孫慶文，溫迪，郭文凱，王波，徐文芬

貴州中醫(yī)藥大學(xué)，貴州 貴陽(yáng) 550025

小花清風(fēng)藤SabiaparvifloraWall.ex Roxb.為清風(fēng)藤科清風(fēng)藤屬植物，國(guó)內(nèi)主要分布于貴州西部及西南部、云南東南部至西南部、廣西西部及西南部、四川等地。除此，印度、緬甸、尼泊爾、菲律賓、泰國(guó)、越南、印度尼西亞也有分布[1]。黔西南的苗族、布依族等少數(shù)民族常用小花清風(fēng)藤的莖藤治療肝炎、風(fēng)濕痹痛、跌打損傷等疾病[2]。現(xiàn)代研究表明，小花清風(fēng)藤及同屬多種植物主要含有黃酮類、生物堿類及三萜類成分，具有明顯抗乙肝病毒、保肝、降酶、抗炎等作用[3-8]。十余年來(lái)，筆者在國(guó)家自然科學(xué)基金、貴州省一流學(xué)科建設(shè)等多個(gè)項(xiàng)目的支撐下，對(duì)清風(fēng)藤屬藥用植物的資源、鑒定、栽培、質(zhì)量以及化學(xué)藥理等方面進(jìn)行了系統(tǒng)研究[9-13]。在長(zhǎng)期的研究過(guò)程中，筆者發(fā)現(xiàn)小花清風(fēng)藤與同屬(清風(fēng)藤屬)的簇花清風(fēng)藤S.fasciculataLecomte ex L.Chen、尖葉清風(fēng)藤S.swinhoeiHemsl. ex Forb. et Hemsl.等物種在植物形態(tài)上極為相似，在沒(méi)有花、果的情況下不易準(zhǔn)確鑒別，容易導(dǎo)致藥農(nóng)在采集小花清風(fēng)藤藥材時(shí)出現(xiàn)混雜，從而影響臨床療效，甚至埋下安全隱患。因此，探索準(zhǔn)確、快速、簡(jiǎn)便的鑒別方法，無(wú)疑是小花清風(fēng)藤及其同屬植物綜合開發(fā)利用和藥材質(zhì)量控制的重要課題。

近紅外光譜(NIRS)技術(shù)具有操作簡(jiǎn)便、精密度高、無(wú)毒無(wú)損、分析時(shí)間短等特點(diǎn)[14]。將該技術(shù)應(yīng)用于中藥材鑒別、中藥生產(chǎn)檢驗(yàn)、藥用植物品種鑒定等方面已取得良好效果。朱斌等[15]采用近紅外光譜結(jié)合聚類分析法對(duì)20種金絲桃屬植物進(jìn)行近紅外漫反射光譜法鑒別；劉沭華等[16]采用紅外光譜法結(jié)合近鄰法和多類支持向量機(jī)等模式識(shí)別技術(shù)，對(duì)白芷、丹參藥材的產(chǎn)地進(jìn)行鑒別研究，均取得了良好的鑒別效果；孫榮梅等[17]采用近紅外漫反射光譜結(jié)合移動(dòng)窗口偏最小二乘法(Moving-window Partial Least Square，mwPLS)波段選擇進(jìn)行主成分分析，建立了一種對(duì)菟絲子及其同屬混淆藥材的可靠鑒別方法。近年來(lái)，NIRS技術(shù)得到了飛速發(fā)展，已被廣泛應(yīng)用于農(nóng)業(yè)、食品、石化和藥物分析等領(lǐng)域。鑒于該技術(shù)的突出優(yōu)勢(shì)，筆者對(duì)7種清風(fēng)藤屬植物共20批60份樣品的NIRS特征進(jìn)行分析研究，以期建立小花清風(fēng)藤及其同屬藥用植物的NIRS鑒別方法，為該類藥材的鑒定和質(zhì)量控制提供參考。

1 材料

樣品為清風(fēng)藤科清風(fēng)藤屬植物的干燥葉、1年生莖、老莖(多年生)，共7個(gè)種60批樣品(小花清風(fēng)藤屬葉、1年生莖、老莖各20份)，樣品均由貴州中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院的孫慶文教授鑒定為正品，憑證標(biāo)本存放于貴州中醫(yī)藥大學(xué)生藥重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室。材料信息見(jiàn)表1。

Thermo Antaris Ⅱ型傅里葉變換近紅外光譜儀(美國(guó)賽默飛公司)；InGaAs檢測(cè)器以及石英杯、100目標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)篩、QE-200高速萬(wàn)能粉碎機(jī)(浙江屹立工貿(mào)有限公司)。數(shù)據(jù)分析軟件：Result光譜采集軟件、TQ Analyst 8.0 化學(xué)計(jì)量軟件、SPSS 22.0軟件。

表1 供試藥材來(lái)源信息

2 方法

2.1 樣品的處理

取低溫干燥的樣品，粉碎，過(guò)六號(hào)篩(100目篩)，樣品質(zhì)量>15.0 g，密封，放入干燥器中備用。

2.2 光譜數(shù)據(jù)采集

取樣品約10.0 g，置于采樣杯中，在儀器預(yù)熱30 min后，使用Result軟件，漫反射模塊采集NIRS譜圖。采集條件：掃描樣品時(shí)間30 s，掃描范圍10 000～4000 cm-1，分辨率為8 cm-1，樣品掃描3次。

2.3 數(shù)據(jù)處理

由于清風(fēng)藤屬植物所含化學(xué)成分較復(fù)雜，而且NIRS譜圖自身有重疊現(xiàn)象，以致于難以從原始譜圖找到種間和種內(nèi)的差異。通過(guò)對(duì)所有樣品的譜圖進(jìn)行9點(diǎn)平滑并對(duì)其用二階導(dǎo)數(shù)、標(biāo)準(zhǔn)正態(tài)變換和多元散射校證等方法處理，消除基線漂移和噪聲干擾，應(yīng)用TQ Anlyst 8.0化學(xué)計(jì)量學(xué)軟件分別對(duì)小花清風(fēng)藤葉、1年生莖、老莖的NIRS數(shù)據(jù)進(jìn)行相似度計(jì)算，將相似度值導(dǎo)入SPSS 22.0軟件中選擇歐式距離法進(jìn)行系統(tǒng)聚類分析。分別繪制3個(gè)藥用部位的系統(tǒng)聚類分析圖。

3 結(jié)果與分析

3.1 NIRS特征分析

原始譜圖結(jié)果(見(jiàn)圖1～3)，從圖中發(fā)現(xiàn)只有葉的NIRS原始譜圖在波數(shù)4 139.50～7 381.78 cm-1區(qū)域部分樣品差異較為明顯，1年生莖和老莖NIRS原始譜圖的峰形、峰高都非常相似，無(wú)明顯差異。經(jīng)二階導(dǎo)數(shù)處理后，不僅漂移和噪音得到消除，還能夠更清晰地反映樣品的特征信息(見(jiàn)圖4～6)。在波數(shù)4 139.50～7 381.78 cm-1的差異性較原圖更為明顯，有利于物種的區(qū)分。

圖1 20批清風(fēng)藤屬植物葉NIRS原始譜圖

圖2 20批清風(fēng)藤屬植物1年生莖NIRS原始譜圖

圖3 20批清風(fēng)藤屬植物老莖NIRS原始譜圖

圖4 20批清風(fēng)藤屬植物葉NIRS二階導(dǎo)數(shù)譜圖

圖5 20批清風(fēng)藤屬植物1年生莖NIRS二階導(dǎo)數(shù)譜圖

圖6 20批清風(fēng)藤屬植物老莖NIRS二階導(dǎo)數(shù)譜圖

3.2 NIRS相似度計(jì)算結(jié)果與分析

將60批樣品的光譜數(shù)據(jù)分別導(dǎo)入TQ anlyst 8.0化學(xué)計(jì)算軟件，采用相關(guān)系數(shù)分析法分別計(jì)算葉、1年生莖、老莖各樣品NIRS之間的相似度，所得結(jié)果見(jiàn)表2～4。

通過(guò)SPSS 22.0軟件分別對(duì)小花清風(fēng)藤不同藥用部位的種內(nèi)和種間NIRS相似度數(shù)值進(jìn)行種內(nèi)的單因素方差分析和種間的多重比較，發(fā)現(xiàn)葉的NIRS相似度值種間差異更顯著。對(duì)小花清風(fēng)藤葉種內(nèi)的NIRS相似度進(jìn)行單因素方差檢驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)種內(nèi)的NIRS相似度的數(shù)值差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，說(shuō)明小花清風(fēng)藤葉片的種內(nèi)化學(xué)成分比較穩(wěn)定。對(duì)小花清風(fēng)藤1年生莖和老莖種內(nèi)的NIRS相似度進(jìn)行單因素方差檢驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)種內(nèi)的NIRS相似度的數(shù)值差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，但與同屬其他物種比較時(shí)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(見(jiàn)表5～8)。在對(duì)小花清風(fēng)藤與其他同屬植物的種間NIRS相似度進(jìn)行多重比較發(fā)現(xiàn)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，說(shuō)明小花清風(fēng)藤與同屬的其他物種間的化學(xué)成分差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，有利于對(duì)物種進(jìn)行分類和鑒別(見(jiàn)表9～11)。

表2 小花清風(fēng)藤及其同屬植物葉片近紅外光譜相似度計(jì)算結(jié)果 %

表3 小花清風(fēng)藤及其同屬植物1年生莖近紅外光譜相似度計(jì)算結(jié)果 %

表4 小花清風(fēng)藤及其同屬植物老莖近紅外光譜相似度計(jì)算結(jié)果 %

表5 小花清風(fēng)藤葉種內(nèi)NIRS相似度單因素方差檢驗(yàn)

表6 小花清風(fēng)藤1年生莖種內(nèi)NIRS相似度單因素方差檢驗(yàn)

表7 小花清風(fēng)藤老莖種內(nèi)NIRS相似度單因素方差檢驗(yàn)

從3個(gè)藥用部位的NIRS相似度結(jié)果方差分析來(lái)看，葉片NIRS相似度比其他2個(gè)藥用部位的種內(nèi)差異更小，種間差異更大。在種內(nèi)比較時(shí)，小花清風(fēng)藤葉、1年生莖和老莖的NIRS相似度分別為91.78%、83.41%和91.85%。在種間比較中，小花清風(fēng)藤葉與同屬其他物種的種間NIRS平均相似度只有61.73%，相似度值差距明顯，說(shuō)明小花清風(fēng)藤與其他同屬植物葉的化學(xué)成分差異較大，有利于對(duì)其進(jìn)行鑒別。1年生莖和老莖的NIRS相似度比較中，小花清風(fēng)藤與同屬其他物種的1年生莖和老莖的NIRS相似度分別達(dá)到了79.39%和86.86%，NIRS相似度值相差不大，說(shuō)明該屬植物莖中的化學(xué)成分較為相近。以上結(jié)果可以看出，葉片的NIRS相似度值差異較大，這對(duì)小花清風(fēng)藤藥材鑒定具較大的參考價(jià)值。

表8 小花清風(fēng)藤葉種間相似度多重比較(n=60)

注：P<0.05差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表9 小花清風(fēng)藤葉種內(nèi)和種間NIRS相似度均值

注：—表示種內(nèi)樣品未比較，下同。

表10 小花清風(fēng)藤1年生莖種內(nèi)和種間NIRS相似度均值

表11 小花清風(fēng)藤老莖種內(nèi)和種間NIRS相似度均值

3.3 NIRS聚類分析

分別選擇小花清風(fēng)藤及其同屬植物3個(gè)藥用部位4 139.50～7 381.78 cm-1NIRS數(shù)據(jù)，導(dǎo)入SPSS 22.0軟件，以歐式距離對(duì)樣品進(jìn)行系統(tǒng)聚類分析，構(gòu)建3個(gè)藥用部位的系統(tǒng)聚類樹狀圖，并結(jié)合NIRS相似度的結(jié)果和植物的形態(tài)學(xué)進(jìn)行分析，從葉片的聚類樹狀圖中可見(jiàn)，當(dāng)歐式距離為10時(shí)，可將小花清風(fēng)藤及其同屬植物葉聚類分為四大類，A類包括6個(gè)樣，B類包括5個(gè)樣，C類包括3個(gè)樣，D類包括6個(gè)樣(見(jiàn)圖7～9)。A類：小花清風(fēng)藤和簇花清風(fēng)藤聚在一起，但在歐式距離為5時(shí)又分為2類，5份小花清風(fēng)藤能夠聚在一起；B類：尖葉清風(fēng)藤5個(gè)樣完全聚在一起；C類：屬于1個(gè)小類，只有平伐清風(fēng)藤2個(gè)樣品和云南清風(fēng)藤1個(gè)樣品聚為一類；D類：分為了2個(gè)小支，3份四川清風(fēng)藤樣品聚在一起，3份鄂西清風(fēng)藤樣品聚在一起。

圖8 小花清風(fēng)藤及其同屬植物1年生莖NIRS聚類分析圖

圖9 小花清風(fēng)藤及其同屬植物老莖NIRS聚類分析圖

綜合上述結(jié)果分析，通過(guò)對(duì)小花清風(fēng)藤及其同屬植物葉的NIRS的聚類分析，小花清風(fēng)藤、尖葉清風(fēng)藤、四川清風(fēng)藤、鄂西清風(fēng)藤都能較好的區(qū)分開，可以對(duì)該屬植物達(dá)到分類鑒定的目的；然而，對(duì)1年生莖和老莖進(jìn)行聚類分析，結(jié)果顯示物種間的聚類相對(duì)比較混亂，而且兩部分聚類不能得出一致的聚類結(jié)果，聚類結(jié)果與植物種類、采集時(shí)間和地點(diǎn)沒(méi)有形成一定的規(guī)律，從NIRS相似度來(lái)看，未能得到相吻合的結(jié)果?？赡苁且?yàn)橹参锴o的生長(zhǎng)年限不同，積累的化學(xué)成分也會(huì)有所差異。而在采樣過(guò)程中植物莖的生長(zhǎng)年限不易準(zhǔn)確判斷，故通過(guò)莖的NIRS相似度和聚類分析，無(wú)法起到較好的分類鑒別作用。

4 小結(jié)與討論

本研究選取小花清風(fēng)藤及其同屬植物作為研究對(duì)象，經(jīng)干燥樣品研磨過(guò)100目篩，通過(guò)對(duì)粉末樣品的掃描，采集所有樣品的NIRS數(shù)據(jù)，應(yīng)用TQ Anlyst 8.0化學(xué)計(jì)量軟件處理，結(jié)合SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件的系統(tǒng)聚類分析方法來(lái)對(duì)物種進(jìn)行鑒定研究，建立了一種方便快捷、無(wú)損害的鑒定方法。

在對(duì)NIRS譜圖的分析中發(fā)現(xiàn)，由于樣品都屬于同屬物種，化學(xué)結(jié)構(gòu)和化學(xué)組成都比較近似，因此原譜圖之間的差異不是很明顯，只發(fā)現(xiàn)在部分波數(shù)處(4 139.50～7 381.78 cm-1)具有微小的差異。通過(guò)對(duì)譜圖進(jìn)行二階導(dǎo)數(shù)處理，此波數(shù)范圍內(nèi)的吸收峰比原圖明顯，一些微小的變化二階導(dǎo)數(shù)圖比原圖更能說(shuō)明問(wèn)題。

葉部位的NIRS相似度比較和聚類分析結(jié)果顯示，小花清風(fēng)藤與同屬植物間差異十分顯著，故可以通過(guò)對(duì)該屬植物葉的近紅外光譜的采集和分析，建立有效的小花清風(fēng)藤與其同屬植物及藥材分類鑒別的快捷方法。對(duì)比小花清風(fēng)藤與其他物種的1年生莖和老莖中的NIRS數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)其相似度較高，不能完全區(qū)分開，說(shuō)明該屬植物1年生莖和老莖的化學(xué)成分比較相似，NIRS數(shù)據(jù)不適宜作為該屬植物的分類鑒別依據(jù)，這可能是因?yàn)榍屣L(fēng)藤屬大部分物種屬于多年生落葉植物，葉的生長(zhǎng)周期較短，因而種內(nèi)化學(xué)成分相對(duì)穩(wěn)定，而種間又有所差異。1年生莖和老莖的生成周期較長(zhǎng)，即使是同一種植物，可能由于生長(zhǎng)期和采集時(shí)間的不同，會(huì)導(dǎo)致莖中的化學(xué)成分有所差異。