吳笛，雷昌

HPLC同時(shí)測定槐花散中4種黃酮類成分含量

吳笛1，雷昌2

1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，湖南 長沙 410007；2.湖南省中藥粉體與創(chuàng)新藥物省部共建國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地，湖南 長沙 410208

建立HPLC同時(shí)測定槐花散中蘆丁、柚皮苷、新橙皮苷、槲皮素4種黃酮類成分含量的方法。采用依利特Hypersil ODS2色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），以乙腈-0.1%磷酸水溶液為流動(dòng)相，梯度洗脫，流速1.0 mL/min，檢測波長283 nm，柱溫25 ℃。蘆丁、柚皮苷、新橙皮苷、槲皮素線性范圍分別為0.252 6～25.26 μg（2＝1.000 0）、0.155 5～15.55 μg（2＝1.000 0）、0.100 5～10.05 μg（2＝1.000 0）、0.020 8～2.08 μg（2＝0.999 8），平均加樣回收率分別為101.2%（RSD＝1.4%）、99.4%（RSD＝2.2%）、102.5%（RSD＝1.9%）、98.7%（RSD＝2.7%）。本研究建立的含量測定方法簡便、準(zhǔn)確，重復(fù)性好，可用于槐花散的質(zhì)量控制。

槐花散；黃酮；含量測定；高效液相色譜法

槐花散為國家中醫(yī)藥管理局公布的第一批100首古代經(jīng)典名方之一[1]，始載于宋代許叔微《普濟(jì)本事方》，由槐花（炒）、（側(cè)）柏葉（爛杵焙）、荊芥穗、枳殼（去穰細(xì)切麩炒黃）各等份細(xì)末組成，具清腸止血、疏風(fēng)行氣功效，臨床常用于治療痔瘡、結(jié)腸炎或其他大便下血屬風(fēng)熱或濕熱邪毒壅遏腸道、損傷脈絡(luò)者，腸癌便血亦可應(yīng)用。槐花散治療出血性肛腸疾病療效確切[2]，目前對(duì)其研究集中于臨床應(yīng)用方面，制劑工藝及質(zhì)量、炮制研究較少?；被ㄉ⒅饕钚猿煞譃辄S酮和鞣質(zhì)[3-5]。有研究采用比色法檢測槐花散中總黃酮含量[3-4]，但雜質(zhì)干擾較大、準(zhǔn)確度較低，檢測結(jié)果存疑。另有研究采用HPLC檢測槐花散中蘆丁的含量[6-7]，但以單一黃酮成分作為檢測指標(biāo)稍顯片面。本研究采用HPLC建立槐花散中4種黃酮類成分的含量測定方法，為其質(zhì)量控制提供參考。

1 儀器與試藥

高效液相色譜儀：Agilent 1260 Infinity Ⅱ（美國安捷倫公司），Waters 2695（美國沃特世公司），Dionex UltiMate 3000（美國戴安公司）；色譜柱：依利特Hypersil ODS2（250 mm×4.6 mm，5 μm）、Hibar 250- 4,6 Purospher STAR RP-18e（4.6 mm×250 mm，5 μm）、Inertsil ODS-3（4.6 mm×250 mm，5 μm）、Diamonsil C18（2）5u（4.6 mm×250 mm，5 μm）、Agilent 5 TC-C18（2）（4.6 mm×250 mm，5 μm）；ELGA LA612型超純水機(jī)（英國ELGA公司）；DK-98-Ⅱ型電熱恒溫水浴鍋（天津市泰斯特儀器有限公司）；SK5200H型超聲波清洗器（上海科導(dǎo)超聲儀器有限公司）；SHIMADZU AUW120D型分析天平（日本島津公司）；OHAUS STARTER 3100型酸度計(jì)（美國奧豪斯公司）。

對(duì)照品蘆丁（批號(hào)Y05M6S1，HPLC純度≥98%）、柚皮苷（批號(hào)K21F3C1，HPLC純度≥98%）、新橙皮苷（批號(hào)Z31J6L2067，HPLC純度≥98%）、槲皮素（批號(hào)Y26D5Y1，HPLC純度≥98%），上海源葉生物科技有限公司；甲醇、乙腈均為色譜純，美國Tedia公司；磷酸為色譜純，天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所；水為超純水；其他試劑均為分析純。

槐花、側(cè)柏葉、荊芥穗、枳殼藥材各3批，湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院藥房提供，經(jīng)湖南中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院中藥鑒定學(xué)教研室劉塔斯教授鑒定，分別為豆科植物槐L.的干燥花及花蕾、柏科植物側(cè)柏（L.）Franco的干燥枝梢和葉、唇形科植物荊芥Briq.的干燥花穗、蕓香科植物酸橙L.及其栽培變種的干燥未成熟果實(shí)?；被ㄅ谥破罚?015年版《中華人民共和國藥典》（一部）槐花項(xiàng)下炒槐花的要求[8]及藥典清炒法[9]制備；側(cè)柏葉炮制品，按槐花散處方要求及藥典清炒法[9]制備；枳殼炮制品，按槐花散處方要求及藥典麩炒法[9]制備。得到槐花炮制品、側(cè)柏葉炮制品、枳殼炮制品各3批。藥材和炮制品經(jīng)60 ℃干燥后，粉碎成細(xì)粉（過3號(hào)篩），按槐花散處方配制，混勻，得槐花散樣品3批。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

采用依利特Hypersil ODS2色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），流動(dòng)相為乙腈-0.1%磷酸水溶液，梯度洗脫（0～20 min，14%→16%乙腈；20～40 min，16%乙腈；40～42 min，16%→20%乙腈；42～60 min，20%乙腈），檢測波長為283 nm，柱溫25 ℃，流速1.0 mL/min，進(jìn)樣量10 μL。

2.2 混合對(duì)照品溶液制備

精密稱取干燥至恒重的蘆丁、柚皮苷、新橙皮苷、槲皮素對(duì)照品適量，加甲醇制成每1 mL分別含250、150、100、20 μg的溶液，即得。

2.3 供試品溶液制備

取槐花散樣品（過3號(hào)篩）約0.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入80%甲醇50 mL，稱定質(zhì)量，加熱回流2 h，放冷，再稱定質(zhì)量，用80%甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，過濾，取續(xù)濾液，即得。

2.4 陰性對(duì)照溶液制備

按槐花散處方要求，分別制備不含槐花的陰性樣品、不含枳殼的陰性樣品，按“2.3”項(xiàng)下方法分別制備槐花陰性對(duì)照溶液、枳殼陰性對(duì)照溶液。

2.5 系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

分別吸取混合對(duì)照品溶液、供試品溶液、槐花陰性對(duì)照溶液、枳殼陰性對(duì)照溶液各10 μL，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，記錄色譜圖（見圖1）。結(jié)果顯示，供試品溶液與混合對(duì)照品溶液對(duì)應(yīng)的色譜峰理論塔板數(shù)均大于3000，分離度均大于1.5，槐花散中其他成分對(duì)4種指標(biāo)成分的測定無干擾。

注：A.混合對(duì)照品；B.供試品；C.槐花陰性對(duì)照；D.枳殼陰性對(duì)照；1.蘆丁；2.柚皮苷；3.新橙皮苷；4.槲皮素

2.6 線性關(guān)系考察

取干燥至恒重的蘆丁、柚皮苷、新橙皮苷、槲皮素對(duì)照品適量，精密稱定，加80%甲醇制成每1 mL分別含約2.5、1.5、1.0、0.2 mg的混合溶液，作為貯備液。取貯備液，稀釋至5、10、50、100倍體積，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析。以對(duì)照品濃度為橫坐標(biāo)，相應(yīng)峰面積為縱坐標(biāo)，得到各指標(biāo)成分的線性回歸方程和線性范圍，結(jié)果見表1。

表1 4種成分線性關(guān)系考察結(jié)果

成分回歸方程R2線性范圍/μg 蘆丁Y＝7.096 4X＋54.5871.000 00.252 6～25.26 柚皮苷Y＝14.977X＋68.5851.000 00.155 5～15.55 新橙皮苷Y＝17.59X＋49.4541.000 00.100 5～10.05 槲皮素Y＝13.054X＋1.162 70.999 80.020 8～2.08

2.7 精密度試驗(yàn)

2.7.1 日內(nèi)精密度

取對(duì)照品溶液，連續(xù)進(jìn)樣5次，測定峰面積，結(jié)果蘆丁、柚皮苷、新橙皮苷、槲皮素峰面積RSD分別為0.5%、0.2%、0.3%、0.8%，符合要求。

2.7.2 日間精密度

取對(duì)照品溶液，連續(xù)進(jìn)樣5 d，每日1次，測定峰面積，結(jié)果蘆丁、柚皮苷、新橙皮苷、槲皮素峰面積RSD分別為1.5%、0.9%、1.2%、1.7%，符合要求。

2.8 重復(fù)性試驗(yàn)

取同一樣品（樣品1）6份，每份稱取約0.5 g，精密稱定，按“2.3”項(xiàng)下方法平行制備供試品溶液，進(jìn)樣測定，計(jì)算含量及RSD，結(jié)果蘆丁、柚皮苷、新橙皮苷、槲皮素含量的RSD分別為2.3%、1.9%、1.2%、2.1%，表明方法重復(fù)性良好。

2.9 重現(xiàn)性試驗(yàn)

由3個(gè)不同實(shí)驗(yàn)室的不同分析人員使用不同高效液相色譜儀（Agilent 1260 Infinity Ⅱ、Waters 2695、Dionex UltiMate 3000）、不同色譜柱（依利特Hypersil ODS2、Hibar 250-4，6 Purospher STAR RP-18e、Inertsil ODS-3）在不同時(shí)間分別按“2.8”項(xiàng)下方法操作，計(jì)算含量及RSD，結(jié)果蘆丁、柚皮苷、新橙皮苷、槲皮素含量的RSD分別為1.8%、2.2%、1.4%、2.6%，表明方法的重現(xiàn)性良好。

2.10 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取“2.8”項(xiàng)下同一供試品溶液，分別于0、6、12、24、48、72 h進(jìn)樣，記錄72 h內(nèi)峰面積，計(jì)算RSD，結(jié)果蘆丁、柚皮苷、新橙皮苷、槲皮素峰面積RSD分別為1.6%、0.7%、1.8%、2.2%，表明方法的穩(wěn)定性良好。

2.11 加樣回收率試驗(yàn)

取已知含量的同一批樣品（樣品1）約0.25 g，精密稱定，精密加入低、中、高劑量的蘆丁、柚皮苷、新橙皮苷、槲皮素對(duì)照品，共9份，按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，計(jì)算加樣回收率，結(jié)果見表2。

表2 槐花散中4種成分加樣回收率試驗(yàn)

成分取樣量/g樣品中含量/mg加入量/mg測得量/mg回收率/%平均回收率/%RSD /% 蘆丁0.250 36.327 65.025 011.417 9101.3 0.250 36.327 65.025 011.342 6 99.8 0.250 36.327 65.025 011.478 2102.5 0.250 46.330 16.432 012.672 1 98.6 0.250 46.330 16.432 012.929 3102.6101.21.4 0.250 46.330 16.432 012.871 4101.7 0.250 66.335 27.638 013.980 8100.1 0.250 66.335 27.638 014.126 0102.0 0.250 66.335 27.638 014.141 2102.2 柚皮苷0.250 33.744 53.030 0 6.729 0 98.5 0.250 33.744 53.030 0 6.783 6100.3 0.250 33.744 53.030 0 6.853 3102.6 0.250 43.746 03.838 0 7.461 2 96.8 0.250 43.746 03.838 0 7.630 1101.2 99.42.2 0.250 43.746 03.838 0 7.472 7 97.1 0.250 63.749 04.444 0 8.077 5 97.4 0.250 63.749 04.444 0 8.281 9102.0 0.250 63.749 04.444 0 8.135 2 98.7 新橙皮苷0.250 31.882 31.530 0 3.468 9103.7 0.250 31.882 31.530 0 3.393 9 98.8 0.250 31.882 31.530 0 3.406 2 99.6 0.250 41.883 01.836 0 3.761 2102.3 0.250 41.883 01.836 0 3.779 6103.3102.51.9 0.250 41.883 01.836 0 3.770 4102.8 0.250 61.884 52.244 0 4.209 3103.6 0.250 61.884 52.244 0 4.216 0103.9 0.250 61.884 52.244 0 4.229 5104.5 槲皮素0.250 30.515 60.408 0 0.924 4100.2 0.250 30.515 60.408 0 0.913 0 97.4 0.250 30.515 60.408 0 0.915 8 98.1 0.250 40.515 80.510 0 1.007 4 96.4 0.250 40.515 80.510 0 1.039 1102.6 98.72.7 0.250 40.515 80.510 0 1.011 5 97.2 0.250 60.516 20.612 0 1.100 7 95.5 0.250 60.516 20.612 0 1.114 7 97.8 0.250 60.516 20.612 0 1.147 2103.1

2.12 樣品含量測定

取槐花散樣品，按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，計(jì)算樣品中蘆丁、柚皮苷、新橙皮苷、槲皮素含量，結(jié)果見表3。

表3 槐花散樣品中4種成分含量測定結(jié)果（%，n＝3）

樣品編號(hào)蘆丁柚皮苷新橙皮苷槲皮素 12.5281.4960.7520.206 22.3971.4820.7300.226 32.4631.5130.7390.218

3 討論

對(duì)槐花散不同濃度的甲醇提取液分別進(jìn)行HPLC分析，結(jié)果顯示主要的黃酮類成分為蘆丁、柚皮苷、新橙皮苷、槲皮素，其中蘆丁、柚皮苷、新橙皮苷為黃酮苷，槲皮素為黃酮苷元，其他黃酮類成分的含量均遠(yuǎn)低于此4種成分，故選擇蘆丁、柚皮苷、新橙皮苷、槲皮素作為槐花散定量分析的指標(biāo)成分。

考慮到所建立的含量測定方法應(yīng)具有普遍適用性，對(duì)依利特Hypersil ODS2、Hibar 250-4，6 Purospher STAR RP-18e、Inertsil ODS-3、Diamonsil C18（2）5u、Agilent 5 TC-C18（2）共5種不同色譜柱進(jìn)行了詳細(xì)考察，結(jié)果顯示：依利特Hypersil ODS2、Hibar 250-4，6 Purospher STAR RP-18e、Inertsil ODS-3、Diamonsil C18（2）5u對(duì)各指標(biāo)成分的分離效果較好，較難分離的柚皮苷峰、新橙皮苷峰與相鄰雜峰的分離度均大于1.5，各指標(biāo)成分的理論塔板數(shù)均高于3000；Agilent 5 TC-C18（2）對(duì)柚皮苷峰、新橙皮苷峰與相鄰雜峰分離不理想，可能與該柱使用多年致柱效降低有關(guān)。

蘆丁、槲皮素的紫外吸收相似，蘆丁在波長255、355 nm處有2個(gè)吸收峰，槲皮素在波長255、370 nm處有2個(gè)吸收峰。柚皮苷、新橙皮苷的紫外吸收相似，均在283 nm處有一吸收峰。因槐花散中柚皮苷、新橙皮苷的含量低于蘆丁，且在蘆丁、槲皮素的紫外吸收峰處柚皮苷、新橙皮苷的紫外吸收小（遠(yuǎn)低于波長283 nm處），如選擇蘆丁、槲皮素的紫外吸收峰波長作為檢測波長，則譜圖中柚皮苷、新橙皮苷的峰高、峰面積與蘆丁差異巨大，可能影響柚皮苷、新橙皮苷的定量準(zhǔn)確度。因此，選擇283 nm作為檢測波長，該波長處蘆丁、槲皮素的紫外吸收雖較波長255、355、370 nm處小，檢測靈敏度有所降低，但蘆丁仍有較強(qiáng)的色譜峰。

本試驗(yàn)考察了不同提取溶劑、不同提取方法及不同提取溶劑量對(duì)各指標(biāo)成分提取效率的影響，結(jié)果顯示：80%甲醇對(duì)蘆丁、柚皮苷、新橙皮苷的提取效率最高，而60%甲醇對(duì)槲皮素的提取效率最高（80%甲醇次之）；加熱回流2 h對(duì)蘆丁、柚皮苷、新橙皮苷的提取效率優(yōu)于靜置12 h、加熱回流1 h及超聲處理15、30、45、60 min，而靜置12 h對(duì)槲皮素的提取效率最高（加熱回流2 h次之）；100倍量（相對(duì)于樣品量）80%甲醇對(duì)各指標(biāo)成分的提取效率最高。因槐花散中的黃酮以蘆丁、柚皮苷、新橙皮苷3種黃酮苷為主，故樣品處理選擇100倍量80%甲醇加熱回流2 h。

本研究采用HPLC對(duì)槐花散中4種黃酮類成分建立了定量分析方法，該方法簡便、準(zhǔn)確，重復(fù)性好，可用于槐花散的質(zhì)量控制。

[1] 國家中醫(yī)藥管理局.國家中醫(yī)藥管理局關(guān)于發(fā)布《古代經(jīng)典名方目錄(第一批)》的通知[EB/OL].(2018-04-13)[2019-07-30].http://kjs. satcm.gov.cn/zhengcewenjian/2018-04-16/7107.html.

[2] 孫四海,王曉莉,李占芳,等.槐花散治療出血性肛腸疾病研究簡況[J].實(shí)用中醫(yī)內(nèi)科雜志,2015,29(12)：179-181.

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[8] 國家藥典委員會(huì).中華人民共和國藥典：一部[M].北京：中國醫(yī)藥科技出版社,2015：332.

[9] 國家藥典委員會(huì).中華人民共和國藥典：四部[M].北京：中國醫(yī)藥科技出版社,2015：31.

Simultaneous Determination of Four Flavonoids inPowder by HPLC

WU Di1, LEI Chang2

To establish an HPLC method for the simultaneous determination of rutin, naringin, neohesperidin and quercetin inPowder.The analysis was performed on a 25 ℃ thermostatic Elite Hypersil ODS2 column (250 mm × 4.6 mm, 5 μm), with the mobile phase comprising of acetonitrile- 0.1% phosphoric acid flowing at 1.0 mL/min in a gradient elution manner, and the detection wavelength was set at 283 nm.The linear range of four components was: rutin, 0.252 6?25.26 μg (2=1.000 0); naringin, 0.155 5?15.55 μg (2=1.000 0); neohesperidin, 0.100 5?10.05 μg (2=1.000 0); quercetin, 0.020 8?2.08 μg (2=0.999 8). The average recoveries of four components were: rutin, 101.2% (RSD=1.4%); naringin, 99.4% (RSD=2.2%); neohesperidin, 102.5% (RSD=1.9%); quercetin, 98.7% (RSD=2.7%).The method is simple and accurate, with good repeatability, which can be used for the quality control ofPowder.

Powder; flavonoid; content determination; HPLC

R284.1

A

1005-5304(2020)06-0069-04

10.3969/j.issn.1005-5304.201907047

湖南中醫(yī)藥大學(xué)校級(jí)科研基金（ZYYDX201747）

（2019-07-04）

（2019-08-05；編輯：陳靜）