任珊珊

（國家圖書館，北京 100081）

空氣微生物廣泛存在于環(huán)境中，主要包括細(xì)菌、真菌、病毒等生命體，其中已發(fā)現(xiàn)的真菌有4萬余種，主要粒徑分布在3～100μm[1]。它們的存在不僅威脅人類健康，更會對古籍、檔案和文物等造成不可逆轉(zhuǎn)的損壞。近年來，針對空氣中真菌的研究已經(jīng)成為圖書館、檔案和文博行業(yè)的基礎(chǔ)研究內(nèi)容之一。故宮博物院采用平皿沉降法在各個庫房采樣，其中書畫組存放的東西司庫等8個庫房主要有枝孢霉，黃曲霉等霉菌[2]。三峽博物館文物庫房中空氣真菌主要種屬為曲霉屬（70%）和青霉屬（13%）[3]。放線菌、枝孢屬、青霉屬和鏈格孢屬等大量存在于魏晉五號壁畫墓的墓室空氣中，成為威脅磚壁畫保存的重要污染源[4]。中國農(nóng)業(yè)大學(xué)圖書館空氣中霉菌主要為青霉屬和曲霉屬[5]。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)設(shè)備與試劑

北京明杰藍(lán)天FA-1六級篩孔式空氣微生物采樣器，德國MEMMERT IPP200培養(yǎng)箱，上海博迅YXQ-LS-100G立式壓力蒸汽滅菌器，蘇州凈化SW-CJ-2FD雙人超凈臺，太倉強(qiáng)樂THZ-C型空氣恒溫振蕩器，德國SIGMA 3-30k離心機(jī)，日本Nikon 90i顯微鏡，美國Bio-Rad MyCylerPCR儀，北京六一DYY-6C電泳儀電源，上海精科WFH-201B紫外透射反射儀和四川優(yōu)普UPT-30L純水機(jī)等。

瓊脂糖、瓊脂、葡萄糖、Tris-硼酸和無水乙醇等（國藥試劑）；上樣緩沖液、DNA ladder和GoldView核酸染色劑（Solarbio）；乳酸酚棉藍(lán)染色劑（青島海博）；Taq聚合酶（Apexbio）；通用型基因組提取試劑盒、為世紀(jì)瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒（康為世紀(jì)）等。

1.2 樣品采集方法

2019年4月在國家圖書館古籍書庫進(jìn)行采樣。書庫配備有恒溫恒濕空調(diào)機(jī)組，用于控制書庫內(nèi)的溫度和相對濕度。采樣期間，書庫溫度為24℃，相對濕度為48%。采用撞擊式采樣法，參數(shù)設(shè)置為采樣速度28.3L/min，采樣2.5min。采樣時(shí)使用PDA培養(yǎng)基。培養(yǎng)基倒置放入生物培養(yǎng)箱。培養(yǎng)條件為28℃±1℃，培養(yǎng) 7d。

1.3 形態(tài)學(xué)分析方法

平板點(diǎn)植接種培養(yǎng)，每皿三點(diǎn)。新接種的培養(yǎng)基倒置于生物培養(yǎng)箱中，28℃±1℃，培養(yǎng)7d。培養(yǎng)結(jié)束后記錄菌落形態(tài)。取小塊真菌培養(yǎng)物置于載玻片，乳酸酚棉藍(lán)染色法染色后置于顯微鏡下觀察真菌菌絲和孢子的形態(tài)特征。

1.4 分子鑒定方法

提取樣品總DNA。使用通用型基因組DNA提取試劑盒，根據(jù)操作說明提取篩選出的真菌基因組DNA。提取后的DNA于-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

目標(biāo)片段擴(kuò)增（PCR）。使用真菌ITS PCR通用引物。ITS1:5’-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3’；ITS4:5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’。配置PCR 反應(yīng)體系。2XTaq-pcr MIX：25μL；ITS1(10μM)：2μL；ITS4(10μM)：2μL； 基因組 DNA：2μL；ddH2O：19μL， 總計(jì)50μL。反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃預(yù)變性5min；94℃變性 30s；55℃退火 30s；72℃延伸 1min；設(shè)定儀器后開始PCR擴(kuò)增試驗(yàn)，循環(huán)35次；72℃延伸10min。獲得PCR產(chǎn)物。

目標(biāo)片段的確定與回收。取PCR產(chǎn)物進(jìn)行2%瓊脂糖凝膠電泳試驗(yàn)，待DNA Marker各條帶跑開顯示清晰后，結(jié)束電泳。紫外燈下觀察凝膠中的DNA條帶，并切出含有目標(biāo)DNA的凝膠。根據(jù)回收試劑盒提供的方法進(jìn)行DNA回收。

基因測序及序列分析。將回收產(chǎn)物送至北京睿博興科公司進(jìn)行測序。利用BLAST方式將測序所得序列在GenBank數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行比對，獲得和測序DNA序列同源性最高的真菌ITS序列，確認(rèn)樣品的種屬信息。

2 結(jié)果與分析

采集得到的樣品根據(jù)形態(tài)特征可歸類為5種真菌，分別編號為 F-01、F-02、F-03、F-04 和 F-05。對它們進(jìn)行純化培養(yǎng)，觀察其菌落及菌體形態(tài)，并進(jìn)行后續(xù)的分子鑒定工作。

2.1 優(yōu)勢真菌的形態(tài)學(xué)觀察

將選出的5種真菌進(jìn)行點(diǎn)種純化培養(yǎng)7d后，觀察其真菌菌落形態(tài)，可發(fā)現(xiàn)不同真菌產(chǎn)生的色素各不相同，菌落質(zhì)地也有很大區(qū)別，具體特征見表1。

表1 真菌菌落形態(tài)特征

用乳酸酚棉藍(lán)染色法挑菌制片，鏡檢觀察真菌菌體形態(tài)，放大倍數(shù)均為400×，結(jié)果如圖1所示?？梢钥闯觯篎-01菌絲分隔，分生孢子梗較短，分生孢子呈棒狀；F-02菌絲不分隔，分生孢子梗較長。分生孢子球形或橢圓形；F-03菌絲分隔，孢子呈卵圓形；F-04細(xì)胞個體為圓形或卵圓形，有明顯的壓制現(xiàn)象；F-05分生孢子頭近球形，小梗雙層，放射狀排列，頂端有鏈形孢子。

圖1 真菌顯微形態(tài)特征

2.2 優(yōu)勢真菌的分子鑒定

提取5種優(yōu)勢真菌的基因組DNA，利用真菌ITS PCR擴(kuò)增通用引物對基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到目標(biāo)基因，即真菌ITS基因。瓊脂糖凝膠電泳確認(rèn)后回收DNA，結(jié)果如圖2所示。將獲得的產(chǎn)物測序后，得到其序列信息。在GenBank中比對得到同源性最高的DNA片段的GenBank登錄號，確定優(yōu)勢真菌的種屬信息，見表2。得到結(jié)果：古籍書庫空氣中的優(yōu)勢真菌有鏈格孢屬的極細(xì)鏈格孢霉，擬青霉屬的擬青霉SL95，枝孢霉屬的枝孢樣枝孢霉，隱球酵母屬的大隱球酵母和曲霉屬的雜色曲霉。

圖2 優(yōu)勢真菌ITS基因凝膠電泳

表2 菌種鑒定信息

3 討論

在古籍書庫中進(jìn)行空氣真菌采樣，篩選出5種優(yōu)勢真菌，結(jié)合形態(tài)學(xué)和分子鑒定結(jié)果，發(fā)現(xiàn)這五種真菌分別為鏈格孢屬的極細(xì)鏈格孢霉，擬青霉屬的擬青霉SL95，枝孢霉屬的枝孢樣枝孢霉，隱球酵母屬的大隱球酵母和曲霉屬的雜色曲霉。這與2013年所作調(diào)查北京市居家環(huán)境空氣中主要真菌種類青霉屬、枝孢屬、曲霉屬、鏈格孢屬和莖點(diǎn)霉屬接近[6]。本次研究明確了古籍書庫中優(yōu)勢空氣真菌種類，可為書庫的日常有害生物預(yù)防和真菌爆發(fā)性增長時(shí)的治理提供必要的技術(shù)支持。