李華華，岳姣姣，牛虹，唐靜雯，岳光星

1鄭州大學附屬腫瘤醫(yī)院（河南省腫瘤醫(yī)院）中西醫(yī)結(jié)合科，鄭州450003

2河南中醫(yī)藥大學第三附屬醫(yī)院腦病科，鄭州450003

前列腺癌是老年男性的易發(fā)疾病，且轉(zhuǎn)移率較高，肥胖、高脂飲食以及雄激素水平異常是該疾病的高危因素[1-2]。多類原癌基因和抑癌基因表達已在前列腺癌的侵襲轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要的預測作用[3]。α-甲基酰基輔酶A消旋酶（alpha-methylacyl-CoAracemase，AMACR）可參與支鏈脂肪酸的β-氧化過程[4]。目前認為AMACR是前列腺癌形成的早期事件[5]，但其是否參與前列腺癌增殖分化等生物學進程，有待進一步研究。本研究首先采用免疫組化法對前列腺癌組織中AMACR的表達進行檢測，探究其與患者臨床特征的關系，并進一步判斷AMACR基因在前列腺癌生物學行為中的預測作用，以期闡述該基因在前列腺癌細胞增殖凋亡中的作用機制，從而為臨床診治和預后預測提供參考指標，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集2014年3月至2016年3月鄭州大學附屬腫瘤醫(yī)院收治的前列腺癌患者的病歷資料。納入標準：均經(jīng)過診斷確診為前列腺癌，診斷符合中國前列腺癌診斷治療指南中的診斷標準。排除標準：①術前接受過任何治療（如手術、放化療、內(nèi)分泌治療等）；②存在繼發(fā)性惡性腫瘤；③嚴重機能障礙。根據(jù)納入、排除標準，共納入55例前列腺癌患者，所有患者均為男性，年齡52～72歲，平均年齡（58.46±8.50）歲，取55例患者經(jīng)手術切除或穿刺活檢采集的前列腺癌組織。同時，選取同期在鄭州大學附屬腫瘤醫(yī)院行經(jīng)膀胱前列腺摘除手術的32例良性前列腺增生癥患者，年齡49～73歲，平均（62.12±9.03）歲，取32例患者的良性前列腺增生組織作為對照。所有采集組織均經(jīng)10%中性甲醛溶液固定，并石蠟包埋，4 μm連續(xù)切片，供后續(xù)研究。

1.2 主要試劑和儀器

AMACR免疫組化單克隆抗體購自福建邁新生物技術公司；RPMI-1640購自武漢普諾賽生命科技有限公司；Lipofectamine2000和Trizol試劑盒均購自美國Invitrogen公司；PrimescriptTMRT Reagent Kit逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和SYBR?Premix Ex TaqTMⅡ試劑盒均購自日本TaKaRa公司；ABI PRISM?7300系統(tǒng)購自美國ABI公司；RIPA試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司；Western blot抗體購自英國Abcam公司；CCK-8溶液購自上海申實生物科技有限公司；膜聯(lián)蛋白V（Annexin V）細胞凋亡檢測試劑盒購自上海碧云天生物技術有限公司；質(zhì)粒均購自于南京恩晶有限公司；流式細胞儀購自美國Coulter Electronics公司。

1.3 免疫組化檢測

采用免疫組織化學鏈酶菌抗生素蛋白-過氧化物酶法（streptavidin-perosidase，SP）[6]檢測前列腺癌組織和良性前列腺增生組織中AMACR的表達。將采集標本以10%中性甲醛溶液固定，常規(guī)石蠟包埋；常規(guī)脫蠟后梯度酒精脫水，微波抗原熱修復，并滴加3%山羊血清室溫封閉；滴加AMACR一抗，4℃孵育過夜；磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）沖洗后加入適量山羊抗鼠或山羊抗兔的二抗工作液；PBS沖洗3次×5 min，二氨基聯(lián)苯胺（diaminobenzidine，DAB）顯色 3～5 min，自來水充分沖洗。以已知陽性的前列腺癌切片為陽性對照，以PBS代替一抗為陰性對照。AMACR陽性表達呈棕黃色顆粒，無著色為陰性表達。

1.4 細胞培養(yǎng)與分組轉(zhuǎn)染

將前列腺癌細胞株DU145接種于培養(yǎng)基中，培養(yǎng)在37℃、5%CO2飽和濕度恒溫箱中備用。培養(yǎng)基由10%胎牛血清、RPMI-1640培養(yǎng)基、青鏈霉素組成。每隔24～48 h更換培養(yǎng)基，0.25%胰酶消化、傳代。選取對數(shù)生長期的細胞進行實驗，將細胞分為：Blank組、pcDNA-AMACR組（轉(zhuǎn)染AMACR過表達質(zhì)粒）、pcDNA-AMACR NC組（轉(zhuǎn)染AMACR過表達NC質(zhì)粒）、siRNA-AMACR組（轉(zhuǎn)染siRNA-AMACR質(zhì)粒）、siRNA-AMACR NC組（轉(zhuǎn)染siRNA-AMACR NC質(zhì)粒）。轉(zhuǎn)染前24 h將細胞接種于6孔板中，待細胞融合度達50%～80%時，在脂質(zhì)體Lipofectamine2000的介導下瞬時轉(zhuǎn)染前列腺癌細胞，轉(zhuǎn)染6 h換液，培養(yǎng)48 h后收集細胞用于后續(xù)實驗。

1.5 實時熒光定量聚合酶鏈反應（quantitative real-time polymerase chain reaction ，qRT-PCR）檢測轉(zhuǎn)染后各組細胞中相關mRNA表達水平

采用Trizol法提取細胞總RNA，測定RNA的濃度和純度。按照PrimescriptTMRT Reagent Kit逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書將樣品RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，總體系25 μl。將反轉(zhuǎn)錄獲得的cDNA中加入DEPC水稀釋，并充分混勻。取cDNA進行熒光定量PCR，參照SYBR?Premix Ex TaqTMⅡ試劑盒說明書進行熒光定量PCR操作。采用ABI PRISM?7300系統(tǒng)進行熒光定量PCR。檢測AMACR、核因子-kappa B抑制蛋白（inhibitor of nuclear factor kappa B，IκBα）、核因子κB（nuclear factor of kappa B，NF-κB）、Ki-67、B細胞淋巴瘤/白血病-2（B cell lymphoma/leukemia-2，Bcl-2）、B細胞淋巴瘤-2相關X蛋白（Bcl-2-associated X protein，BAX）mRNA表達水平。引物內(nèi)參為GAPDH。2-ΔΔCt表示實驗組與對照組目的基因表達的倍比關系。實驗重復3次，取均值。

1.6 Western blot檢測轉(zhuǎn)染后各組細胞中相關蛋白表達水平

轉(zhuǎn)染48 h后，使用總蛋白提取液RIPA試劑盒提取細胞總蛋白，用二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA）方法測定蛋白濃度。根據(jù)不同濃度進行定量，采用10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulphate-polyacryl amide gel electrophoresis，SDS-PAGE）分離蛋白后通過電轉(zhuǎn)移將蛋白轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜上，5%脫脂奶粉（TBS溶解）室溫下封閉1 h后滴加稀釋的一抗，GAPDH為參照。二抗為HRP標記的山羊抗兔IgG抗體。將膜浸入電化學發(fā)光（electrochemiluminescence，ECL）液中發(fā)光，在暗室顯影后觀察結(jié)果并拍照。檢測轉(zhuǎn)染后各組細胞中AMACR、IκBα、NF-κB、Ki-67、Bcl-2、BAX蛋白表達水平。實驗重復3次，取均值。

1.7 CCK-8法檢測各組細胞轉(zhuǎn)染后增殖能力

常規(guī)消化離心收集細胞，新鮮培養(yǎng)液重懸計數(shù)，并接種于96孔板，每孔200 μl。為防止蒸發(fā)，96孔板外圈滴加無菌生理鹽水封邊，同時對照孔用空白培養(yǎng)液進行設置。將96孔板放入37℃培養(yǎng)箱過夜，觀察細胞貼壁融合情況。將貼壁融合細胞繼續(xù)培養(yǎng)48 h，隨后每孔加入20 μl CCK-8溶液。經(jīng)1 h孵育后，采用預熱酶標儀測量并記錄各孔在450 nm處的吸光度值。實驗重復3次，取均值。

1.8 流式細胞儀檢測各組細胞轉(zhuǎn)染后凋亡情況

按照Annexin V細胞凋亡檢測試劑盒說明書進行操作。離心收集細胞，PBS洗3次，再次離心棄上清，細胞重懸于150 μl Binding Buffer中，加入10 μl Annexin V-異硫氰酸熒光素（fluorescein isothiocyanate，F(xiàn)ITC）和 5 μl碘化丙啶（propidium iodide，PI），輕輕混勻，避光室溫反應15 min，再加入150 μl Binding Buffer。采用流式細胞儀測定，結(jié)果以細胞凋亡率表示。實驗重復3次，取均值。

1.9 統(tǒng)計學分析

采用SPSS 21.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析。計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示，兩組比較采用t檢驗，多組比較采用單因素方差分析和重復測量方差分析，多組間兩兩比較采用q檢驗；計數(shù)資料以例數(shù)及率（%）表示，組間比較采用χ2檢驗或Fisher確切概率法。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 前列腺癌組織和良性前列腺增生組織中AMACR表達情況的比較

前列腺癌組織中AMACR的陽性表達率為74.55%（41/55），明顯高于良性前列腺增生組織的31.25%（10/32），差異有統(tǒng)計學意義（χ2=15.633，P=0.000）。（圖1）

圖1 前列腺癌組織和良性前列腺增生組織中AMACR的表達情況（免疫組化染色，×200）

2.2 不同臨床特征的前列腺癌患者的前列腺癌組織中AMACR表達情況的比較

不同年齡的前列腺癌患者的前列腺癌組織中AMACR表達情況比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；不同TNM分期、病理分級（Gleason分級）、腫瘤分期、術前列腺特異性抗原（prostate specific antigen，PSA）水平及有無遠處轉(zhuǎn)移的前列腺癌患者的前列腺癌組織中AMACR表達情況比較，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。（表1）

表1 不同臨床特征的前列腺癌患者的前列腺癌組織中AMACR表達情況的比較（ n=55）

2.3 各組細胞轉(zhuǎn)染后相關基因mRNA表達情況的比較

Blank組、pcDNA-AMACR NC組和siRNAAMACR NC組AMACR、IκBα、NF-κB、Ki-67、BAX、Bcl-2的mRNA表達水平比較，差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。與pcDNA-AMACR NC組相比，pcDNA-AMACR 組AMACR、IκBα、NF-κB、Ki-67、Bcl-2的mRNA表達水平均上升，BAX mRNA表達水平下降（P＜0.05）。與siRNA-AMACR NC組相比，siRNA-AMACR組的AMACR、IκBα、NF-κB、Ki-67、Bcl-2的mRNA表達水平均下降，BAXmRNA表達水平上升（P＜0.05）。（表2）

表2 各組細胞轉(zhuǎn)染后相關基因mRNA表達情況的比較（±s）

表2 各組細胞轉(zhuǎn)染后相關基因mRNA表達情況的比較（±s）

注：a與pcDNA-AMACR NC組比較，P＜0.05；b與siRNA-AMACR NC組比較，P＜0.05

組別Blank組pcDNA-AMACR NC組pcDNA-AMACR組siRNA-AMACR NC組siRNA-AMACR組F值P值AMACR 1.00±0.03 0.99±0.01 1.99±0.08a 0.94±0.03 0.51±0.03b 483.8＜0.01 IκBα 1.03±0.06 1.00±0.06 2.34±0.06a 1.01±0.05 0.60±0.04b 444.1＜0.01 NF-κB 0.99±0.06 1.04±0.04 2.16±0.08a 1.01±0.04 0.73±0.05b 325.5＜0.01 Ki-67 1.02±0.06 1.03±0.05 1.32±0.08a 0.98±0.02 0.54±0.06b 71.2＜0.01 BAX 1.02±0.04 0.96±0.06 0.36±0.04a 0.98±0.03 1.47±0.08b 166.0＜0.01 Bcl-2 0.98±0.05 1.02±0.04 1.65±0.08a 1.05±0.05 0.47±0.04b 180.0＜0.01

2.4 各組細胞轉(zhuǎn)染后相關蛋白表達情況的比較

Blank組、pcDNA-AMACR NC組和siRNAAMACR NC組 AMACR、IκBα、NF-κB、Ki-67、BAX、Bcl-2蛋白表達水平比較，差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。與pcDNA-AMACR NC組相比，pcDNA-AMACR 組 AMACR、IκBα、NF-κB、Ki-67、Bcl-2蛋白表達水平均上升，BAX表達水平下降（P＜0.05）。與siRNA-AMACR NC組相比，siRNAAMACR組AMACR、IκBα、NF-κB、Ki-67、Bcl-2蛋白表達水平均下降，BAX表達水平上升（P＜0.05）。（表3）

表3 各組細胞轉(zhuǎn)染后相關蛋白表達情況的比較（±s）

表3 各組細胞轉(zhuǎn)染后相關蛋白表達情況的比較（±s）

注：a與pcDNA-AMACR NC組比較，P＜0.05；b與siRNA-AMACR NC組比較，P＜0.05

組別Blank組pcDNA-AMACR NC組pcDNA-AMACR組siRNA-AMACR NC組siRNA-AMACR組F值P值AMACR 1.10±0.07 1.09±0.02 1.45±0.06a 1.11±0.03 0.63±0.05b 103.9＜0.01 IκBα 0.93±0.02 0.92±0.03 1.32±0.08a 0.93±0.05 0.73±0.04b 59.0＜0.01 NF-κB 0.83±0.04 0.84±0.06 1.10±0.04a 0.84±0.05 0.68±0.03b 33.7＜0.01 Ki-67 0.67±0.05 0.67±0.03 1.23±0.06a 0.66±0.03 0.36±0.03b 169.7＜0.01 BAX 0.64±0.03 0.64±0.04 0.40±0.04a 0.63±0.05 0.94±0.06b 54.1＜0.01 Bcl-2 0.61±0.05 0.61±0.06 1.21±0.08a 0.62±0.05 0.42±0.06b 72.8＜0.01

2.5 各組細胞增殖能力的比較

24 h時各組細胞吸光度值比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。48、72、96 h時，Blank組、pcDNAAMACR NC組和siRNA-AMACR NC組吸光度值比較，差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；與pcDNAAMACR NC組相比，pcDNA-AMACR組細胞吸光度值均上升（P＜0.05）；與siRNA-AMACR NC組相比，siRNA-AMACR組細胞吸光度值均下降（P＜0.05）。（表 4）

2.6 各組細胞凋亡情況的比較

Blank組、pcDNA-AMACR NC組和siRNAAMACR NC組細胞凋亡率比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。與pcDNA-AMACR NC組相比，pcDNA-AMACR組細胞凋亡率下降（P＜0.05）。與siRNA-AMACR NC組相比，siRNA-AMACR組細胞凋亡率上升（P＜0.05）。（圖2、表5）

3 討論

隨著分子生物學研究的深入，基因治療在腫瘤治療中逐漸普遍應用。前列腺癌的基因治療通?；谌缦峦緩剑撼聊侔┗蚬δ芑蛐迯鸵职┗蚬δ艿某C正性基因治療[7]；提高機體免疫力的腫瘤免疫性基因治療[8]、自殺性基因治療[9]等。基因治療已在眾多實驗研究中取得一定進展，但其臨床應用尚存在較多局限。在沉默促癌基因功能研究中，RNA干擾技術媲美基因敲除，可特異性、高效持久地實現(xiàn)對特定基因表達的干擾，因而已成為前列腺癌基因研究中的常見工具。例如，Xu等[10]就在前列腺癌PC3細胞系研究中發(fā)現(xiàn)采用shRNA靶向IgG基因能顯著提高PC3細胞對放療的敏感性，解釋以IgG基因為靶點的干擾RNA聯(lián)合放療在治療前列腺癌中的有效性。Yang等[11]報道Ezrin在前列腺癌組織中高度表達，Ezrin基因沉默導致E-鈣黏蛋白水平上調(diào)，N-鈣黏蛋白水平下調(diào)，從而抑制前列腺癌PC3細胞的增殖和侵襲。基于既往研究支持和本實驗驗證，證實干擾AMACR基因表達在前列腺癌基因治療中的潛在價值。

表4 各組細胞吸光度值的比較（±s）

表4 各組細胞吸光度值的比較（±s）

注：a與pcDNA-AMACR NC組比較，P＜0.05；b與siRNA-AMACR NC組比較，P＜0.05

組別Blank組pcDNA-AMACR NC組pcDNA-AMACR組siRNA-AMACR NC組siRNA-AMACR組F值P值24 h 0.21±0.01 0.23±0.03 0.22±0.02 0.22±0.03 0.23±0.02 0.389 0.812 48 h 0.44±0.03 0.48±0.05 0.69±0.03a 0.49±0.05 0.36±0.05b 23.89＜0.01 72 h 0.59±0.05 0.61±0.06 0.84±0.04a 0.63±0.05 0.50±0.03b 21.26＜0.01 96 h 0.70±0.06 0.73±0.05 1.05±0.06a 0.74±0.06 0.62±0.05b 25.70＜0.01

圖2 流式細胞術檢測各組細胞凋亡情況

表5 各組細胞凋亡率的比較（±s）

表5 各組細胞凋亡率的比較（±s）

注：a與pcDNA-AMACR NC組比較，P＜0.05；b與siRNA-AMACR NC組比較，P＜0.05

組別Blank組pcDNA-AMACR NC組pcDNA-AMACR組siRNA-AMACR NC組siRNA-AMACR組F值P值細胞凋亡率（%）9.01±0.55 8.93±0.60 6.02±0.43a 8.97±0.56 15.67±0.78b 107.6＜0.01

AMACR在支鏈氨基酸的氧化和衍生過程中作用顯著，其已部分應用于臨床前列腺癌診斷中[12]。本研究首先采用免疫組化驗證AMACR在前列腺癌患者中的表達并揭示其與患者臨床特征的關系，提示AMACR表達與前列腺癌患者TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、病理分級、腫瘤分期和術前PSA水平有關。該結(jié)果為后文AMACR與前列腺癌細胞生物學特性探究奠定一定基礎。本實驗通過AMACR過表達和沉默表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)染，觀察pcDNAAMACR和siRNA-AMACR對體外培養(yǎng)的DU145細胞相關因子表達的影響，以及對細胞增殖及凋亡的作用。由于pcDNA-AMACR和siRNA-AMACR本身可能會產(chǎn)生一定的細胞增殖促進或抑制作用，其可能會影響結(jié)果的判斷和理解，因此，本實驗同時設立pcDNA-AMACR NC組和siRNAAMACR NC組作為陰性對照，提高實驗結(jié)果的可信度。本實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)：與pcDNA-AMACR NC組相比，pcDNA-AMACR組 AMACR、IκBα、NF-κB、Ki-67、Bcl-2蛋白和mRNA表達水平均上升，BAX蛋白和mRNA表達水平均下降，細胞增殖能力上升，細胞凋亡率降低。同時，與siRNA-AMACR NC組相比，siRNA-AMACR組AMACR、IκBα、NF-κB、Ki-67、Bcl-2蛋白和mRNA表達水平均降低，BAX蛋白和mRNA表達水平均上升，細胞增殖能力降低，細胞凋亡率升高。具體分析可知，通過qRTPCR和Western blot檢測發(fā)現(xiàn)，pcDNA-AMACR轉(zhuǎn)染的AMACR促表達處理導致AMACR表達上調(diào)，以及NF-κB 信號通路相關因子 IκBα和 NF-κB[13]、細胞增殖標志物Ki-67[14]、抑制細胞凋亡因子Bcl-2的表達呈上調(diào)趨勢，而抑制促凋亡因子BAX[15]的表達水平；反之，siRNA-AMACR轉(zhuǎn)染的AMACR抑制表達處理導致AMACR表達下調(diào)，并抑制IκBα、NF-κB、Ki-67、Bcl-2表達水平，而促進BAX的表達。推測調(diào)控AMACR基因表達可通過調(diào)節(jié)NF-κB信號通路的激活，進而對前列腺癌細胞增殖和凋亡產(chǎn)生影響。鑒于此，本實驗進一步采用CCK-8法和流式細胞術驗證上述推測，揭示上調(diào)AMACR基因表達可促進細胞增殖，降低細胞凋亡，而下調(diào)AMACR基因表達則可抑制細胞增殖，促進細胞凋亡。

綜上所述，本實驗通過沉默AMACR基因，抑制IκBα、NF-κB、Ki-67、Bcl-2表達水平，促進BAX表達，進而抑制NF-κB信號通路的激活，從而抑制前列腺癌細胞增殖并誘導細胞凋亡。本實驗為AMACR基因作為前列腺癌診療的一種特異性腫瘤標志物提供了一定的實驗參考。