呂翠，張亮，黃軍，劉清術(shù)，鄭井元，王運(yùn)生，戴良英，陳武*

(1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，湖南 長沙 410128；2.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，湖南 長沙 410128；3.湖南省微生物研究院，湖南 長沙 410009；4.湖南省蔬菜研究所，湖南 長沙 410125)

內(nèi)生菌作為植物微生態(tài)系統(tǒng)的重要組成部分，幾乎可定殖于植物的各個(gè)組織，它們之間存在共生、競爭和對抗等各種關(guān)系[1]。辣椒組織中存在大量內(nèi)生菌。LEE 等[2]從辣椒果實(shí)中篩選到能拮抗辣椒炭疽病的內(nèi)生菌，對辣椒炭疽病的盆栽防效可達(dá)79%；YANG等[3]從辣椒植株根際和葉片中分離到17 株生防菌，其中對疫病的防效最高達(dá)92.3%；李娟等[4]從辣椒植株的莖、葉和果肉中分離到能拮抗辣椒疫霉病菌(Phytophthora capsici)、辣椒黑霉病菌(Stemphylium botryosum) 和辣椒炭疽病菌(Colletotrichum capsici)的解淀粉芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefaciens)，對辣椒疫病的生防效果達(dá)到74%。

將分離自不同生態(tài)位，或者具有不同抑菌活性的生防菌株進(jìn)行復(fù)配，可以實(shí)現(xiàn)多菌株之間的優(yōu)勢互補(bǔ)，增加自然競爭力和存活力，提高防病效果[5]。李鳳等[6]將生防菌株B01-2 和B23-1 復(fù)配，對撐綠雜交竹枯萎病的防效達(dá)81.5%，高于單一菌株B01-2(70.4%) 與B23-1(63.0%) 的防效；張維等[7]發(fā)現(xiàn)復(fù)配拮抗菌群FP246(沙福芽孢桿菌YJC-4、枯草芽孢桿菌CY106/CY111)對煙草黑脛病的溫室盆栽平均防效為85.40%，優(yōu)于單一菌株的防效。

辣椒果實(shí)胎座是著生種子的組織，也是合成和貯存辣椒素的主要部位。筆者以辣椒白絹病菌(Sclerotium rolfsiiSacc.)為靶標(biāo)菌，嘗試分離和鑒定辣椒果實(shí)胎座中的拮抗細(xì)菌，并通過盆栽試驗(yàn)對部分拮抗菌株的生防效果進(jìn)行觀察測試，以期為防治辣椒白絹病提供生防菌資源。

1 材料與方法

1.1 材料

供試?yán)苯菲贩N博辣天星、辣椒白絹病菌(SclerotiumrolfsiiSacc.)LJB-2、辣椒疫病病原菌(Phytophthora capsici)LYB-1 和辣椒炭疽病菌(Colletotrichumcapsici)LCB-3，均由湖南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜研究所提供。

1.2 方法

1.2.1 辣椒果實(shí)胎座內(nèi)生細(xì)菌的分離純化與鑒定

辣椒果實(shí)用75%乙醇表面消毒[8]后，在超凈臺內(nèi)將其撕開，取果實(shí)胎座0.5 g，研磨成勻漿后加入1 mL 無菌水，2 000 r/min 離心2 min，取上清液100 μL，分別在PDA 培養(yǎng)基[9]、辣椒根際土壤培養(yǎng)基、辣椒葉培養(yǎng)基和辣椒根系培養(yǎng)基[10]的固體平板上涂布均勻，30 ℃恒溫培養(yǎng)2 d，分別統(tǒng)計(jì)菌落數(shù)量，按照文獻(xiàn)[11]的方法，對菌落類型進(jìn)行分類。

將分離得到的辣椒胎座內(nèi)生細(xì)菌進(jìn)行單菌落劃線純化。以辣椒白絹病菌LJB-2 作為靶標(biāo)菌，將白絹病菌菌塊接種于NB 平板中央，挑取純化的單菌落接種于距平板中央2.5 cm 處的3 個(gè)角點(diǎn)處，以僅接白絹病菌LJB-2 的平板作對照，每處理3 次重復(fù)。30 ℃恒溫培養(yǎng)7 d，觀察菌株的拮抗作用，測定病原菌菌落擴(kuò)展半徑，并計(jì)算各個(gè)菌株的菌落生長抑制率[12]。另分別以辣椒疫病LYB-1 和辣椒炭疽病LCB-3 為靶標(biāo)菌，測試內(nèi)生菌株的廣譜抑菌活性。

參考試劑盒說明書提取各個(gè)細(xì)菌菌株的基因組DNA，PCR 擴(kuò)增16S rRNA 的通用引物序列為27F(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)和1 492R (5-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3′)。PCR 反應(yīng)體系(50 μL)：2×EasyTaqPCR SuperMix 25 μL、引物27F 1.5 μL、引物1 492R 1.5 μL，用ddH2O 補(bǔ) 足 至 50 μL。PCR 反應(yīng)程序：98 ℃預(yù)變性5 min； 94 ℃變性30 s；退火30 s，延伸90 s(30 個(gè)循環(huán))； 72 ℃延伸10 min。將所得PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物送上海生工生物工程股份有限公司測序。將測序結(jié)果進(jìn)行BLAST 比對，運(yùn)用MEGA7.0 軟件構(gòu)建菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.2 生防菌株防控白絹病的盆栽試驗(yàn)

將辣椒種子播于育苗盆中，待辣椒苗長至6 葉期時(shí)，移栽至25 cm×20 cm×16 cm 的花盆中，每盆1 株，每盆1 500 g 土壤。設(shè)2 個(gè)單菌菌懸液、菌懸液等比例混合、空白對照(ddH2O)4 個(gè)處理。每株辣椒苗根部澆施100 mL 菌懸液，3 d 后接種辣椒白絹病菌，每處理15 株辣椒苗，重復(fù)3 次，接種后30 d觀察辣椒白絹病的發(fā)病情況，記錄發(fā)病率并計(jì)算防效。菌種活化及接種方法如下。

分別在LB 固體培養(yǎng)基上劃線活化生防菌株，挑單菌落接種于LB 液體培養(yǎng)基過夜培養(yǎng), 按5%比例將新鮮種子液接種到LB 發(fā)酵培養(yǎng)基中，30 ℃、220 r/min 發(fā)酵培養(yǎng)15 h，離心，收集菌體，再用ddH2O 重懸至菌體密度為1×108cfu/mL，備用。

在PDA 平板上活化培養(yǎng)辣椒白絹病菌，取直徑5 mm 菌餅接種麥粒培養(yǎng)基[13]，每瓶培養(yǎng)基接種5～6 個(gè)菌餅，28 ℃培養(yǎng)，待菌絲長滿麥粒的表面，取一顆麥粒貼于長至6 葉期的辣椒苗莖基部。

2 結(jié)果與分析

2.1 辣椒果實(shí)胎座生防細(xì)菌的鑒定結(jié)果

對PDA 培養(yǎng)基、辣椒根際土壤培養(yǎng)基、辣椒葉培養(yǎng)基和辣椒根系培養(yǎng)基上的菌落分別計(jì)數(shù)，并根據(jù)菌落外觀形態(tài)特征對菌株進(jìn)行粗略分類。從分離的菌落數(shù)量來看，PDA 培養(yǎng)基分離的菌落數(shù)量最多，達(dá)到(11.73±4.96)×103cfu/mL，其后依次是辣椒根際土壤培養(yǎng)基(9.73±0.23)×103cfu/mL、辣椒根系培養(yǎng)基(8.20±0.92)×103cfu/mL 和辣椒葉培養(yǎng)基(7.47±1.70)×103cfu/mL；從分離的菌落種類來看，辣椒根際土壤培養(yǎng)基分離得到的菌落種類最多，有6 類，PDA 培養(yǎng)基和辣椒葉培養(yǎng)基的各有5 類，辣椒根系培養(yǎng)基的有4 類。

從20 個(gè)種類細(xì)菌中每類隨機(jī)挑選3 個(gè)菌株，共60 個(gè)菌株，分別與白絹病菌LJB-2 對峙培養(yǎng)，計(jì)算菌落生長抑制率，抑制率超過30%，判定有良好的抑制作用。初篩結(jié)果表明，共有13 株細(xì)菌對辣椒白絹病菌LJB-1有抑制作用，其中G242、T443、T151、G241、YZ12、T442 等6 株細(xì)菌對白絹病菌的抑制率高于50%(表1)。

表1 辣椒果實(shí)胎座生防菌對辣椒白絹病菌的拮抗能力 Table 1 Antagonistic ability of isolates against Sclerotium rolfsii

將這6株菌株分別與辣椒疫霉病菌LYB-1和辣椒炭疽病菌LCB-3 對峙培養(yǎng), 結(jié)果這6 株拮抗菌對辣椒炭疽病菌和疫霉病菌有良好的抑制作用(圖1)，對辣椒炭疽病菌LCB-3的抑制率為(61.71±11.33)%～(76.58±1.55)%，對辣椒疫霉病菌的抑制率為(48.65±2.70)%～(56.76±9.74)%。

圖1 菌株T443 與辣椒病原菌的平皿對峙培養(yǎng)結(jié)果 Fig.1 The antifungal activities against 3 pepper pathogen by biocontrol bacteria strain T443

將菌株YZ12、G241、T151、T442、G242 和T443 的16S rRNA 序列在GenBank 中進(jìn)行同源性比較，結(jié)果YZ12、G241、T151 和T442 與解淀粉芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefaciens)的同源性分別達(dá)到99.59%、99.49%、100%和97.73%，G242 和T443與貝萊斯芽孢桿菌(Bacillus velezensis)的同源性分別達(dá)到98.66% 和99.18% 。構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，YZ12、G241、T151 和T442 與解淀粉芽孢桿菌(登錄號為EF423607)聚在同一個(gè)分支，據(jù)此將這4 個(gè)菌株鑒定為解淀粉芽孢桿菌；菌株G242 和T443與貝萊斯芽孢桿菌(登錄號為KY694464)聚在同一個(gè)分支，將這2 個(gè)菌株鑒定為貝萊斯芽孢桿菌(圖2)。

圖2 6 株拮抗細(xì)菌的16S rRNA 區(qū)域的進(jìn)化樹 Fig.2 Phylogenetic tree of the 16S rRNA region of 6 antagonistic bacteria

2.2 生防菌株對辣椒白絹病的盆栽防效

接種辣椒白絹病菌后，各個(gè)處理均不同程度發(fā)病，其中對照組的發(fā)病率為85.27%，G241 和T443菌懸液處理后的辣椒白絹病發(fā)病率分別為60.42%和52.73%，防效分別為29.14%和38.16%；復(fù)配處理的發(fā)病率為9.88%，防效為88.41%，菌株復(fù)配大幅提高了對白絹病的防治效果。

3 討論

辣椒白絹病、疫病和炭疽病都是辣椒真菌性病害，從辣椒種子、根、莖和葉中挖掘生防資源的研究報(bào)道較多。本研究基于4 種培養(yǎng)基，從辣椒果實(shí)胎座中分離得到20 個(gè)菌落種類，從每個(gè)菌落種類中隨機(jī)挑選3 個(gè)菌株(合計(jì)60 個(gè)菌株)，分別與辣椒白絹病菌、辣椒疫霉菌和辣椒炭疽病菌進(jìn)行平皿對峙培養(yǎng)，篩選得到Y(jié)Z12、G241、T151、T442、G242和T443 等6 株具有抑菌活性的菌株。鑒定結(jié)果表明，它們分屬解淀粉芽孢桿菌和貝萊斯芽孢桿菌。這2 種芽孢桿菌被公認(rèn)為植物促生微生物[14]，因而在后續(xù)應(yīng)用上符合對環(huán)境和生態(tài)安全的要求。

考慮到影響生防菌定殖的環(huán)境因素多，田間防效不穩(wěn)定等突出問題，目前探討生防菌株復(fù)配后的協(xié)同增效現(xiàn)象的研究[15]較多。本研究發(fā)現(xiàn)菌株G241 與T443 復(fù)配相對于單個(gè)菌株對辣椒白絹病的防治效果大幅提高，后續(xù)將從生防菌株的定殖、對辣椒根際微生物的影響、以及抑菌活性物質(zhì)鑒定等方面探究菌株復(fù)配后協(xié)同增效的機(jī)制。