; ABIL EM90 表面活性劑（德國Degussa AG公司）;

2.2微流控芯片

微流控芯片包含具有圖形化結(jié)構(gòu)的PDMS頂層和無結(jié)構(gòu)的玻璃底層（圖1）。PDMS層包含一組6個輻射狀排列分析單元，匯聚于同一出口，即負(fù)壓施加點(diǎn)。每個單元包括上游的液滴發(fā)生器以及下游的液滴儲存池。PDMS層使用標(biāo)準(zhǔn)光刻倒模工藝加工[35]，等離子處理后，與玻璃底層封接。加工完成的芯片經(jīng)紫外線照射1 h，并于使用之前保存1周。與芯片連接的特氟龍毛細(xì)管經(jīng)高壓消毒后保存?zhèn)溆谩?/p>

2.3實(shí)驗(yàn)方法

2.3.1樣品準(zhǔn)備將細(xì)菌懸液與MH肉湯以1∶9 （V/V）比例加入無菌試管，獲得梯度密度細(xì)菌懸液。將107 CFU/mL菌液5倍倍比稀釋，獲得一組5個梯度密度細(xì)菌懸液。實(shí)驗(yàn)前，向待測樣品溶液中加入刃天青儲備液至終濃度為400 μmol/L，另外以1∶50 （V/V） 比例加入ProLong Live抗淬滅劑。在3組平行實(shí)驗(yàn)中，對這5個梯度密度細(xì)菌懸液進(jìn)行同步液滴數(shù)字化顯色分析。

2.3.2液滴數(shù)字化顯色分析液滴數(shù)字化顯色分析流程如圖2所示，具體操作如下：（1）使用特氟龍毛細(xì)管將注射器與芯片出口連接，將樣品溶液和油相溶液分別加載到芯片的樣品池和油相池; （2）拉動注射器針柄，利用注射器真空產(chǎn)生的負(fù)壓驅(qū)動油相和水相溶液流動，引發(fā)液滴發(fā)生。待液滴充滿液滴收集池，于芯片出口端剪斷特氟龍管; （3）將芯片轉(zhuǎn)入培養(yǎng)皿，用石蠟油淹沒，37℃下孵育一定時間; （4）用熒光顯微鏡觀察芯片并成像，使用Image J軟件計數(shù)刃天青顯色反應(yīng)陽性液滴數(shù)（n1）和陰性液滴數(shù)（n2）。樣品中細(xì)菌密度D（CFU/mL）=

2.3.3平板計數(shù)用生理鹽水將2.3.1節(jié)制備的5個梯度密度細(xì)菌懸液分別10倍倍比稀釋7次。每份細(xì)菌懸液用平板計數(shù)法平行檢測3次，每次取1 mL樣品加入到培養(yǎng)皿中。培養(yǎng)皿中加入適量溶解的營養(yǎng)瓊脂，搖勻后，室溫下固化，37℃培養(yǎng)24 h。依據(jù)GB4789.22016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)，食品微生物學(xué)檢驗(yàn)，菌落總數(shù)測定》的原則，選取各組中具有適宜菌落數(shù)目的平板進(jìn)行計數(shù)，并計算平均值，再根據(jù)稀釋倍數(shù)推算出原始樣品的細(xì)菌密度。

3結(jié)果與討論

3.1注射器真空驅(qū)動的液滴發(fā)生

在注射器真空作用下，液滴分析單元的末端壓力接近于0，而入口端液面壓力為1個大氣壓，這種壓力差存在于每個分析單元。因此，利用一個注射器可實(shí)現(xiàn)多個分析單元內(nèi)的同步液滴發(fā)生。在大氣壓驅(qū)動下，水相和油相共同進(jìn)入芯片通道。在十字型通道結(jié)構(gòu)液滴發(fā)生器處，油相剪切力作用于水相，因而將水相切割為液滴。液滴的尺寸由液滴發(fā)生器處通道尺寸以及油相和水相的流速決定。對于注射器真空驅(qū)動的液滴發(fā)生，由于壓力是恒定的，液滴發(fā)生頻率和液滴尺寸主要通過調(diào)節(jié)通道尺寸實(shí)現(xiàn)。

本實(shí)驗(yàn)中，液滴發(fā)生器十字型通道的尺寸為：水相孔徑20 μm，油相孔徑175 μm，深度40 μm。在注射器真空驅(qū)動下，6個平行單元的液滴發(fā)生頻率介于180～193 Hz之間，生成的液滴可在3 min內(nèi)充滿液滴收集池。成像分析（圖3）顯示，收集池內(nèi)液滴變化范圍介于25.69～33.01 μm之間，每個單元內(nèi)的液滴體積相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）<2%，均符合正態(tài)分布（p>0.05）。由此可見，這種注射器真空驅(qū)動發(fā)生的液滴均一性較好，滿足數(shù)字化分析要求。不同分析單元的液滴體積偏差的原因是單元內(nèi)流動阻力的細(xì)微差異造成的流速差異。由于液滴數(shù)字化分析引入了體積校正，不同單元內(nèi)液滴體積的偏差并不影響定量分析結(jié)果。

3.2液滴反應(yīng)體系的穩(wěn)定性

PDMS材質(zhì)芯片在長時間培養(yǎng)中存在水分遷移問題[36]。如圖4所示，原生PDMS芯片中的液滴在連續(xù)培養(yǎng)中體積持續(xù)降低，3 h內(nèi)液滴體積可減少95%以上，提示存在水相油相PDMS的水蒸汽遷移途徑。本研究從兩個方面采取措施，有效控制水分遷移問題：一是芯片底層采用密閉的玻璃材料，部分降低蒸發(fā)效應(yīng); 二是在PDMS頂層覆蓋礦物油，降低蒸發(fā)。如圖4所示，在優(yōu)化的芯片反應(yīng)條件下，37℃孵育3 h后，液滴體積只降低了13.54% ± 5.65%; 孵育6 h后，液滴體積也只降低了20.79% ± 4.68%。

實(shí)驗(yàn)中還發(fā)現(xiàn)了油水界面成分串?dāng)_問題。在使用7500氟化油、十六烷和石蠟油的液滴體系中，均發(fā)現(xiàn)細(xì)菌穿梭于油水界面（圖5）以及液滴內(nèi)刃天青的油相擴(kuò)散（圖6），明顯影響了液滴顯色實(shí)驗(yàn)的穩(wěn)定性和靈敏度。這些現(xiàn)象的產(chǎn)生可能是由于油水界面的屏蔽作用不足。本研究通過調(diào)整表面活性劑濃度改善液滴穩(wěn)定性。結(jié)果表明，即使增加表面活性劑濃度，也不能完全消除7500氟化油、十六烷液滴體系存在的成分串?dāng)_，但添加3% ABIL EM90的石蠟油則可完全杜絕此問題。這是因?yàn)橥獗砻婊钚詣┰鰪?qiáng)了油水界面的穩(wěn)定性，同時石蠟油具有較高的粘度，遏制了細(xì)菌游出。

3.3液滴內(nèi)的細(xì)菌指示顯色反應(yīng)

液滴細(xì)菌顯色反應(yīng)以刃天為指示劑。刃天青指示細(xì)菌活性的原理是：在活性細(xì)菌的多種還原酶作用下，無熒光的刃天青轉(zhuǎn)變?yōu)橛袩晒獾脑圎u靈。鑒于液滴內(nèi)細(xì)菌數(shù)量對于顯色反應(yīng)信號強(qiáng)度的影響，顯色反應(yīng)條件的優(yōu)化均使用單細(xì)菌分散體系。本研究借助Syto 9染色，確定了適宜的輸入細(xì)菌密度為1.5×106 CFU/mL。 在此輸入密度下，理論上，100%的液滴內(nèi)細(xì)菌數(shù)≤1，即每個液滴最多包裹1個細(xì)菌。

測定了刃天青顯色信噪比相對孵育時間的變化，由圖7A可見，培養(yǎng)2 h后，開始出現(xiàn)顯著區(qū)別于噪聲的熒光（+）信號。根據(jù)圖7A的結(jié)果分析培養(yǎng)5 h的陽性液滴數(shù)量穩(wěn)定時間，如圖7B所示，3.5 h后，陽性液滴數(shù)不再增加，因此，后續(xù)實(shí)驗(yàn)均采用3.5 h作為反應(yīng)終點(diǎn)時間。相較于傳統(tǒng)試管方法12 h左右的顯色反應(yīng)時間，液滴顯色反應(yīng)所需時間大幅縮短，這得益于液滴分散對于樣品和顯色信號的相對富集效應(yīng)。在液滴分散體系內(nèi)只有部分液滴內(nèi)包裹細(xì)菌，相應(yīng)地液滴顯色反應(yīng)結(jié)果表現(xiàn)為“全”或“無”的形式，而宏觀反應(yīng)體系呈現(xiàn)的是平均反應(yīng)強(qiáng)度。對于包裹細(xì)菌的液滴，液滴內(nèi)細(xì)菌密度較宏觀體系提高。例如，直徑30 μm的液滴中包含單個細(xì)菌情況下，液滴內(nèi)細(xì)菌密度約為9×106 CFU/mL，其密度相對于106 CFU/mL密度的細(xì)菌懸液提升9倍，而相對于105 CFU/mL的細(xì)菌懸液提升了90倍。由于液滴的封閉效應(yīng)，液滴內(nèi)的顯色信號快速蓄積，因而可在較短時間內(nèi)達(dá)到檢測限。由于不同種類細(xì)菌存在代謝活性差異，這種液滴數(shù)字化顯色分析方法的普適性需要通過測試更多種類細(xì)菌進(jìn)行驗(yàn)證。

為了驗(yàn)證液滴刃天青顯色方法對于細(xì)菌的特異性指示效果，借助圖像指示，在1個液滴細(xì)菌分散體系內(nèi)隨機(jī)抽取100個不含菌的液滴和100個含活性菌液滴，使用非參數(shù)秩和檢驗(yàn)分析了兩組液滴內(nèi)熒光強(qiáng)度的差異。結(jié)果表明，兩組細(xì)菌的顯色信號具有顯著性差異（p<0.05），提示液滴刃天青顯色法可特異性指示活性細(xì)菌 。

3.4液滴數(shù)字化分析對細(xì)菌定量分析效果的評價

選取5倍系列稀釋獲得的一系列梯度密度細(xì)菌懸液進(jìn)行液滴數(shù)字化分析，并與平板接種計數(shù)方法進(jìn)行了相關(guān)性分析。由圖8可見，液滴數(shù)字化分析獲得的系列細(xì)菌密度與理論濃度具有良好的線性關(guān)系（R2=0.99）。相關(guān)性分析結(jié)果表明，在105 ～108 CFU/mL范圍內(nèi)，液滴數(shù)字化方法測定的每個樣品密度的RSD均小于5%，表明本方法具有良好的定量分析精度，液滴數(shù)字化分析與平板接種計數(shù)所獲得的定量分析結(jié)果一致。

液滴數(shù)字化分析的定量分析效果取決于分散體系的規(guī)模，分散單元的數(shù)目越多，定量分析范圍越寬，分析精度也越高。為了分析單元數(shù)目和每個單元內(nèi)液滴數(shù)目，本研究發(fā)展的液滴數(shù)字化分析使用了約4×104左右的液滴數(shù)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，已經(jīng)可獲得足夠的定量分析精度。如引入在線或離線樣品預(yù)富集方法，采用本方法可望分析更低密度的細(xì)菌樣品，。后續(xù)將進(jìn)行更多種類細(xì)菌的測試，以評價方法在細(xì)菌分析中應(yīng)用的普適性。

4結(jié) 論

建立了一種基于微流控液滴數(shù)字化顯色分析的細(xì)菌快速定量分析方法。利用注射器真空發(fā)生液滴，操作簡便可靠; 芯片采用平行分析單元設(shè)計，可提供適宜的測試通量。本方法定量分析精度高，定量分析RSD低于5%; 分析時間短，可在3.5 h內(nèi)獲得細(xì)菌定量分析信息。上述特點(diǎn)使得這種細(xì)菌定量分析方法非常適用于資源有限條件下的細(xì)菌快速檢測。

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