蔣云，沈成興，潘靜薇，王占成，宋艷秋

高尿酸血癥是排除糖尿病、高血壓、肥胖等危險因素之外的又一可引起心血管疾病及慢性腎臟疾病發(fā)生的獨立危險因素，患者血清炎癥指標(biāo)呈高表達(dá)，機(jī)體損傷的嚴(yán)重程度與機(jī)體的炎癥反應(yīng)直接相關(guān)[1]。近年來，在慢性腎臟疾病、痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎、動脈粥樣硬化等諸多疾病中均發(fā)現(xiàn)有亮氨酸富集的核苷酸結(jié)合寡聚結(jié)構(gòu)域3蛋白（NLRP3）炎癥小體的存在，NLRP是模式識別受體的一類，NLRP3是其中一種研究相對清楚的受體，該受體與凋亡相關(guān)點樣蛋白及胱天蛋白酶-1前體結(jié)合后將發(fā)生寡聚生成NLRP3炎癥小體[2]。該炎癥小體在發(fā)生活化期間會加速caspase-1前體自我催化并生成活化caspase-1，活化的caspase-1又將剪切白細(xì)胞介素-1β等前體至成熟形式并向細(xì)胞外分泌，參加多種自身炎癥性疾病的發(fā)病[3]。細(xì)胞焦亡是近幾年才被發(fā)現(xiàn)的一種新的炎癥性程序細(xì)胞死亡模式，多種外刺激信號會通過相關(guān)途徑激活caspase-1，誘發(fā)細(xì)胞發(fā)生細(xì)胞焦亡，這種細(xì)胞焦亡雖有別于細(xì)胞凋亡，但其同時具備凋亡與壞死的特征[4]。炎癥小體是經(jīng)典細(xì)胞交往的模式，近幾年隨著生物學(xué)研究的進(jìn)展，一種未被關(guān)注的蛋白質(zhì)-gasdermin D（GSDMD）的出現(xiàn)為細(xì)胞焦亡機(jī)制的研究帶來新的收獲[5]。但該蛋白質(zhì)對內(nèi)皮細(xì)胞焦亡的具體誘導(dǎo)機(jī)制尚未明確，且相關(guān)研究也不多見。本研究主要觀察高尿酸血癥是否會誘導(dǎo)NLRP3炎癥小體活化GSDMD導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞焦亡，旨在為未來內(nèi)皮細(xì)胞焦亡具體機(jī)制深入研究提供參考?，F(xiàn)報道如下：

1 材料與方法

1.1 材料HUVEC培養(yǎng)基、內(nèi)皮細(xì)胞（ECM）培養(yǎng)基。主要試劑：均由德國Sigma公司提供，包括Percoll P1644、Uric acid U2625 25 g、LPS L2630 10 mg、Anti-NLRP3 antibody、Anti-caspase3 antibody、Anti-caspase4 antibody、Anti-GSDMD antibody，尿酸粉末購自湖北鑫潤德化工有限公司，批號：170612，cck-8試劑盒購自默沙克生物科技公司。主要緩沖液與其他試劑：ECM、PBS、D-Hank's、0.25%（或 0.125%）胰蛋白酶溶液、細(xì)胞凍存液、4%多聚甲醛、封閉用10%正常羊血清、RIPA裂解緩沖液、5*SD上樣緩沖液、BSA、40%，Acr/Bic（37.5:1）、0.5MTris-HCL（PH6.8）、IMTris.HCL（PH7.5）、1.5MTrisHCL（PH8.8）、10%SDS、10%AP、Tris-甘氨酸電泳緩沖液、10x麗春紅染色液、20%Tween-20（v/v）、封閉液（含5%脫脂奶粉的 TBST）。

1.2 實驗材料的培養(yǎng)來源于ATCC細(xì)胞庫的120份人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVEC）。（1）HUVEC培養(yǎng)：將分離得到的HUVEC懸液的細(xì)胞密度調(diào)定為1×106/ml，取4 ml接種在25 cm2細(xì)胞培養(yǎng)瓶內(nèi)，放置在5%二氧化碳、95%空氣細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)，37℃靜置培養(yǎng)24 h。培養(yǎng)24 h后更換培養(yǎng)液，將未貼壁細(xì)胞去除，后每隔24 h半量更換培養(yǎng)液1次，指導(dǎo)細(xì)胞生長至融合狀態(tài)。（2）HUVEC傳代培養(yǎng)：①將無菌的PBS、0.125%的胰蛋白酶溶液、ECM預(yù)熱至37℃。②將細(xì)胞生長至融合狀態(tài)的25 cm2擴(kuò)細(xì)胞培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)液吸棄，加入PBS清洗，后加入1 ml 0.25%胰蛋白酶。③顯微鏡觀察，細(xì)胞皺縮迅速吸棄胰蛋白酶，加入含有FBS的ECM完全培養(yǎng)基中止消化。④處理后置于5%CO2/95%空氣細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，時間為24 h。⑤培養(yǎng)結(jié)束后更換培養(yǎng)液，直至細(xì)胞生長成為融合狀態(tài)。

1.3 實驗材料處理方法（1）HUVEC凍存：①細(xì)胞凍存前24 h將培養(yǎng)液更換。②收集對數(shù)生長期HUVEC（無菌操作下），吸棄培養(yǎng)基使用PBS清洗，加入胰蛋白酶溶液消化。③顯微鏡觀察，細(xì)胞皺縮吸棄胰蛋白酶，加速ECM完全培養(yǎng)基中止消化；④制作細(xì)胞懸液并進(jìn)行細(xì)胞計數(shù)；⑤離心棄上清加入細(xì)胞凍存液，重懸細(xì)胞，保證細(xì)胞密度達(dá)到指定范圍，并轉(zhuǎn)存。⑥使用白膠布封閉凍存并標(biāo)記。（2）HUVEC復(fù)蘇：①取出凍存管，置入水浴箱，融化后取出擦拭消毒；②無菌操作轉(zhuǎn)移細(xì)胞懸液至離心管；離心后加入ECM洗滌；③離心后棄上清，加速重懸細(xì)胞轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)瓶，在5%CO2/95%空氣細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h；④更換培養(yǎng)液，指導(dǎo)細(xì)胞生長至融合狀態(tài)；⑤HUVEC分離與培養(yǎng)至第4～7代，待融合90%，將上清液去除，使用PBS清洗，使用胰蛋白酶消化，用EGM-2終止消化，離心后去上清，細(xì)胞計數(shù)板計數(shù)，調(diào)制細(xì)胞懸液，分別將細(xì)胞懸液滴入6孔板，培養(yǎng)24 h吸出原培養(yǎng)液。

1.3 分組與處理方法

1.3.1 分組方法按隨機(jī)數(shù)表法將培養(yǎng)的成功的120份HUVEC細(xì)胞分為3組。

1.3.2 尿酸-HUVEC細(xì)胞培養(yǎng)基配制稱取尿酸粉末15 mg，置于無菌細(xì)胞培養(yǎng)瓶內(nèi)，無菌操作，將培養(yǎng)基加入培養(yǎng)瓶，避光震蕩混勻加入培養(yǎng)基50 ml，制成30 mg/dl尿酸培養(yǎng)基溶液；尿酸培養(yǎng)基制作完成后需避光保存，在保存期間定期使用倒置相差顯微鏡與偏振光顯微鏡觀察尿酸-培養(yǎng)基的情況，若有異常情況發(fā)生則需要重新校正尿酸的濃度。實驗前將尿酸培養(yǎng)液換算為μmol/L，分別制備500、1000、1500 μmol/l的尿酸溶液。

1.3.3 分組處理將分組后產(chǎn)生的3組細(xì)胞分別進(jìn)行處理，每種濃度兩個孔，HUVEC+ECM+500 μmol/L濃度尿酸，HUVEC+ECM+1000 μmol/L濃度尿酸，HUVEC+ECM+1500 μmol/L濃度尿酸。

1.3.4 培養(yǎng)基與細(xì)胞處理收集培養(yǎng)基在2 ml EP離心管內(nèi)，經(jīng)13000 r/min轉(zhuǎn)速離心10 min，使用PBS液沖洗，將細(xì)胞刮下，使用2 ml EP管采集細(xì)胞，在4℃條件下經(jīng)10000 r/min轉(zhuǎn)速離心3 min，棄上清液。采用Western blot與免疫熒光測定細(xì)胞caspase-3、caspase-4、NLRP3及GSDMD表達(dá)；同時測定各組內(nèi)皮細(xì)胞LDH釋放量。使用CCK-8試劑盒檢測各組各組尿酸濃度下內(nèi)皮細(xì)胞的細(xì)胞活力，計算不同濃度內(nèi)皮細(xì)胞活力下降率。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理應(yīng)用SPSS 20.0統(tǒng)計學(xué)軟件處理數(shù)據(jù)，以（±s）表示計量資料，三組間比較采用單因素方差分析檢驗，以百分比表示計數(shù)資料，用χ2檢驗，P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 高尿酸引起的血管內(nèi)皮細(xì)胞活力下降分別使用不同濃度的尿酸（500、1000、1500 μmol/L）處理12 h、24 h，使用CCK-8試劑盒檢測各組細(xì)胞的細(xì)胞活力后結(jié)果顯示，在處理12 h的實驗?zāi)Ｐ蛢?nèi)，僅有1500 μmol/L濃度的尿酸能夠明顯降低HUVECS的細(xì)胞活力，細(xì)胞活力下降率為50.00%（20/40）；在處理24 h的實驗?zāi)Ｐ蛢?nèi)，各濃度尿酸組HUVECS細(xì)胞的細(xì)胞活力均有下降，各組細(xì)胞活力下降率分別為25.00%（10/40）、65.00%（26/40）、80.00%（32/40），可見隨著尿酸濃度增加，HUVECS細(xì)胞的細(xì)胞活力隨之下降，各濃度間比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=26.335，P＜0.001）。

2.2 不同尿酸濃度制備內(nèi)皮細(xì)胞caspase-3、caspase-4、NLRP3及GSDMD表達(dá)比較隨著尿酸濃度的升高，內(nèi)皮細(xì)胞caspase-3、caspase-4、NLRP3及GSDMD表達(dá)隨之升高，組間比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）（表1）。各尿酸濃度下各蛋白表達(dá)對照見圖1。

表1 不同尿酸濃度制備內(nèi)皮細(xì)胞caspase-3、caspase-4、NLRP3及GSDMD表達(dá)比較（±s）

表1 不同尿酸濃度制備內(nèi)皮細(xì)胞caspase-3、caspase-4、NLRP3及GSDMD表達(dá)比較（±s）

注：與500 μmol/L比較，aP＜0.05；與1000μmol/L，bP＜0.05

尿酸濃度 n caspase-3相對表達(dá)GSDMD相對表達(dá)500 μmol/L 40 0.51±0.07 0.32±0.05 0.31±0.04 1.02±0.04 1000 μmol/L 40 0.62±0.08a 0.41±0.06a 0.40±0.05a 1.51±0.05a 1500 μmol/L 40 0.71±0.09ab 0.52±0.07ab 0.50±0.06ab 1.78±0.07ab F值 - 62.062 109.455 140.779 1979.111 P值 - ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001 caspase-4相對表達(dá)NLRP3相對表達(dá)

圖1 不同尿酸濃度下各蛋白相對表達(dá)情況

3 討論

尿酸是由內(nèi)源性核酸分解后及食物內(nèi)攝入嘌呤經(jīng)核苷酶分解后形成的次黃嘌呤，在黃嘌呤產(chǎn)生的氧化酶作用下轉(zhuǎn)化為黃嘌呤后，進(jìn)一步降解生成的[6]。當(dāng)機(jī)體血清尿酸濃度超過0.07 g/L（男性）或0.06 g/L（女性）時，即可誘發(fā)高尿酸血癥。流行病學(xué)研究指出，血尿酸高水平表達(dá)與高血壓、糖尿病、代謝綜合征、腎臟損害等心血管疾病發(fā)生緊密相關(guān)[7]。

血管內(nèi)膜表面有血管內(nèi)皮覆蓋，血管內(nèi)皮不僅僅只是對血管內(nèi)膜產(chǎn)生保護(hù)之效，同時還是關(guān)鍵的內(nèi)分泌與旁分泌器官，參加調(diào)節(jié)血管壁的透通性、維持血管舒縮功能平衡、調(diào)節(jié)凝血功能平衡與血管炎癥反應(yīng)等過程，對維持正常的心血管功能有著重要意義[8-10]。隨著1973年“內(nèi)皮功能障礙”假說的提出，后大量的研究認(rèn)為，不管是血尿酸水平正常亦或是異常者，其血清水平與內(nèi)皮細(xì)胞功能均呈負(fù)相關(guān)，即隨著血清尿酸水平的升高，機(jī)體內(nèi)皮功能將發(fā)生障礙，且功能障礙程度逐漸加重[12,13]。對于2型糖尿病患者及慢性心力衰竭患者而言，別嘌呤可以幫助內(nèi)皮細(xì)胞改善，且二者之間的關(guān)系為劑量-效應(yīng)關(guān)系。近期的研究指出，高尿酸血癥具有氧化應(yīng)激促內(nèi)皮細(xì)胞凋亡及活化NLRP3炎癥小體的作用[14]。

細(xì)胞焦亡作為炎性程序性細(xì)胞死亡新模式，體外多種刺激信號會通過各種途徑對caspase-1、caspase-4、caspase-5等直接激活，從而導(dǎo)致細(xì)胞焦亡發(fā)生。細(xì)胞焦亡的形態(tài)學(xué)具有細(xì)胞死亡與凋亡的特點，但又與其有著明顯的差別。細(xì)胞焦亡與細(xì)胞凋亡相似的是，二者均會出現(xiàn)細(xì)胞核濃縮及染色質(zhì)DNA斷裂等情況；而細(xì)胞焦亡與細(xì)胞凋亡的差異之處在于，細(xì)胞焦亡期間細(xì)胞膜將出現(xiàn)空隙，破壞細(xì)胞膜完整性，損傷細(xì)胞膜進(jìn)出物質(zhì)調(diào)控能力，溶解細(xì)胞膜，大量細(xì)胞內(nèi)容物由空隙處釋放，進(jìn)而誘發(fā)炎癥反應(yīng)[15]。同時細(xì)胞焦亡發(fā)生期間還將釋放出大量白介素-18及白介素-1β，二者均是炎癥細(xì)胞介質(zhì)，在募集更多的炎癥細(xì)胞因子后，會擴(kuò)大炎癥反應(yīng)。按照功能差異，可將Caspase分為炎性半胱氨酸蛋白酶與凋亡半胱氨酸蛋白酶，但需要注意的是，細(xì)胞焦亡不是一種經(jīng)傳統(tǒng)凋亡分子所介導(dǎo)的過程，其主要炎性半胱氨酸蛋白酶所介導(dǎo)，在人體中炎性半胱氨酸蛋白酶常見Caspase-4與Caspase-5。研究證實，無論是小鼠亦或是人體，均有兩種途徑的細(xì)胞焦亡模式，即經(jīng)典細(xì)胞焦亡與非經(jīng)典細(xì)胞焦亡，無論是哪種焦亡模式均在激活后參加了諸多疾病的發(fā)生發(fā)展[16]。

半胱氨酸蛋白酶-1前體與模式識別受體經(jīng)接頭蛋白間接連接形成的高分子復(fù)合物即炎癥小體，在病原微生物的刺激下，炎癥小體能加工無活性半胱氨酸蛋白酶-1前體，并發(fā)生裂解，從而形成誘惑性的Caspase-1，來誘導(dǎo)細(xì)胞膜穿孔發(fā)生，致細(xì)胞的溶解并死亡，細(xì)胞膜的不完整性將利于胞內(nèi)物質(zhì)外流，從而引發(fā)炎癥[17]。上述機(jī)制是經(jīng)典的細(xì)胞焦亡途徑。隨著現(xiàn)代生物學(xué)的發(fā)展，在2015年Nature上刊登了并報道了一種未被關(guān)注的蛋白質(zhì)Gasdermin-D（GSDMD），該實驗指出在未檢出GSDMD小鼠內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)，由NLRP3等炎癥小體介導(dǎo)的細(xì)胞焦亡未啟動成功，提示內(nèi)皮細(xì)胞焦亡可能有GSDMD活化的參與[18]。既往研究指出，受LPS刺激，Caspase-4、Caspase-5將直接結(jié)合LPS并啟動細(xì)胞焦亡，使得細(xì)胞膜發(fā)生穿孔、溶解與死亡，從而誘發(fā)炎癥反應(yīng)[19]。這種依賴于Caspase-4、Caspase-5并發(fā)生在人體內(nèi)細(xì)胞死亡模式是非經(jīng)典細(xì)胞焦亡模式，其機(jī)制已經(jīng)得到證實[20]。

因LPS刺激炎癥反應(yīng)導(dǎo)致的細(xì)胞焦亡已被證實是非經(jīng)典的細(xì)胞焦亡模式，故本研究將其作為對照，來觀察高尿酸血癥誘導(dǎo)NLRP3炎癥小體活化GSDMD是否會導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞焦亡的發(fā)生。本研究結(jié)果顯示，在受不同濃度尿酸刺激后，隨著尿酸濃度的升高，內(nèi)皮細(xì)胞caspase-3、caspase-4、NLRP3及GSDMD表達(dá)隨之升高，該結(jié)果與受LPS刺激的細(xì)胞變化模式一致，可以推測高尿酸誘導(dǎo)的NLRP3炎癥小體活化GSDMD參與并推動了內(nèi)皮細(xì)胞焦亡，GSDMD是細(xì)胞焦亡發(fā)生進(jìn)展的關(guān)鍵物質(zhì)。這可能與活化的Gaspase-5、Caspase-5能夠裂解GSDMD蛋白有關(guān)，GSDMD蛋白裂解后N端將介導(dǎo)細(xì)胞溶解與焦亡；此外，還可激活NLRP3炎癥小體活化Caspase，生成IL-18、IL-1β等炎癥介質(zhì)，機(jī)體發(fā)生炎癥反應(yīng)后，活化的Caspase-5與Caspase-5將激活通道Pannexin-1，釋放出大量的ATP從而導(dǎo)致細(xì)胞膜相關(guān)通道開放，使細(xì)胞膜形成小孔從而誘導(dǎo)細(xì)胞焦亡。但目前國內(nèi)尚缺乏CSDMD介導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞焦亡的相關(guān)研究，故本研究所得結(jié)果并未得到較多的循證學(xué)依據(jù)證實，結(jié)果的真實性與可靠性還應(yīng)在未來展開大量的實驗研究加以驗證。

綜上所述，高尿酸血癥可引起內(nèi)皮細(xì)胞NLRP3炎癥小體激活，誘發(fā)細(xì)胞炎癥反應(yīng)，通過介導(dǎo)細(xì)胞中GSDMD活性，從而引起內(nèi)皮細(xì)胞焦亡的發(fā)生。