毛翠萍 林垚 牛倩 薛乘風(fēng) 顏曉梅

摘要基于納米顆粒固有的多分散性，對(duì)其粒徑及分布快速地進(jìn)行高分辨表征是納米顆粒相關(guān)研究和產(chǎn)品開(kāi)發(fā)所面臨的重大挑戰(zhàn)。與電子顯微鏡、原子力顯微鏡、動(dòng)態(tài)光散射、納米顆粒追蹤分析等常規(guī)使用的納米顆粒表征技術(shù)相比，流式細(xì)胞術(shù)具有可單顆粒檢測(cè)、快速、多參數(shù)、統(tǒng)計(jì)精確性高等優(yōu)勢(shì)。然而，由于檢測(cè)靈敏度的局限性，商品化流式細(xì)胞儀難以檢測(cè)粒徑小于200 nm的聚苯乙烯納米顆粒。結(jié)合瑞利散射和鞘流單分子熒光檢測(cè)技術(shù)，本研究組研制了納米流式檢測(cè)裝置 （Nanoflow cytometer， nFCM），采用單光子計(jì)數(shù)雪崩光電二極管 （Single photon counting avalanche photodiode， APD） 作為檢測(cè)器，低折射率二氧化硅納米顆粒 （SiO2 NPs） 的檢測(cè)下限可達(dá)到24 nm，可基線分辨47、59、74、94和123 nm的SiO2 NPs混合樣本。由于nFCM散射光檢測(cè)動(dòng)態(tài)范圍受限于單光子探測(cè)器的最大光子計(jì)數(shù)值，而納米顆粒的散射光強(qiáng)度隨粒徑的增大呈指數(shù)上升，為實(shí)現(xiàn)納米顆粒更全面的粒徑分布檢測(cè)，儀器的檢測(cè)動(dòng)態(tài)范圍有待提升。本研究采用激光光束整形、雙光闌降低背景信號(hào)、高量子效率光電倍增管檢測(cè)器等策略對(duì)儀器進(jìn)行多方位改進(jìn)，以研制高靈敏、寬動(dòng)態(tài)范圍的nFCM。改進(jìn)后的nFCM可實(shí)現(xiàn)直徑59 nm SiO2 NPs的高信噪比檢測(cè) （S/N = 119），可基線分辨59、74、94、123、160、180和222 nm的SiO2 NPs混合樣本，相比以APD為檢測(cè)器的nFCM，粒徑檢測(cè)范圍擴(kuò)展約100 nm， 并成功用于鼠傷寒沙門(mén)氏菌外膜囊泡 （Outer membrane vesicles， OMVs） 粒徑分布的快速測(cè)定。

關(guān)鍵詞單顆粒檢測(cè); 光散射; 粒徑分布; 納米流式檢測(cè)技術(shù); 細(xì)菌外膜囊泡

1引 言

了解天然生物納米顆粒（如病毒、細(xì)菌、亞細(xì)胞器、細(xì)胞外囊泡等）以及人工合成納米顆粒（如納米金、納米銀、二氧化硅納米顆粒、納米藥物等）的粒徑大小及其分布，在生物醫(yī)學(xué)、生化分析、能源材料、環(huán)境監(jiān)測(cè)等領(lǐng)域的研究中具有重要意義[1～9]。雖然透射電子顯微鏡、掃描電子顯微鏡、原子力顯微鏡等顯微技術(shù)能夠直觀、清晰地揭示納米顆粒的粒徑和形貌[10]，但是存在樣品制備繁瑣、測(cè)量速度慢、粒徑分布缺乏統(tǒng)計(jì)代表性等缺點(diǎn)?；诠庾酉嚓P(guān)光譜分析的動(dòng)態(tài)光散射技術(shù) （Dynamic light scattering， DLS） 能夠快速、準(zhǔn)確地測(cè)定分散于液體中單分散顆粒，但是對(duì)于粒徑分布范圍較寬的顆粒系，測(cè)量結(jié)果和可靠性較差。基于單顆粒散射示蹤的納米顆粒追蹤分析技術(shù) （Nanoparticle tracking analysis， NTA） 采用激光照射納米顆粒懸浮液，通過(guò)高速相機(jī)對(duì)視野中的顆粒進(jìn)行拍照，從而對(duì)每個(gè)顆粒的布朗運(yùn)動(dòng)軌跡進(jìn)行追蹤和分析，計(jì)算各自的流體力學(xué)半徑; 然而，顆粒粒徑分布相比于真實(shí)分布存在展寬，其準(zhǔn)確性和分辨率有待提升[11]。相較于上述技術(shù)，流式細(xì)胞術(shù) （Flow cytometry， FCM） 是一種對(duì)細(xì)胞或同等大小的顆粒進(jìn)行快速的單顆粒多參數(shù)檢測(cè)的技術(shù)，具有統(tǒng)計(jì)精確性高、數(shù)據(jù)可靠等優(yōu)點(diǎn)[12]。然而，商品化流式細(xì)胞儀的散射檢測(cè)下限是200～500 nm聚苯乙烯顆粒，難以滿足各種功能化納米顆粒以及病毒、細(xì)胞外囊泡等納米顆粒的粒徑表征需求[11]。

根據(jù)瑞利散射定律，當(dāng)球形納米顆粒的粒徑小于波長(zhǎng)的1/5時(shí)，其散射光強(qiáng)度隨粒徑的六次方衰減，當(dāng)納米粒子的粒徑從200 nm減小到40 nm或25 nm，其大小雖然只下降5倍或8倍，但是散射光強(qiáng)度卻降低15625倍或262144倍。結(jié)合瑞利散射和鞘流單分子熒光檢測(cè)技術(shù)，本研究組成功研制出納米流式檢測(cè)裝置 （Nanoflow cytometer， nFCM），將二氧化硅納米顆粒 （SiO2 NPs）、納米金顆粒 （AuNPs） 的散射檢測(cè)下限分別降低至24 nm和7 nm，較傳統(tǒng)流式細(xì)胞儀的散射檢測(cè)靈敏度提升4～5個(gè)數(shù)量級(jí)[13]。該裝置成功用于SiO2 NPs、納米金、細(xì)菌、線粒體、病毒、納米藥物、細(xì)胞外囊泡等納米顆粒粒徑及分布的高分辨表征[14～19]。nFCM通常使用光電倍增管 （Photomultiplier tubes， PMT） 或單光子計(jì)數(shù)雪崩光電二極管 （Single photon counting avalanche photodiode， APD） 作為檢測(cè)器。APD雖然靈敏度高，但是其最大光子計(jì)數(shù)值受限于APD的輸出脈沖寬度和死時(shí)間，在很大程度上限制了nFCM的動(dòng)態(tài)檢測(cè)范圍，難以對(duì)粒徑分布較寬的樣本（如粒徑分布30～1000 nm的細(xì)胞外囊泡）進(jìn)行全面的粒徑表征。相比之下，PMT雖然具有較寬的動(dòng)態(tài)范圍，但是量子效率較低，難以檢測(cè)粒徑小、低折射率的納米顆粒[20]。

針對(duì)細(xì)胞外囊泡、納米藥物等粒徑小、粒徑分布較寬的納米顆粒樣本的檢測(cè)，本研究研制了高靈敏、寬動(dòng)態(tài)范圍的納米流式檢測(cè)裝置，主要策略包括：（1）將圓形激光光斑整形為準(zhǔn)平頂光斑，以保證顆粒在通過(guò)激光探測(cè)區(qū)時(shí)受到強(qiáng)度更均一的照射; （2）聯(lián)合使用孔徑光闌與矩形光闌，最大程度抑制背景信號(hào); （3）采用高量子效率PMT，在寬動(dòng)態(tài)檢測(cè)范圍條件下實(shí)現(xiàn)弱散射光信號(hào)的檢測(cè)。此裝置成功地應(yīng)用于折射率小、異質(zhì)性大的細(xì)菌外膜囊泡 （Outer membrane vesicles， OMVs） 的粒徑分布測(cè)定。

2實(shí)驗(yàn)部分

2.1儀器與試劑

nFCM的光路如圖1A所示，488 nm 激光器（20 mW，美國(guó)Coherent公司）發(fā)出的高斯光束經(jīng)過(guò)反光鏡M反射后被二元光學(xué)元件 （Binary optical element， BOE）[21]整形，再經(jīng)消色差膠合透鏡L聚焦成為10 μm × 5 μm的準(zhǔn)平頂光斑。單個(gè)納米粒子穿越激光探測(cè)區(qū)所發(fā)出的光信號(hào)被顯微鏡物鏡O（日本尼康公司，40×）收集后，由FF500Di01二向色分光鏡DicF（美國(guó)Semrock公司）分為兩束光路（根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求，可旋轉(zhuǎn)DicF，使光束進(jìn)入相應(yīng)檢測(cè)器），波長(zhǎng)<500 nm的光被反射至PMT R928或者H7422PA40（日本濱松公司）進(jìn)行散射檢測(cè)，而波長(zhǎng)>500 nm的光經(jīng)過(guò)FF01520/35帶通濾波片BP（美國(guó)Semrock公司）后，被第二個(gè)PMT R928接收，進(jìn)行熒光檢測(cè)。各檢測(cè)器輸出的電信號(hào)經(jīng)過(guò)數(shù)據(jù)采集卡（美國(guó)National Instruments公司）進(jìn)行A/D轉(zhuǎn)換，信號(hào)采集和數(shù)據(jù)處理軟件均由LabVIEW語(yǔ)言編程。

FEITecnai F20透射電子顯微鏡（德國(guó)TVIPS公司）;BC106NVIS/M光束質(zhì)量分析儀（美國(guó)Thorlabs公司）;5810R冷凍離心機(jī)（德國(guó)Eppendorf公司）;OptimaTM XE90超速離心機(jī)（美國(guó)Beckman Coulter公司）。

磷酸鹽緩沖液 （Phosphate buffer saline， PBS， pH 7.4）、LB肉湯培養(yǎng)基 （LB broth power）、LB肉湯瓊脂 （LB agar power），均購(gòu)自上海生工生物工程有限公司，實(shí)驗(yàn)用水為超純水。

2.2實(shí)驗(yàn)方法

2.2.1激光光束整形應(yīng)用于激光光束整形的二元光學(xué)元件 （BOE） 是一種具有臺(tái)階狀表面浮雕結(jié)構(gòu)的衍射光學(xué)器件，通過(guò)對(duì)入射光進(jìn)行相位調(diào)制，從而在輸出焦面上形成期望的光斑形貌，實(shí)驗(yàn)中所用BOE由清華大學(xué)尤政教授課題組饋贈(zèng)[21]。實(shí)驗(yàn)操作： 將BOE固定于三維平移臺(tái)上，并置于激光出射端，使用激光光束質(zhì)量分析儀對(duì)整形后的激光光斑進(jìn)行實(shí)時(shí)反饋，通過(guò)微調(diào)平移臺(tái)獲得期望的光斑形狀。以PMT R928為檢測(cè)器。

2.2.2雙光闌降低背景信號(hào)使用的光闌分別為可調(diào)孔徑光闌 （美國(guó)Thorlabs公司），最小孔徑為800 μm; 可調(diào)矩形光闌（北京大恒光電公司），安裝于檢測(cè)器前端，最小邊長(zhǎng)為100 μm。采用整形后的激光光束為激發(fā)光源，PMT R928為檢測(cè)器，且PMT增益電壓與2.2.1節(jié)無(wú)對(duì)應(yīng)關(guān)系。

2.2.3高量子效率PMT模塊提升靈敏度和動(dòng)態(tài)范圍檢測(cè)器為H7422PA40型PMT，光電陰極材料為GaAsP，在峰值波長(zhǎng)的最高量子效率 （Quantum efficiency， QE） 為40%。此模塊由電流輸出型光電倍增模塊及跨阻器構(gòu)成。為了對(duì)比新型PMT H7422PA40與傳統(tǒng)PMT R928（匹配高壓管座C1365401）的性能，這兩款PMT被對(duì)稱放置于光路的兩側(cè)，通過(guò)對(duì)二向色分光鏡順時(shí)針/逆時(shí)針旋轉(zhuǎn)相同角度， 將光信號(hào)反射至相應(yīng)檢測(cè)器，以相同的光程對(duì)同一樣本進(jìn)行檢測(cè)。在此實(shí)驗(yàn)中，以相同電流倍增率為標(biāo)準(zhǔn)分別設(shè)置兩款PMT的控制電壓，通過(guò)對(duì)比信噪比評(píng)估兩款PMT的靈敏度。采用整形后的激光光束為激發(fā)光源，兩款PMT均使用雙光闌降低背景信號(hào)。

2.2.4樣本準(zhǔn)備所使用的SiO2 NPs均由本研究組合成，檢測(cè)前用超純水稀釋，待用; 細(xì)菌OMVs來(lái)自于鼠傷寒沙門(mén)氏菌 （CMCC50115），由本實(shí)驗(yàn)室分離純化獲得。

3結(jié)果與討論

3.1激光光束整形

納米流式檢測(cè)裝置使用的激光器的發(fā)射光束為光強(qiáng)呈高斯分布的圓形光斑，當(dāng)樣本顆粒經(jīng)過(guò)流體動(dòng)力學(xué)聚焦后， 穿越激光探測(cè)區(qū)時(shí)，如若偏離樣品流中心線， 將會(huì)導(dǎo)致所受激光照射強(qiáng)度的差異，使得樣品信號(hào)展寬，從而增大樣品檢測(cè)的變異系數(shù) （Coefficient of variation， CV），導(dǎo)致儀器分辨率降低[22]。因此，為了提高儀器分辨率，使用BOE將直徑為0.7 mm的圓形激光光束（圖2A）整形為準(zhǔn)平頂光束（圖2B），并通過(guò)消色差雙膠合透鏡聚焦為10 μm × 5 μm光斑。以直徑222 nm的SiO2 NPs為試樣，考察激光整形前后nFCM的分辨率變化。透射電鏡的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，SiO2 NPs粒徑非常均一（（222 ± 3） nm， n=200）， CV僅為1.4%（圖2C）。圖2D1為整形前SiO2 NPs的散射光 （Side scattering， SS） 信號(hào)時(shí)序圖，每個(gè)峰代表單個(gè)納米顆粒穿越激光探測(cè)區(qū)所發(fā)出的散射光信號(hào)，1 min內(nèi)對(duì)上萬(wàn)個(gè)顆粒進(jìn)行檢測(cè)，散射信號(hào)強(qiáng)度為 （5718 ± 52） mV，散射信號(hào)峰面積的CV為8.2%（圖2D2）; 激光光束整形后，光強(qiáng)分布更加均一，SiO2 NPs散射信號(hào)強(qiáng)度略增（（5920 ± 27） mV，圖2E1），散射光信號(hào)峰面積統(tǒng)計(jì)直方圖更加符合對(duì)稱的正態(tài)分布且峰形變窄，CV下降至6.3%（圖2E2）。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，將圓形高斯光斑整形為準(zhǔn)平頂光斑，可提升儀器的分辨率。

3.2雙光闌降低背景信號(hào)

流式細(xì)胞儀的靈敏度主要取決于背景噪聲和信號(hào)檢測(cè)效率[23]。其中，散射通道的背景噪聲主要來(lái)自于激光探測(cè)區(qū)的界面（如光窗）散射以及鞘液雜質(zhì)顆粒的瑞利散射[12]。由于背景信號(hào)與探測(cè)區(qū)體積呈正比，研制納米流式檢測(cè)裝置的主要策略是減小探測(cè)區(qū)體積，同時(shí)使用可調(diào)節(jié)式孔徑光闌以限制石英池光窗散射信號(hào)進(jìn)入檢測(cè)器，從而提升檢測(cè)信噪比。然而，在使用可調(diào)節(jié)式孔徑光闌過(guò)程中，樣品信號(hào)和背景信號(hào)隨著光闌孔徑的減小而同時(shí)下降，在保持納米顆粒信號(hào)不變的情況下，最大程度降低背景信號(hào)是提升儀器靈敏度的關(guān)鍵。為了進(jìn)一步減少激光探測(cè)區(qū)鞘液及樣品流的瑞利散射背景，聯(lián)合使用孔徑光闌 （φ 0.8～12 mm） 和矩形光闌 （0.1 mm × 0.1 mm～12 mm × 12 mm）。由流通池照片（圖3A）可見(jiàn)到石英池光窗側(cè)壁（C1和C2）及樣品流中心顆粒的散射信號(hào)。圖3B為簡(jiǎn)化俯視光路圖，A為納米顆粒的有效信號(hào)點(diǎn)，B1AB2為樣品流及部分鞘液區(qū)域，B1C1及B2C2為鞘液區(qū)域。激光探測(cè)區(qū)的光信號(hào)被40×顯微鏡物鏡收集、經(jīng)二向色濾光片（圖中略去）和組合光闌后到達(dá)檢測(cè)器。首先，使用孔徑光闌限制來(lái)自于石英池兩側(cè)（C1和C2）及部分鞘液區(qū)域 （B1C1， B2C2） 的光線進(jìn)入檢測(cè)器，通過(guò)微調(diào)矩形光闌，僅使得樣品液及部分鞘流發(fā)出的光線能進(jìn)入檢測(cè)器，當(dāng)試樣顆粒信號(hào)基本不變而背景信號(hào)最低時(shí)，確認(rèn)為最佳光闌調(diào)節(jié)狀態(tài)。以222 nm SiO2 NPs為試樣，當(dāng)僅使用孔徑光闌時(shí)，背景信號(hào)強(qiáng)度≈180，樣品檢測(cè)信噪比為366（圖3C）; 同時(shí)使用孔徑光闌和矩形光闌時(shí)，背景信號(hào)強(qiáng)度降低至約30，樣品檢測(cè)信噪比提升至423（圖3D）。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，孔徑光闌及矩形光闌的聯(lián)合使用可有效降低背景信號(hào)，提高nFCM檢測(cè)裝置的靈敏度。

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