唐 鑫，顧舒婕，常璐璐，趙建新，張 灝，陳海琴，陳 衛(wèi)

(江南大學(xué) 食品學(xué)院，江蘇 無(wú)錫 214122)

高山被孢霉是一種具有很強(qiáng)脂質(zhì)合成能力的產(chǎn)油絲狀真菌，其脂質(zhì)積累量可達(dá)到自身干重的50%以上，其中花生四烯酸(ARA)含量可超過(guò)總脂肪酸含量的40%，目前已應(yīng)用于商業(yè)化生產(chǎn)。為提高高山被孢霉的應(yīng)用價(jià)值，研究人員常通過(guò)優(yōu)化發(fā)酵條件、誘變育種等來(lái)提高菌株的生產(chǎn)特性[1-2]?，F(xiàn)階段，隨著基因工程的興起，利用分子生物學(xué)手段針對(duì)性地改造脂質(zhì)合成相關(guān)基因、構(gòu)建重組菌能夠更有效地實(shí)現(xiàn)總脂質(zhì)以及特定脂肪酸產(chǎn)量的提高[3]。與酵母和細(xì)菌不同，絲狀真菌本身生長(zhǎng)狀態(tài)差異較大，發(fā)酵過(guò)程較不穩(wěn)定。絲狀真菌對(duì)不同的培養(yǎng)條件如碳源、氮源、發(fā)酵時(shí)間、培養(yǎng)溫度、pH、搖床轉(zhuǎn)速、接種量等十分敏感，可對(duì)菌體的生長(zhǎng)和代謝造成較大的影響。為進(jìn)一步探究高山被孢霉的發(fā)酵特點(diǎn)，本研究從初始葡萄糖質(zhì)量濃度、活化次數(shù)、接種量、裝液量、發(fā)酵時(shí)間、菌球打碎時(shí)間等方面分析發(fā)酵培養(yǎng)條件對(duì)高山被孢霉生長(zhǎng)和脂質(zhì)積累的影響，并確定最適培養(yǎng)條件，為高山被孢霉的研究以及遺傳改造過(guò)程中轉(zhuǎn)化子篩選的準(zhǔn)確性提供更為穩(wěn)定的數(shù)據(jù)和參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 菌株

本實(shí)驗(yàn)所用菌株為高山被孢霉ATCC 32222，購(gòu)自美國(guó)菌種保藏中心。

1.1.2 主要試劑

正十五烷酸(C15∶0)、鹽酸-甲醇，Sigma；F006葡萄糖試劑盒，南京建成；酵母提取物、氯化鈉、甲醇、氯仿、鹽酸、正己烷、葡萄糖、磷酸二氫鉀、硝酸鉀、七水合硫酸鎂，國(guó)藥集團(tuán)。

1.1.3 培養(yǎng)基

Broth種子培養(yǎng)基：20 g/L葡萄糖，5 g/L酵母提取物，1 g/L KH2PO4，0.25 g/L MgSO4·7H2O，10 g/L KNO3。

Broth發(fā)酵培養(yǎng)基：50 g/L葡萄糖，5 g/L酵母提取物，1 g/L KH2PO4，0.25 g/L MgSO4·7H2O，10 g/L KNO3。

1.1.4 主要儀器

T10 basic Ultra-turrax高速分散機(jī)，德國(guó)IKA；G-GP2010 Plus氣相色譜儀，日本島津；ND100-2氮?dú)獯祾邇x，杭州瑞誠(chéng)；a5100微型單反數(shù)碼相機(jī)，日本索尼。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 菌株培養(yǎng)

200 μL孢子液(107個(gè)/mL)接種于Broth種子培養(yǎng)基，28℃、200 r/min振蕩培養(yǎng)2 d，棄上清，使用高速分散機(jī)，以8 000 r/min轉(zhuǎn)速打散菌體20 s，按1%(體積分?jǐn)?shù)，下同)接種量接種于新的種子培養(yǎng)基，重復(fù)2次至菌體生長(zhǎng)為狀態(tài)良好、大小均一的松散毛球狀。使用高速分散機(jī)以8 000 r/min轉(zhuǎn)速打散菌體20 s，按1%接種量接入Broth發(fā)酵培養(yǎng)基，28℃、200 r/min培養(yǎng)7 d。活化過(guò)程的培養(yǎng)體系為250 mL搖瓶，裝液量40%(體積分?jǐn)?shù)，下同)。

在考察不同培養(yǎng)條件對(duì)菌株生長(zhǎng)和產(chǎn)脂的影響時(shí)，除所考察的條件有所變化外，其他操作條件均固定。

1.2.2 高山被孢霉生物量及脂肪酸組成和含量測(cè)定

發(fā)酵后的菌體樣品經(jīng)200目網(wǎng)篩過(guò)濾，用去離子水反復(fù)沖洗菌體，在濾紙上擠干水分，置于真空冷凍干燥機(jī)中凍干至恒重，使用分析天平稱(chēng)量，得到菌體干重(DCW)。

將干燥菌體充分研磨至均勻的粉末狀，稱(chēng)取(50±5)mg干菌粉于提脂瓶中，加入2 mL 4 mol/L的鹽酸溶液，使用微量進(jìn)樣器準(zhǔn)確加入100 μL質(zhì)量濃度為2.0 mg/mL 的溶解于正己烷的正十五烷酸(C15∶0)作為內(nèi)標(biāo)，混勻后于80℃/-80℃反復(fù)凍融3次用于破壁。用甲醇-氯仿法萃取菌內(nèi)脂質(zhì)，充分振蕩，離心后吸取氯仿層于新提脂瓶，重復(fù)2次，新提脂瓶?jī)?nèi)的脂肪酸萃取樣品氮吹至干，用10%鹽酸-甲醇溶液于60℃水浴3 h進(jìn)行甲酯化處理。之后加入1 mL飽和氯化鈉溶液和1 mL正己烷，充分振蕩，萃取得到脂肪酸甲酯。使用GC-MS檢測(cè)樣品，分析脂肪酸組成及相對(duì)含量。根據(jù)色譜峰的保留時(shí)間定性，色譜峰的峰面積與已知濃度和添加量的內(nèi)標(biāo)(C15∶0)進(jìn)行定量，面積歸一化法確定不同脂肪酸相對(duì)含量。相關(guān)參數(shù)的計(jì)算公式如下。

生物量=菌體干重/培養(yǎng)基體積

脂肪酸含量=脂肪酸質(zhì)量/干菌粉質(zhì)量×100%

去脂生物量=(1-脂肪酸含量)×生物量

脂肪酸絕對(duì)量=脂肪酸含量×生物量

1.2.3 培養(yǎng)基上清液殘?zhí)呛繙y(cè)定

培養(yǎng)基上清液殘?zhí)呛繀⒖糉006葡萄糖試劑盒進(jìn)行。

1.2.4 菌體形態(tài)觀察與記錄

將培養(yǎng)體系充分搖勻，取3 mL倒入直徑為6 cm的玻璃培養(yǎng)皿并加入等量生理鹽水稀釋?zhuān)o置后保持固定距離拍攝菌體形態(tài)照片(微距模式)，觀察和記錄不同培養(yǎng)條件對(duì)菌體形態(tài)的影響。

2 結(jié)果與討論

2.1 初始葡萄糖質(zhì)量濃度對(duì)高山被孢霉生長(zhǎng)和產(chǎn)脂的影響

微生物發(fā)酵過(guò)程中的碳源是菌體形成細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)、細(xì)胞膜、細(xì)胞壁等各類(lèi)細(xì)胞組分的重要原料，能夠構(gòu)成細(xì)胞生長(zhǎng)所必需的碳骨架[4]。多數(shù)微生物偏好葡萄糖為優(yōu)先碳源[1]，葡萄糖參與的糖酵解過(guò)程是為生物體生命活動(dòng)提供能量的最主要方式。不同碳氮比會(huì)影響菌絲體的生長(zhǎng)狀態(tài)以及脂質(zhì)積累[5]，高山被孢霉在較高碳氮比下能大量積累脂質(zhì)，而過(guò)高的碳氮比不僅會(huì)因高滲透壓抑制菌體生長(zhǎng)，還會(huì)導(dǎo)致碳源浪費(fèi)[4]。因此，確定最適合高山被孢霉產(chǎn)脂和生長(zhǎng)的碳氮比具有重要的意義。本研究設(shè)置了20、30、35、40、50、65、80 g/L共計(jì)7組初始葡萄糖質(zhì)量濃度，研究高山被孢霉的生長(zhǎng)和產(chǎn)脂情況，結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 不同初始葡萄糖質(zhì)量濃度下高山被孢霉生長(zhǎng)、產(chǎn)脂情況

由圖1可知，當(dāng)初始葡萄糖質(zhì)量濃度低于50 g/L時(shí)，高山被孢霉的生物量隨著培養(yǎng)基中葡萄糖含量的增加而提高，表明葡萄糖為菌絲體細(xì)胞的生長(zhǎng)提供了可利用的碳源，而初始葡萄糖質(zhì)量濃度處于低水平時(shí)(<30 g/L)，無(wú)法滿足高山被孢霉產(chǎn)脂所需的高碳氮比，其生物量較低。當(dāng)培養(yǎng)基中的初始葡萄糖質(zhì)量濃度為50 g/L時(shí)，菌體的生長(zhǎng)情況最好，生物量達(dá)到9.4 g/L，脂肪酸絕對(duì)量高達(dá)3.0 g/L。而葡萄糖質(zhì)量濃度高于50 g/L時(shí)，菌體生物量和脂質(zhì)積累量有所降低。這可能是由于高濃度糖使細(xì)胞處于高滲透壓的環(huán)境脅迫狀態(tài)導(dǎo)致代謝水平失衡[6]，同時(shí)可能產(chǎn)生一些有害副產(chǎn)物使菌體生理活動(dòng)受影響[7]，阻礙菌絲體的正常生長(zhǎng)。

進(jìn)一步對(duì)不同初始葡萄糖質(zhì)量濃度下高山被孢霉中脂肪酸組成及相對(duì)含量進(jìn)行分析，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 不同初始葡萄糖質(zhì)量濃度下脂肪酸組成及相對(duì)含量

注：表中僅列出相對(duì)含量>3%的脂肪酸。下同。

由表1可知，隨著初始葡萄糖質(zhì)量濃度的增加，高山被孢霉中ARA含量大幅度降低，初始葡萄糖質(zhì)量濃度為20 g/L時(shí)ARA含量高達(dá)57.26%，當(dāng)初始葡萄糖質(zhì)量濃度高達(dá)80 g/L時(shí)ARA含量下降至42.62%，與此同時(shí)，以C16∶0、C18∶0和C18∶1為代表的飽和及單不飽和脂肪酸含量顯著增加，表明高初始葡萄糖質(zhì)量濃度下脂肪酸的脫飽和及延長(zhǎng)途徑受阻[6]。有研究顯示，碳源等營(yíng)養(yǎng)原料不足時(shí)菌體進(jìn)入老化階段，在此時(shí)期內(nèi)菌體生物量積累停止而ARA產(chǎn)量大幅度提高[8]。綜合比較菌體的生長(zhǎng)和產(chǎn)脂情況，選擇初始葡萄糖質(zhì)量濃度為50 g/L。

2.2 活化次數(shù)對(duì)高山被孢霉生長(zhǎng)和產(chǎn)脂的影響

菌體需達(dá)到相對(duì)一致的生長(zhǎng)狀態(tài)時(shí)才能接入發(fā)酵培養(yǎng)基中，以保證培養(yǎng)過(guò)程中菌體生長(zhǎng)發(fā)酵的穩(wěn)定性，減少菌體個(gè)體生長(zhǎng)差異對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響。高山被孢霉要經(jīng)過(guò)多次活化才能達(dá)到最佳生長(zhǎng)狀態(tài)，通常一次活化需2～3 d，重復(fù)活化2～3次，直至長(zhǎng)成個(gè)體均一、形態(tài)飽滿的白色絨毛狀菌球再接入發(fā)酵培養(yǎng)基。設(shè)置活化1、2、3、4、5次5組條件，每組3個(gè)平行。比較不同活化次數(shù)對(duì)高山被孢霉生長(zhǎng)和產(chǎn)脂的影響，結(jié)果見(jiàn)圖2。

由圖2可知，活化次數(shù)對(duì)菌體生物量影響不大，但脂肪酸的合成受到影響，導(dǎo)致各活化次數(shù)下去脂生物量和脂肪酸絕對(duì)量有所不同?；罨?次和2次的菌體脂肪酸含量均小于40%，第3次活化后脂肪酸含量達(dá)到最高。之后隨著活化次數(shù)增加，脂質(zhì)積累性能總體降低，可能是活化次數(shù)過(guò)多而導(dǎo)致菌體活性降低、增殖能力減弱、遺傳性狀丟失或生物學(xué)功能衰退。

不同活化次數(shù)下高山被孢霉脂肪酸組成及相對(duì)含量見(jiàn)表2。

由表2可知，活化次數(shù)對(duì)高山被孢霉脂肪酸組成的影響較小，因此為避免多次活化帶來(lái)的不利影響，本實(shí)驗(yàn)選擇將產(chǎn)脂性能最好、活化3次的菌體接入發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)。

2.3 接種量對(duì)高山被孢霉生長(zhǎng)和產(chǎn)脂的影響

菌株的接種量與生長(zhǎng)狀態(tài)密切相關(guān)。液體培養(yǎng)基中高山被孢霉菌球的密度決定著菌株達(dá)到穩(wěn)定期的時(shí)間，直接關(guān)系到培養(yǎng)基中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和溶解氧的傳遞效率及菌絲體的生長(zhǎng)發(fā)酵情況。有研究表明高接種密度下菌體延滯期縮短，可較快到達(dá)對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期從而縮短整個(gè)發(fā)酵周期[9]。將活化3次的菌體以0.5%、1%、2%、3%、4%的5個(gè)梯度接入發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，每組設(shè)置3個(gè)平行。不同接種量下高山被孢霉菌體形態(tài)見(jiàn)圖3，不同接種量下高山被孢霉生長(zhǎng)、產(chǎn)脂情況見(jiàn)圖4。

圖3 不同接種量下高山被孢霉菌體形態(tài)

圖4 不同接種量下高山被孢霉生長(zhǎng)、產(chǎn)脂情況

由圖3和圖4可知，接種量為1%～2%時(shí)高山被孢霉呈毛球狀，菌球大小一致，分布均勻，生長(zhǎng)狀態(tài)最佳。當(dāng)接種量為0.5%時(shí)，菌球個(gè)體大、數(shù)量少，生長(zhǎng)不均勻，生物量?jī)H為9.13 g/L，該條件下脂肪酸產(chǎn)量顯著低于其他組別，可能因?yàn)?.5%接種量所形成的大體積菌球內(nèi)部營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的運(yùn)輸、尤其是溶解氧的傳遞受阻嚴(yán)重[10]。當(dāng)接種量超過(guò)1%時(shí)，接入培養(yǎng)基的菌絲在生長(zhǎng)過(guò)程中縮聚成一個(gè)個(gè)表面相對(duì)光滑的緊實(shí)小菌球。研究表明，絲狀真菌在適合自身生長(zhǎng)的條件下不易結(jié)成緊密的球體，而在營(yíng)養(yǎng)匱乏時(shí)菌絲聚集現(xiàn)象加倍出現(xiàn)[11]。

對(duì)不同接種量下脂肪酸組成及相對(duì)含量進(jìn)行分析，結(jié)果見(jiàn)表3。

由表3可知，接種量對(duì)各類(lèi)脂肪酸相對(duì)含量無(wú)明顯影響?？紤]到菌體生長(zhǎng)速度、生物量和脂質(zhì)積累量，選擇2%～3%為最適接種量。

表3 不同接種量下脂肪酸組成及相對(duì)含量

2.4 裝液量對(duì)高山被孢霉生長(zhǎng)和產(chǎn)脂的影響

溶解氧含量是影響菌體生長(zhǎng)和產(chǎn)脂的關(guān)鍵因素之一，而裝液量與搖瓶培養(yǎng)體系中溶解氧含量密切相關(guān)[10]，裝液量越小，培養(yǎng)基與空氣的接觸面積越大，溶氧量越多。將Broth發(fā)酵培養(yǎng)基分別按照20%、30%、40%、50%、60%裝液量分裝，探究裝液量對(duì)高山被孢霉生長(zhǎng)發(fā)酵的影響。不同裝液量下高山被孢霉菌體形態(tài)見(jiàn)圖5，生長(zhǎng)、產(chǎn)脂情況見(jiàn)圖6。

圖5 不同裝液量下高山被孢霉菌體形態(tài)

圖6 不同裝液量下高山被孢霉生長(zhǎng)、產(chǎn)脂情況

由圖5可知，在20%裝液量下，菌球體積小且表面光滑，這是菌體對(duì)所處培養(yǎng)環(huán)境的響應(yīng)表現(xiàn)。有研究表明，在高溶氧量條件下，菌體因受到高氧濃度的脅迫，菌絲生長(zhǎng)被束縛并開(kāi)始加速分化，菌體表面部分結(jié)構(gòu)裂解，形成光滑的外壁，這是菌體在高氧壓力下的一種自我應(yīng)激保護(hù)機(jī)制[12]。裝液量增加后，菌株逐漸生長(zhǎng)成絨毛狀的蓬松小球。菌絲在培養(yǎng)過(guò)程中需浸沒(méi)在培養(yǎng)基中以保證營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收，裝液量可能成為限制菌絲向外延伸、擴(kuò)大的因素，因而菌球體積在20%裝液量時(shí)最小并隨裝液量的增加而增大。

由圖6可知，高山被孢霉的去脂生物量幾乎沒(méi)有隨著裝液量的改變而變化，但脂肪酸絕對(duì)量與裝液量呈負(fù)相關(guān)，裝液量20%時(shí)脂肪酸含量達(dá)到45.72%，分別比其他4組提高6.20%、6.60%、10.97%、17.74%，推測(cè)溶氧量會(huì)改變菌株的代謝途徑，溶解氧缺乏的情況不利于產(chǎn)油微生物將游離脂肪酸轉(zhuǎn)化為甘油三酯積累于胞內(nèi)，也不利于不飽和脂肪酸的生成[7，13]。

不同裝液量下脂肪酸組成及相對(duì)含量見(jiàn)表4。

由表4可知，隨著裝液量的增加，菌體飽和脂肪酸與多不飽和脂肪酸含量之比(SFAs/PUFAs)無(wú)明顯變化，可能因?yàn)楸狙芯恐醒鯕夤┙o量的改變不足以影響脂肪酸的脫飽和作用。有研究表明，溶解氧濃度在一定范圍內(nèi)增加能夠促進(jìn)高山被孢霉中不飽和脂肪酸花生四烯酸(ARA)的合成，但氧含量過(guò)高時(shí)菌體需利用額外的能量來(lái)響應(yīng)高濃度氧對(duì)細(xì)胞的氧化脅迫，誘導(dǎo)代謝向所不需要的方向進(jìn)行，ARA的生成受阻礙[13-14]。此外，由于高裝液量、低溶氧量下培養(yǎng)的菌體形態(tài)較大，菌球外緣呈放射狀聚集的菌絲會(huì)抑制溶解氧的傳遞，同時(shí)在一定程度上阻礙了營(yíng)養(yǎng)成分和代謝產(chǎn)物的運(yùn)輸通路，這會(huì)導(dǎo)致菌球內(nèi)部無(wú)法獲得充足的養(yǎng)分且氧傳遞速率很低，一些有毒有害的代謝產(chǎn)物也不能及時(shí)排出，對(duì)菌株的發(fā)酵生產(chǎn)十分不利[7]。根據(jù)脂質(zhì)合成情況選擇溶氧量最大的20%裝液量作為優(yōu)化條件。

表4 不同裝液量下脂肪酸組成及相對(duì)含量

2.5 發(fā)酵時(shí)間對(duì)高山被孢霉生長(zhǎng)和產(chǎn)脂的影響

經(jīng)活化的高山被孢霉在接入發(fā)酵培養(yǎng)基之后存在短暫延滯期再進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期[6]，此時(shí)去脂生物量快速增加，大量消耗碳源、氮源，脂質(zhì)合成開(kāi)始但處于較低水平。之后在氮限制下菌體生長(zhǎng)受到抑制，脂質(zhì)積累相關(guān)酶活性改變，為脂肪酸的形成提供了充足的乙酰-CoA碳源底物和NADPH還原力，高山被孢霉生長(zhǎng)速度減緩甚至停止轉(zhuǎn)而大量生成脂肪酸，培養(yǎng)基中殘?zhí)亲鳛橹舅岷铣傻闹匾先员徊粩嗬肹15]，葡萄糖消耗量持續(xù)下降，其中5.5～7 d時(shí)菌體耗糖速度最快，即這段時(shí)間是脂質(zhì)快速積累期(見(jiàn)圖7)。

圖7 不同發(fā)酵時(shí)間下高山被孢霉培養(yǎng)基上清液殘?zhí)呛?/p>

不同發(fā)酵時(shí)間下高山被孢霉生長(zhǎng)、產(chǎn)脂情況見(jiàn)圖8。

圖8 不同發(fā)酵時(shí)間下高山被孢霉生長(zhǎng)、產(chǎn)脂情況

由圖8可知，高山被孢霉在發(fā)酵7 d前后的去脂生物量幾乎沒(méi)有發(fā)生變化，菌絲體生長(zhǎng)十分緩慢甚至接近停止。但發(fā)酵7 d時(shí)高山被孢霉的脂肪酸含量比5.5 d時(shí)提高了14.38%，到8.5 d時(shí)脂肪酸含量進(jìn)一步上升并達(dá)到最高,這符合發(fā)酵后期菌體代謝由生長(zhǎng)期進(jìn)入脂肪酸積累期的一般規(guī)律[2]。高山被孢霉在培養(yǎng)8.5 d時(shí)已基本完成脂質(zhì)的快速積累，但11.5 d時(shí)脂肪酸含量比10 d時(shí)又降低了7.72%，說(shuō)明菌體內(nèi)脂肪酸含量在第8.5～10 d時(shí)相對(duì)穩(wěn)定，因此選取該發(fā)酵時(shí)期的菌體進(jìn)行脂肪酸提取。此外，菌體的去脂生物量在10 d和11.5 d的發(fā)酵末期內(nèi)分別提高10.05%和13.62%，推測(cè)可能在發(fā)酵后期碳源即將耗盡時(shí)菌體啟動(dòng)細(xì)胞自噬[16]，在一些分解酶的作用下降解部分細(xì)胞器、已合成脂肪酸和非必要蛋白質(zhì)等成分，為生物體的生命代謝提供必要的能量和碳骨架，因而去脂生物量增加[4]。

不同發(fā)酵時(shí)間下脂肪酸組成及相對(duì)含量見(jiàn)表5。

表5 不同發(fā)酵時(shí)間下脂肪酸組成及相對(duì)含量

由表5可知，C18∶0、C18∶1、C18∶2、C18∶3 4種脂肪酸的含量隨發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)而降低，而其特征脂肪酸ARA的含量隨發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)而增加。綜上，選擇8.5 d作為高山被孢霉的發(fā)酵時(shí)間。

2.6 菌球打碎時(shí)間對(duì)高山被孢霉生長(zhǎng)和產(chǎn)脂的影響

高山被孢霉等絲狀真菌在培養(yǎng)過(guò)程中會(huì)聚集成小球狀，菌株的活化需要將菌球打散成菌絲并接入新的培養(yǎng)基，之后在振蕩培養(yǎng)過(guò)程中重新長(zhǎng)成菌球。菌球破碎程度不僅會(huì)影響活化過(guò)程中菌球的均一性從而影響發(fā)酵結(jié)果的穩(wěn)定，還會(huì)因外加的機(jī)械力影響菌體的活性。前期實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，不同打碎程度對(duì)菌絲的生長(zhǎng)狀態(tài)有明顯的影響。取活化3代的菌體，將菌球以8 000 r/min轉(zhuǎn)速分別打碎20、40、80、120、160 s至均勻菌絮狀，接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中，不同菌球打碎時(shí)間下高山被孢霉菌體形態(tài)(發(fā)酵1 d)見(jiàn)圖9。不同菌球打碎時(shí)間下高山被孢霉生長(zhǎng)、產(chǎn)脂情況見(jiàn)圖10。

圖9 不同菌球打碎時(shí)間下高山被孢霉菌體形態(tài)(發(fā)酵1 d)

圖10 不同菌球打碎時(shí)間下高山被孢霉生長(zhǎng)、產(chǎn)脂情況

由圖9～圖10可知，在菌球打碎時(shí)間較短時(shí)(20、40 s)，菌絲在發(fā)酵1 d后就開(kāi)始聚集形成小型菌球雛形，而菌球打碎時(shí)間較長(zhǎng)(80、120、160 s)的菌體仍呈分散的顆粒狀菌絲且菌絲生長(zhǎng)稀薄，生長(zhǎng)速度延緩。發(fā)酵培養(yǎng)7 d后菌體的形態(tài)基本達(dá)到一致，生物量穩(wěn)定在9.0 g/L，只有打碎程度最高(菌球打碎時(shí)間160 s)的菌體生長(zhǎng)情況較差，其生物量和去脂生物量分別只有8.40 g/L和5.29 g/L，表明打碎程度會(huì)影響菌體活性和生長(zhǎng)速度，而打碎時(shí)間過(guò)長(zhǎng)時(shí)菌體難以恢復(fù)到較好生長(zhǎng)狀態(tài)?？梢?jiàn)，打碎程度雖對(duì)高山被孢霉的生長(zhǎng)終狀態(tài)影響不大，但過(guò)高的打碎程度會(huì)明顯降低菌體的生長(zhǎng)速度，進(jìn)而影響菌絲體的發(fā)酵生長(zhǎng)。打碎20～120 s的菌體脂肪酸產(chǎn)量相差不大，僅呈略微下降趨勢(shì)，打碎20 s時(shí)菌體的脂肪酸含量最高，達(dá)到39.74%。將打碎時(shí)間延長(zhǎng)至160 s時(shí)，菌體脂肪酸含量降低了6.97%。

不同菌球打碎時(shí)間下脂肪酸組成及相對(duì)含量見(jiàn)表6。

由表6可知，打碎20 s時(shí)ARA的含量最高，表明此時(shí)高山被孢霉的脂肪酸生產(chǎn)特性表現(xiàn)最佳。綜上，選擇20 s為最佳菌球打碎時(shí)間。

表6 不同菌球打碎時(shí)間下脂肪酸組成及相對(duì)含量

3 結(jié) 論

高山被孢霉作為已經(jīng)應(yīng)用于商業(yè)化生產(chǎn)花生四烯酸(ARA)的菌株，具有良好的應(yīng)用價(jià)值和開(kāi)發(fā)前景。本研究比較了不同初始葡萄糖質(zhì)量濃度、活化次數(shù)、接種量、裝液量、發(fā)酵時(shí)間、菌球打碎時(shí)間等不同發(fā)酵條件下高山被孢霉的生長(zhǎng)及產(chǎn)脂情況，完成對(duì)其所產(chǎn)脂肪酸的提取和分析，發(fā)現(xiàn)初始葡萄糖質(zhì)量濃度、裝液量和發(fā)酵時(shí)間對(duì)高山被孢霉生長(zhǎng)、產(chǎn)脂的影響最為突出，得到高山被孢霉產(chǎn)脂的最佳發(fā)酵條件：初始葡萄糖質(zhì)量濃度50 g/L，裝液量20%(體積分?jǐn)?shù))，菌株需活化3次，打碎20 s至均勻狀態(tài)，按2%～3%(體積分?jǐn)?shù))接種量接入Broth發(fā)酵培養(yǎng)基，200 r/min、28℃培養(yǎng)8.5 d。本研究還發(fā)現(xiàn)，雖然較高的初始葡萄糖質(zhì)量濃度可以促進(jìn)高山被孢霉脂質(zhì)積累，但是發(fā)酵末期葡萄糖剩余量較高，造成碳源浪費(fèi)并提高了發(fā)酵成本，而且高葡萄糖濃度會(huì)抑制ARA的積累。由于ARA等長(zhǎng)鏈多不飽和脂肪酸的合成主要由脂肪酸脫飽和酶和延長(zhǎng)酶參與，后續(xù)可對(duì)外源葡萄糖濃度對(duì)脂肪酸脫飽和及延長(zhǎng)途徑關(guān)鍵酶的活性調(diào)控進(jìn)行探究，在保證菌株生長(zhǎng)和產(chǎn)脂的基礎(chǔ)上，通過(guò)分批補(bǔ)料等方式控制發(fā)酵過(guò)程中葡萄糖濃度、提高脂肪酸脫飽和及延長(zhǎng)過(guò)程關(guān)鍵酶的活性，為進(jìn)一步促進(jìn)高山被孢霉高產(chǎn)具有高附加值的長(zhǎng)鏈多不飽和脂肪酸提供更好的理論基礎(chǔ)。