史晨琳，王長(zhǎng)彪，趙興華，劉 江，韓 斌，任永康，牛瑜琦，唐朝暉

（1.山西大學(xué)生物工程學(xué)院，山西太原030006；2.山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究中心，山西太原030031；3.山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所，山西太原030031）

分子標(biāo)記在小麥遺傳育種中有著重要作用，主要體現(xiàn)在遺傳圖譜的構(gòu)建、基因標(biāo)記和定位、品種鑒定和指紋圖譜繪制、物種親緣關(guān)系和遺傳多樣性研究及分子標(biāo)記輔助育種等方面[1]。分子標(biāo)記包括兩類，一類是基于非PCR 技術(shù)或者雜交技術(shù)，如RRFLP（限制片段長(zhǎng)度多態(tài)性）；二類是基于PCR技術(shù)的任意引物或序列非特異技術(shù)，如RAPD（隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA），AFLP（擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性）和序列靶向PCR 技術(shù)（如SSR，SNPs）[2]。SSR 分子標(biāo)記在遺傳基礎(chǔ)較窄的普通小麥基因組中隨機(jī)分布，具有多位點(diǎn)、豐富的多態(tài)性、大部分位點(diǎn)有特異性，因此，在小麥的遺傳育種研究中已廣泛應(yīng)用[3-4]。

SCHULER[5]于1997 年第一次提出電子PCR（Electronic PCR，e-PCR）的概念，被用于DNA 片段染色體定位和基因組輔助作圖等方面[6]。電子克隆技術(shù)是指在已有的網(wǎng)絡(luò)資源和數(shù)據(jù)庫(kù)（EST、核苷酸數(shù)據(jù)庫(kù)、基因組數(shù)據(jù)庫(kù)等）中采用聚類、同源性檢索、序列拼裝等生物學(xué)方法，利用計(jì)算機(jī)技術(shù)來(lái)延伸EST 序列，從而得到部分或者全長(zhǎng)cDNA 序列的技術(shù)[7]，具有簡(jiǎn)單、快速、成本低等特點(diǎn)[8]。

隨著小麥及其祖先種基因組測(cè)序工作的完成，產(chǎn)生了大量可分析數(shù)據(jù)[9]。多種基因預(yù)測(cè)軟件被用于預(yù)測(cè)各種生物基因結(jié)構(gòu)及功能[10]，其中，F(xiàn)genesh可用于真核生物的預(yù)測(cè)，直接對(duì)某生物的cDNA 序列或蛋白質(zhì)的相似性來(lái)預(yù)測(cè)，準(zhǔn)確性極高[11]。Blast2go 是一種利用GO 功能注釋和分析的相似性搜索工具，便于對(duì)大批量功能基因組學(xué)信息進(jìn)行搜索[12]。通過大量的圖形和分析工具來(lái)處理數(shù)據(jù)[13]，對(duì)基因或蛋白質(zhì)序列進(jìn)行功能注釋和分析，注釋時(shí)對(duì)每個(gè)基因或基因產(chǎn)物生成一個(gè)與之相關(guān)的GO 術(shù)語(yǔ)列表[14]。KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes）即京都基因和基因組百科全書[15]。KEGG通路圖用圖形將基因、酶和各種代謝網(wǎng)絡(luò)信息相結(jié)合，每個(gè)代謝途徑構(gòu)成一個(gè)含有酶或EC 號(hào)的網(wǎng)絡(luò)[16]。作為一個(gè)豐富的生物信息學(xué)資源庫(kù)，KEGG 是基因功能預(yù)測(cè)、尋找基因涉及的代謝途徑，挖掘代謝產(chǎn)物、基因、調(diào)節(jié)物質(zhì)三者間關(guān)系的重要工具[17]。

本研究通過從已發(fā)表文獻(xiàn)中尋找與小麥抗白粉病、抗銹病相關(guān)的特異性分子標(biāo)記，并進(jìn)行篩選，將其定位在六倍體中國(guó)春小麥和祖先種烏拉爾圖小麥、粗山羊草的全基因組數(shù)據(jù)庫(kù)中，對(duì)能夠成功定位的序列進(jìn)行功能預(yù)測(cè)、GO 功能注釋以及KEGG 分析，獲得與小麥白粉菌、銹菌互作過程中的基因表達(dá)信息，較全面認(rèn)識(shí)基因在抗性反應(yīng)網(wǎng)絡(luò)中基因間的相互關(guān)系，為揭示小麥病害的發(fā)病機(jī)理、發(fā)掘和克隆抗病新基因和開發(fā)分子標(biāo)記奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

由山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所提供的34 份小麥材料：中國(guó)春、烏拉爾圖小麥（Triticum urartu）、擬斯卑爾脫山羊草（Ae.Speltoides Tausch）、粗山羊草（Aogilops.tauschii）、野生一粒小麥（Triticum boeoticum Boiss）、Sy95-71、運(yùn)旱618、運(yùn)旱20410、銘賢169、晉麥47、晉麥66、98M71、Moro、先麥12、豐尤8 號(hào)、百農(nóng)121、鄭132、鄭369、阜0608、良星99、濟(jì)麥22、山農(nóng)20、中麥247、良星66、寧麥5 號(hào)、舜麥1718、百農(nóng)64、皖麥38、MY559、蘭考906、石家莊8 號(hào)、中麥175、長(zhǎng)6878、周麥28。

從已發(fā)表的相關(guān)文獻(xiàn)中尋找與小麥抗白粉病、銹病的相關(guān)分子標(biāo)記150 個(gè)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 標(biāo)記篩選 在Linux 平臺(tái)上將小麥抗病標(biāo)記在中國(guó)春及其祖先種烏拉爾圖小麥（Triticum urartu）、粗山羊草（Aogilops.tauschii）中進(jìn)行電子定位，確定其在染色體上的實(shí)際位置。再通過PAGE 篩選，篩選出41 個(gè)對(duì)小麥高感材料與高抗材料特異性的分子標(biāo)記。

1.2.2 生物信息學(xué)分析 對(duì)能成功進(jìn)行電子定位的位點(diǎn)，提取兩翼各2 000 bp 的序列，進(jìn)行了電子克隆。使用Fgenesh 對(duì)相關(guān)定位位點(diǎn)的兩翼序列進(jìn)行功能基因預(yù)測(cè)。為了深入的研究小麥相關(guān)抗病基因的分子機(jī)理和功能，使用Blast2go 軟件對(duì)獲得的功能基因進(jìn)行基因的GO 功能注釋及KEGG 的代謝途徑分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 電子定位分析

統(tǒng)計(jì)電子定位結(jié)果，其中分別定位在六倍體小麥的2B 染色體，烏拉爾圖小麥（Triticum urartu）的2 號(hào)染色體，粗山羊草（Aogilops.tauschii）的2 號(hào)染色體上的最多。同一標(biāo)記定位在不同染色體上，或者同一染色體不同位置。

2.2 與標(biāo)記關(guān)聯(lián)的基因預(yù)測(cè)

對(duì)能夠成功定位位點(diǎn)的上游和下游分別提取2kb 的基因組序列，使用在線基因預(yù)測(cè)軟件Fgenesh對(duì)提取到的基因組序列進(jìn)行基因預(yù)測(cè)，共預(yù)測(cè)出96個(gè)功能基因。

2.3 基因功能注釋

用B1ast2go 軟件把預(yù)測(cè)到的96 個(gè)功能基因的DNA 序列進(jìn)行GO 功能注釋，其中，成功注釋的有60 個(gè)序列，未成功注釋的有36 個(gè)。注釋結(jié)果共有58 條術(shù)語(yǔ)信息：參與生物學(xué)途徑（P）的有24 條，占41.38%；細(xì)胞組件（C）的10 條，占17.24%；分子功能（F）的有24 條，占41.38%。功能基因二級(jí)水平的GO 注釋如圖1 所示。

2.3.1 分子功能（F）GO 術(shù)語(yǔ)分析 參與分子功能（F）的功能基因有54 個(gè)，分子功能二級(jí)水平包括結(jié)合、催化活性、營(yíng)養(yǎng)庫(kù)活性以及轉(zhuǎn)運(yùn)活性4 種反應(yīng)類型，其中，參與結(jié)合（42.2%）和催化活性（35.6%）這2 種類型中的功能基因占多數(shù)，說明細(xì)胞內(nèi)正?；顒?dòng)離不開包括催化活性、雜環(huán)化合物結(jié)合、有機(jī)環(huán)狀化合物結(jié)合、離子結(jié)合、轉(zhuǎn)移酶活性、核酸結(jié)合、催化活性，作用于蛋白質(zhì)、營(yíng)養(yǎng)庫(kù)活性等。其具體結(jié)果如圖2 所示。

2.3.2 生物學(xué)途徑（P）GO 術(shù)語(yǔ)分析 參與生物學(xué)途徑的共有51 個(gè)功能基因，生物學(xué)途徑（P）二級(jí)水平中包括代謝過程、細(xì)胞反應(yīng)、定位、細(xì)胞成分或生物發(fā)育、刺激反應(yīng)、多生物反應(yīng)、生物過程調(diào)控以及生物調(diào)控8 種途徑類型。8 種途徑中參與代謝過程（29.0%）、細(xì)胞過程（26.9%）的功能基因最多。代謝途徑在植物與病原菌長(zhǎng)期的共同進(jìn)化過程中產(chǎn)生的復(fù)雜免疫系統(tǒng)中有著重要的作用，代謝過程中產(chǎn)生一系列產(chǎn)物，如水楊酸、植物凝集素以及次生代謝產(chǎn)物植保素、木質(zhì)素、胼胝質(zhì)，這些物質(zhì)具有抵抗各種病原微生物入侵等提高植物抗病性的特點(diǎn)。這些基因參與細(xì)胞正常生命活動(dòng)，在細(xì)胞增殖、分化、凋亡、遷移過程中起到重要的調(diào)控作用。其具體結(jié)果如圖3 所示。

2.3.3 細(xì)胞組件（C）GO 術(shù)語(yǔ)分析 參與細(xì)胞組件的相關(guān)功能基因共有59 個(gè)。細(xì)胞組件二級(jí)水平包括細(xì)胞組分、細(xì)胞、細(xì)胞器、膜、膜組分、蛋白復(fù)合物以上6 種反應(yīng)類型。其中，在細(xì)胞（24.5%）、細(xì)胞組分（24.5%）、細(xì)胞器（19.4%）參與的功能基因最多。植物細(xì)胞是其一系列生命活動(dòng)的結(jié)構(gòu)與功能的基本單位，從結(jié)構(gòu)方面，可分為細(xì)胞壁、質(zhì)膜、細(xì)胞核與細(xì)胞質(zhì)。細(xì)胞核是遺傳物質(zhì)儲(chǔ)存和復(fù)制的場(chǎng)所、對(duì)細(xì)胞整體代謝和發(fā)育起重要作用。植物細(xì)胞核中不同細(xì)胞器具有不同的作用，比如，葉綠體是植物細(xì)胞能進(jìn)行光合作用最重要的細(xì)胞器，線粒體是細(xì)胞進(jìn)行有氧呼吸的主要場(chǎng)所。這表明小麥功能基因的實(shí)現(xiàn)都是在細(xì)胞內(nèi)發(fā)生，離不開細(xì)胞內(nèi)各種細(xì)胞器和細(xì)胞組分的相互作用。其具體結(jié)果如圖4 所示。

2.4 KEGG 代謝途徑分析

用KEGG 數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)得到的96 個(gè)功能基因進(jìn)行代謝途徑分析，代謝KO 結(jié)果及對(duì)應(yīng)基因序列如表1 所示。

表1 代謝通路及基因序列

R35_chr2：c15247710-1524354 定義為乙醇脫氫酶（alcohol dehydrogenase，ADH，EC1.1.1.1），EC1.1.1.1 在原核生物、真菌、植物及動(dòng)物中高度保守，可以將乙醇與乙醛相互轉(zhuǎn)化，在抵御低氧、低溫、澇害、干旱和鹽脅迫等非生物脅迫過程中有著重要作用[18]。R56_Tu1：14506450-14510636-2 定義為過氧化物酶（peroxidase，EC：1.11.1.7），EC：1.11.1.7 功能多樣，在植物抗逆、生長(zhǎng)發(fā)育、遺傳育種、木質(zhì)素合成及其他生理過程中具有重要作用[19]。李華琴等[20]試驗(yàn)表明，小麥感病品種的過氧化物酶活性比抗病品種的顯著增強(qiáng)，并且酶活性的增強(qiáng)與葉片癥狀相關(guān)聯(lián)。R48_5A：c702503970-702499760-1 定義為木葡聚糖內(nèi)糖基轉(zhuǎn)移酶基因（XET），XET 通過改變木葡聚糖的結(jié)構(gòu)引起細(xì)胞壁松弛，從而對(duì)植物生長(zhǎng)發(fā)育產(chǎn)生影響[21]。R07_6D：455131969-455136142-2（R07_chr6：479075589-479079762-2）定義為SWEET基因（sugarswilleventuallybeexported transporter），SWEET 家族參與宿主-病原菌之間的互作，但只有部分與病原菌互作的機(jī)理得到闡述，而病原菌特異性識(shí)別SWEET 基因的途徑是未知的[22]。植物進(jìn)化出用以監(jiān)控、抑制病原菌效應(yīng)子的R 基因，宿主R 基因與病原物致病性的無(wú)毒基因（Avr）相互作用下產(chǎn)生抗性，是引發(fā)宿主免疫反應(yīng)的前提。R60_5B：701460124-701464231 定義為RIN4，RIN4 在與植物病原菌相互作用中具有重要的作用，AvrRpm1 和AvrB 誘導(dǎo)RIN4 磷酸化，可能會(huì)增強(qiáng)RIN4 作為植物防御的負(fù)調(diào)節(jié)因子的活性，促進(jìn)病原菌的生長(zhǎng)[23]。代謝通路如圖5 所示。

3 結(jié)論與討論

本研究通過對(duì)篩選出的特異性分子標(biāo)記，對(duì)提取到的基因組序列進(jìn)行基因功能預(yù)測(cè)和注釋，再使用Fgenesh 預(yù)測(cè)出96 個(gè)功能基因，對(duì)獲得的基因序列進(jìn)行GO 功能注釋以及KEGG 代謝途徑分析。在GO 注釋結(jié)果中，生物學(xué)途徑（P）與分子功能（F）的GO 術(shù)語(yǔ)數(shù)目較多。在生物學(xué)途徑中，以代謝過程為主；細(xì)胞組件中，以在細(xì)胞和細(xì)胞器中起作用的為主；分子功能中，具有結(jié)合和催化活性功能的基因數(shù)目最多，說明獲得的功能基因主要通過在細(xì)胞內(nèi)，各種物質(zhì)通過結(jié)合與催化功能進(jìn)行代謝活動(dòng)。KEGG 代謝通路分析得到了對(duì)應(yīng)的KO 代謝途徑及EC 編碼等相關(guān)信息。

其中，R35_chr2：c15247710-15243542、R60_5B：701460124-701464231、R07_6D:455131969-455136 142-2（R07_chr6：479075589-479079762-2）可能與抗病相關(guān)聯(lián)；S5_2A：729575149-729597382-2（S5_chr2：575741567-575745800、S5_2D：595544071-59 5548304）、R48_5A：c702503970-702499760-1、R56_Tu1：14506450-14510636-2、R51_7B：c718434553-718430309-1（R51_Tu7：698386587-698390868-1）、020_2D：595544128-595548276（020_2B：72344079 5-723444943、020_chr2：575741624-575745772）與植物抗逆性以及生長(zhǎng)發(fā)育有關(guān)。

雖然通過生物信息手段預(yù)測(cè)到了和抗病相關(guān)的基因，但是這些基因在實(shí)際應(yīng)用是否和抗病關(guān)聯(lián)，還需要進(jìn)一步進(jìn)行功能驗(yàn)證，這為下一步進(jìn)行小麥抗白粉病、銹病基因的定位及克隆、基因編輯和分子育種奠定了基礎(chǔ)。