孫奴奴，劉 瑾

(運(yùn)城學(xué)院 生命科學(xué)系，山西 運(yùn)城 044000)

我國(guó)畜牧業(yè)中養(yǎng)豬業(yè)占主導(dǎo)地位，全國(guó)豬肉產(chǎn)量不斷地增加，在我國(guó)肉類總生產(chǎn)量中占了很大的比例。消費(fèi)者對(duì)豬肉肉質(zhì)的要求提高，不僅對(duì)豬肉的風(fēng)味、嫩度有要求，對(duì)豬肉的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值也有更高的要求。國(guó)內(nèi)外對(duì)于如何改善豬肉肉質(zhì)做過大量研究，其中發(fā)現(xiàn)可以通過對(duì)肌肉生長(zhǎng)的調(diào)節(jié)，改善豬肉品質(zhì)。而MyoG基因控制肌細(xì)胞的增殖與分化，可以增加肌肉的生長(zhǎng)速度。肌細(xì)胞生成素(MyoG)是生肌調(diào)節(jié)因子家族中的一員[1]，在生肌調(diào)節(jié)因子家族中只有MyoG基因可以在所有骨骼肌細(xì)胞系中表達(dá)，它在胚胎發(fā)育中控制中胚層干細(xì)胞分化定向形成肌細(xì)胞，以促進(jìn)肌纖維的形成，從而控制肌肉的形成[2]。MyoG基因不僅能對(duì)自身基因的表達(dá)進(jìn)行調(diào)節(jié)，還可以與生肌因子家族中MyoD、Myf-5、Myf-6等基因相互作用，對(duì)彼此基因的表達(dá)進(jìn)行調(diào)節(jié)，調(diào)節(jié)肌肉中肌球蛋白輕鏈基因、肌肉肌酸激酶、肌鈣蛋白等特異基因的表達(dá)。所以肌肉的形成、肉質(zhì)及產(chǎn)量都受到MyoG基因遺傳變異的影響，該基因的遺傳變異直接導(dǎo)致肌肉的變異[3]。

國(guó)內(nèi)外相關(guān)研究表明MyoG基因調(diào)節(jié)肌細(xì)胞分化成為肌纖維，與肉質(zhì)的生成有一定的聯(lián)系。劉梅等用PCR-RFLP技術(shù)對(duì)申農(nóng)Ι號(hào)豬的MyoG基因的兩個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)(3’端和第二內(nèi)含子內(nèi))進(jìn)行分析，研究發(fā)現(xiàn)AA基因型和MN基因型分別為兩個(gè)位點(diǎn)的優(yōu)勢(shì)基因型[4]。在滇南小耳豬MyoG基因多態(tài)性分析中發(fā)現(xiàn)2041，2047這兩個(gè)位點(diǎn)的多態(tài)性對(duì)背膘厚、pH24有顯著影響，對(duì)瘦肉率有極顯著影響；1655，1688這兩個(gè)位點(diǎn)多態(tài)性對(duì)瘦肉率和pH24有顯著影響，對(duì)背膘厚有極顯著影響[5]。程廣龍等[6]對(duì)長(zhǎng)淮豬、大淮豬、杜淮豬和淮豬的MyoG基因進(jìn)行研究，結(jié)果顯示胴體質(zhì)量、瘦肉率、眼肌面積等性狀與股二頭肌的肌纖直徑分別呈顯著正相關(guān)。高勤學(xué)等[7]對(duì)申農(nóng)I號(hào)豬MyoG基因進(jìn)行多態(tài)性分析，發(fā)現(xiàn)具有NN基因型的豬初生重顯著高于其他基因型豬，并且具有不同基因型的豬，它的半腱肌和半膜肌的肌纖維密度差異顯著，其中NN基因型肌纖維密度高于NM和MM基因型。TePas等[8]用PCR-RFLP技術(shù)對(duì)MyoG基因的多態(tài)性進(jìn)行了檢測(cè)，結(jié)果顯示有3個(gè)突變位點(diǎn)：其中，一個(gè)是在實(shí)驗(yàn)中研究的所有豬種共同特有的，一個(gè)是杜洛克豬和長(zhǎng)白豬特有的，另一個(gè)是梅山豬特有的。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明豬初生重、肌纖維數(shù)與這三個(gè)變異位點(diǎn)有一定的關(guān)聯(lián)。Huges等人的研究中發(fā)現(xiàn)，MyoD和MyoG基因在肌纖維中的表達(dá)不同，MyoD基因在快肌纖維中的表達(dá)量比較高，而MyoG基因在慢肌纖維中的表達(dá)量比較高。因此，MyoG基因與肉質(zhì)的風(fēng)味和嫩度有關(guān)聯(lián)[9]。另外在其他物種的MyoG基因也有類似研究，雞MyoG基因可以調(diào)節(jié)肌纖維的形成，對(duì)邊雞的生長(zhǎng)有影響[10]。對(duì)牦牛的MyoG基因進(jìn)行多態(tài)性分析，發(fā)現(xiàn)有4個(gè)突變位點(diǎn)與牦牛的體高有顯著影響[11]。對(duì)6個(gè)綿羊群體進(jìn)行多態(tài)性分析，發(fā)現(xiàn)含有三種基因型，MyoG基因?qū)ρ蛉獾乃趾蜕珴捎杏绊?，在水分的表達(dá)中BB>AB>AA；在色澤的表達(dá)中AB>BB>AA[12]。

本實(shí)驗(yàn)選用晉汾白豬和新山西黑豬作為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，采用PCR-SSCP的方法檢測(cè)MyoG基因多態(tài)性并判定基因型，利用統(tǒng)計(jì)分析軟件計(jì)算出基因頻率和基因型頻率，分析其基因型在兩豬種中的分布狀況，為研究MyoG基因?qū)x汾白豬、新山西黑豬肉質(zhì)影響提供一些材料，為人工選育優(yōu)良豬種提供依據(jù)，對(duì)如何生產(chǎn)出優(yōu)質(zhì)豬肉有重要指導(dǎo)意義。

1. 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

本實(shí)驗(yàn)選用山西省運(yùn)城市新龍豐畜牧有限公司提供的40頭晉汾白豬和40頭新山西黑豬，分別采集兩個(gè)豬種的豬耳組織1.0g，放入裝有75%無水乙醇的離心管中并標(biāo)號(hào)，放入冰盒中帶回實(shí)驗(yàn)室，在-20℃冰箱保存。

1.2 主要試劑與儀器設(shè)備

PCR mix，瓊脂糖，溴酚藍(lán)，冰醋酸，EB，甘油，DNA Marker，丙烯酰胺，過硫酸銨，亞甲叉雙丙烯酰胺，硼酸，Tris base TEMED等(購(gòu)自北京華越洋生物工程有限公司)；引物合成(上海生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司)；PCT-200PCR儀(BIO-RAD公司)；DYCZ-28D雙板夾芯式垂直電泳儀，DYY-6C恒溫恒壓電泳儀(北京六一生物科技有限公司)；Tanon-3500數(shù)碼凝膠圖像分析系統(tǒng)(武漢愛斯佩科學(xué)儀器有限公司)；TGL-16M高速臺(tái)式冷凍離心機(jī)(湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司)。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 基因組DNA提取及引物合成

使用酚/氯仿/異戊醇/的方法提取豬基因組DNA；根據(jù)Genebank發(fā)表的豬MyoG基因序列(U14331)并參考郭云雁[13]等人的實(shí)驗(yàn)進(jìn)行設(shè)計(jì)引物，并由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

1.3.2 PCR及SSCP

以DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，10微升反應(yīng)體系為：DNA(0.5微升)，上游引物(0.2微升)，下游引物(0.2微升)，2×Taq PCR Master Mix(5微升)，雙蒸水(4.1微升)；PCR反應(yīng)程序?yàn)椋侯A(yù)變性95℃，5min，94℃變性30s，50℃退火30s，72℃延伸30s，35個(gè)循環(huán)，72℃后延伸5min；PCR產(chǎn)物取其中的2微升用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，然后將檢測(cè)成功的PCR產(chǎn)物，取4微升與6微升6×Loading Buffer混勻，在98℃條件下變性10 min，迅速冰鎮(zhèn)10 min后上樣，在12%的聚丙烯酰胺凝膠中400 V，預(yù)電泳10 min，然后將電壓調(diào)為200 V，電泳16 h，然后銀染20min，顯影10～20min；最后利用凝膠成像系統(tǒng)拍照并判別基因型。

1.3.3 數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)處理

基因型結(jié)果利用PopGen32軟件進(jìn)行群體遺傳學(xué)分析，并利用SAS8.1統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行卡方檢驗(yàn)。

寨卡病毒感染可導(dǎo)致嚴(yán)重的神經(jīng)系統(tǒng)并發(fā)癥，開發(fā)疫苗保護(hù)易感人群至關(guān)重要。最近兩種DNA疫苗(VRC5288質(zhì)粒和VRC5283質(zhì)粒)已進(jìn)入臨床I期試驗(yàn)，通過對(duì)最后一次接種4周后的血樣分析發(fā)現(xiàn)，60%～89%接種VRC5288的受試者及77%～100%接種VRC5283的受試者產(chǎn)生了中和抗體應(yīng)答，并且該疫苗在試驗(yàn)中具有良好的耐受性及安全性，該試驗(yàn)鼓舞了DNA疫苗的研究，并加快了預(yù)防性疫苗的實(shí)際應(yīng)用[41]。

2. 結(jié)果與分析

2.1 PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果

利用晉汾白豬、新山西黑豬的DNA和MyoG引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，然后在1.5%的瓊脂糖凝膠上點(diǎn)樣，對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果如圖1所示。

圖1 PCR產(chǎn)物檢測(cè)結(jié)果(注：M為DL20000 maker，1～10為擴(kuò)增結(jié)果)

如圖1所示，MyoG基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度為300 bp，條帶明亮清晰，沒有雜帶，可進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.2 PCR-SSCP結(jié)果

用12%聚丙烯酰胺凝膠電泳對(duì)晉汾白豬和新山西黑豬的PCR產(chǎn)物進(jìn)行SSCP檢測(cè)，結(jié)果如圖2和圖3所示。

如圖2所示，電泳條帶比較清晰，MyoG基因在晉汾白豬中存在多態(tài)性，基因型為：1～7和11為AB型，8、10為AA型，9為BB型。

如圖3所示，電泳條帶比較清晰，MyoG基因在新山西黑豬中存在多態(tài)性，基因型為：3、4、6、9、11為AB型，5、7、10為AA型，1、2、8為BB型。

圖2 晉汾白豬PCR-SSCP結(jié)果(注：1～7、11為AB型，8、10為AA型，9為BB型)

圖3 新山西黑豬PCR-SSCP結(jié)果(注：1、2、8為BB型，3、4、6、9、11為AB型，5、7、10為AA型)

2.3 群體遺傳學(xué)分析

表1 MyoG基因在兩個(gè)豬種的基因頻率和基因型頻率

根據(jù)表1結(jié)果顯示，晉汾白豬中有三種基因型，其中AB有31個(gè)，BB有4個(gè)，AA有5個(gè)；新山西黑豬中有三種基因型，其中AB有27個(gè)，BB有8個(gè)，AA有5個(gè)；在晉汾白豬中A等位基因?yàn)閮?yōu)勢(shì)等位基因，AA基因型為優(yōu)勢(shì)基因型。說明AA基因型對(duì)于晉汾白豬的進(jìn)化具有促進(jìn)作用，在人工選育中具有AA基因型的豬更具有經(jīng)濟(jì)效益。新山西黑豬中B等位基因?yàn)閮?yōu)勢(shì)等位基因，BB基因型為優(yōu)勢(shì)基因型。說明在新山西黑豬中具有BB基因型的豬種在進(jìn)化的時(shí)候更具有優(yōu)勢(shì)，在人工選育中具有BB基因型的豬更具有經(jīng)濟(jì)效益。

表2 晉汾白豬、新山西黑豬遺傳分析結(jié)果

根據(jù)表2結(jié)果顯示，MyoG基因在晉汾白豬中卡方值為11.593389，p值為0.000662；MyoG基因在新山西黑豬中卡方值為4.762568，p值為0.029058，P值均小于0.05，所以在晉汾白豬、新山西黑豬中MyoG基因的多態(tài)性位點(diǎn)均不符合Hardy-Weinberg平衡。晉汾白豬的香農(nóng)指數(shù)(0.6928)大于新山西黑豬的香農(nóng)指數(shù)(0.6903)，說明晉汾白豬的遺傳多態(tài)性高于新山西黑豬。晉汾白豬的遺傳純合度(0.4940)小于新山西黑豬的遺傳純合度(0.4965)，說明新山西黑豬更能穩(wěn)定遺傳。

2.4 基因型分布差異分析

利用SAS8.1分析軟件，對(duì)MyoG基因在晉汾白豬、新山西黑豬中基因型分布進(jìn)行檢驗(yàn)，結(jié)果如表3所示。

表3 兩個(gè)豬種中MyoG基因型分布差異性檢驗(yàn)

根據(jù)表3結(jié)果顯示，χ2值為36.2080，p<0.0001。說明在晉汾白豬和新山西黑豬中MyoG基因型分布差異極顯著。

3. 討論與結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)選用了40頭晉汾白豬和40頭新山西黑豬作為樣本，采用PCR-SSCP的技術(shù)對(duì)MyoG基因進(jìn)行多態(tài)性分析。結(jié)果顯示MyoG基因在晉汾白豬中有三種基因型：AB、BB、AA，A基因?yàn)閮?yōu)勢(shì)等位基因，在新山西黑豬中有三種基因型：AB、BB、AA，B基因?yàn)閮?yōu)勢(shì)等位基因。MyoG基因在晉汾白豬中和新山西黑豬中的p值均小于0.05，表明MyoG基因的多態(tài)性位點(diǎn)在晉汾白豬、新山西黑豬中都不符合Hardy-Weinberg平衡。對(duì)比郭云雁[13]等人的實(shí)驗(yàn)，以180頭大白豬和170頭北京黑豬作為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，在北京黑豬與大白豬中A基因均為優(yōu)勢(shì)等位基因，在北京黑豬中基因型AB出現(xiàn)的頻率最高，基因型BB出現(xiàn)的頻率最低；在大白豬種中純合基因型AA的頻率最高，而BB基因型的頻率最低，并且MyoG基因在這兩個(gè)豬種中都處于Hardy-Weinberg平衡。在王立辛[14]等的實(shí)驗(yàn)中選用255頭大白豬、390頭長(zhǎng)白豬、155頭杜洛克豬，三個(gè)豬種共800頭作為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，結(jié)果顯示在這三個(gè)豬種中均存在三種基因型：AB、BB、AA，其中AB出現(xiàn)的頻率最高，并且B基因均為優(yōu)勢(shì)等位基因。群體遺傳學(xué)分析結(jié)果顯示MyoG基因多態(tài)性位點(diǎn)在大白豬、長(zhǎng)白豬和杜洛克豬中均處于Hardy-Weinberg平衡。

本實(shí)驗(yàn)與郭云雁、程篤學(xué)和王立辛、蘇玉虹等的研究結(jié)果相比，基因頻率、基因型頻率以及Hardy-Weinberg平衡不一致，原因可能有：本實(shí)驗(yàn)選用晉汾白豬和新山西黑豬為樣本，而郭云雁等人選用了大白豬和北京黑豬，王立辛、蘇玉虹等的實(shí)驗(yàn)中選用大白豬、長(zhǎng)白豬、杜洛克豬作為試驗(yàn)動(dòng)物，實(shí)驗(yàn)中選用的豬種不同，生活的環(huán)境、飼養(yǎng)方式、人工選育方法不同，其遺傳性能也會(huì)有差異；選用的豬品種經(jīng)過人工選育時(shí)人為擇優(yōu)選育也有可能會(huì)影響基因型頻率，從而影響Hardy-Weinberg平衡。對(duì)比郭云雁等人和王立辛、蘇玉虹等人的實(shí)驗(yàn)，本實(shí)驗(yàn)選取的樣品數(shù)量太少，本實(shí)驗(yàn)選取晉汾白豬和新山西黑豬樣本各40個(gè)，雖符合統(tǒng)計(jì)學(xué)樣本選取的最低要求，但是誤差比較大，容易出現(xiàn)特異性。