馬丹英， 趙 遠(yuǎn)， 尚林偉， 朱勇康， 符娟娟， 陸燕飛， 尹建華

南京航空航天大學(xué)生物醫(yī)學(xué)工程系， 江蘇 南京 210016

引 言

軟骨是人和動(dòng)物體內(nèi)重要的結(jié)締組織， 由軟骨細(xì)胞和細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix, ECM)構(gòu)成。 軟骨細(xì)胞是一種代謝活性細(xì)胞， 能合成和轉(zhuǎn)換大量的ECM成分， 如膠原、 蛋白多糖(proteoglycans, PG)和透明質(zhì)酸(hyaluronic acid, HA)。 軟骨細(xì)胞所處的化學(xué)和機(jī)械環(huán)境都會(huì)影響其代謝活動(dòng)。 人體中的關(guān)節(jié)透明軟骨有承受負(fù)荷、 減少關(guān)節(jié)間骨骼摩擦等重要功能， 也因此而易被消耗磨損。 在健康的成人軟骨中， 軟骨細(xì)胞處于合成和分解代謝相對(duì)平衡的穩(wěn)定狀態(tài)， 而在炎癥、 創(chuàng)傷及其他病理因素引起的軟骨損傷中， 這種穩(wěn)定狀態(tài)被打破， 分解、 代謝水平上調(diào)， 最終導(dǎo)致關(guān)節(jié)失用。 關(guān)節(jié)軟骨由于自身修復(fù)能力極差， 在長(zhǎng)期負(fù)荷運(yùn)轉(zhuǎn)中一旦受到異常應(yīng)力、 機(jī)械創(chuàng)傷等損傷， 往往逐漸引起軟骨退變及關(guān)節(jié)其他組分病變， 誘發(fā)骨關(guān)節(jié)炎(osteoarthritis， OA)。 ECM主要由膠原纖維、 蛋白多糖、 水三部分組成， 通過(guò)它們之間的有機(jī)結(jié)合， 使軟骨具有傳遞負(fù)荷、 潤(rùn)滑關(guān)節(jié)等功能。 健康的ECM主要由Ⅱ型膠原組成， 其為組織提供拉伸支撐， 而在病變ECM中Ⅰ型膠原蛋白含量增加， Ⅱ型膠原蛋白含量減少， 并且在OA期間， 聚集蛋白聚糖含量降低， 而膠原蛋白含量增加。 ECM成分的這種變化使組織易于發(fā)生機(jī)械損傷。 因此， OA的進(jìn)展可以通過(guò)ECM的組成和結(jié)構(gòu)的變化來(lái)表征。

OA也稱退行性骨關(guān)節(jié)病， 是一種復(fù)雜的肌肉骨骼疾病， 好發(fā)于負(fù)重較大的膝關(guān)節(jié)、 髖關(guān)節(jié)等部位。 隨著社會(huì)人口的老齡化， 該病的發(fā)生率越來(lái)越高， 高于10%的60歲以上的老人都忍受著該疾病的折磨[1]。 在OA的第一階段， 生化、 機(jī)械因素會(huì)引起關(guān)節(jié)軟骨表層(如膠原變性)、 滑膜液(如潤(rùn)滑劑含量下降)的輕微改變。 這些變化增加了軟骨之間的摩擦系數(shù)， 并開(kāi)始磨損。 隨著疾病的發(fā)展， 軟骨變薄， 導(dǎo)致骨骼壓力增加。 隨后， 更多的滑膜液(synovial fluid， SF)被分泌， 導(dǎo)致關(guān)節(jié)腫脹， 疼痛和炎癥。 軟骨下骨增厚， 軟骨表面粗糙并產(chǎn)生不規(guī)則骨贅。 在這一階段， 隨著摩擦系數(shù)的進(jìn)一步增大， 軟骨退變會(huì)導(dǎo)致機(jī)械性能的退化。 在最后的疾病階段， 軟骨嚴(yán)重受損， 軟骨下骨出現(xiàn)裂縫。

在過(guò)去的關(guān)節(jié)軟骨研究中， 人們常用的測(cè)試手段有生物化學(xué)分析[2]， 磁共振成像(magnetic resonance imaging， MRI)[2]、 生物力學(xué)測(cè)量[3]和各種形式的顯微技術(shù)。 生物化學(xué)和生物力學(xué)手段能探測(cè)大塊組織或者較厚的平行切片， 但不能獲得高分辨率成像和進(jìn)行微量樣本濃度含量的測(cè)量。 通常， 大多數(shù)顯微技術(shù)(如光學(xué)顯微鏡、 掃描和透射顯微鏡)和CT技術(shù)僅用于研究組織的超微結(jié)構(gòu)和形態(tài)， 但不能同時(shí)得到分子濃度信息。 MRI是OA研究中一種主要的評(píng)估方式， 臨床較好的MRI可以在大約100～300 μm的空間分辨率[4]的基礎(chǔ)上實(shí)現(xiàn)軟骨的解剖定義， 在一定程度上對(duì)軟骨中水合作用和主成分含量評(píng)估進(jìn)行補(bǔ)充。 但MRI只能測(cè)量軟骨的PG含量， 不能同時(shí)探測(cè)膠原蛋白的含量分布， 且分辨率不高。 以上這些技術(shù)手段均為人們提供了重要診斷和發(fā)病過(guò)程信息， 但它們卻都不能給出ECM成分在分子水平的結(jié)構(gòu)及構(gòu)成。

在關(guān)節(jié)軟骨和OA的研究中， 傅里葉變換紅外光譜(FTIR)可以同時(shí)獲取有關(guān)分子的生化組成和化學(xué)環(huán)境的信息， 并能有效地反映膠原蛋白和PG在健康和病變軟骨中的分布情況， 但其易于受到水的影響、 成像技術(shù)則囿于組織切片的樣品限制。 同為分子振動(dòng)光譜， 拉曼光譜技術(shù)則可以對(duì)未固定的、 水化的組織樣品進(jìn)行成像， 也不需要進(jìn)行復(fù)雜的樣品制備， 并且能有效的避免化學(xué)固定偽影。 因此， 拉曼光譜技術(shù)被越來(lái)越多被用于關(guān)節(jié)軟骨和OA的研究中。

拉曼光譜技術(shù)是一種非侵入的光譜技術(shù)， 其原理是基于樣品分子振動(dòng)所引起的非彈性散射， 不同物質(zhì)分子有不同的振動(dòng)和轉(zhuǎn)動(dòng)能級(jí)， 因而在光譜上有特定的位置分布， 光譜峰值強(qiáng)度則代表該物質(zhì)相對(duì)含量。 拉曼光譜測(cè)量過(guò)程中不需要對(duì)組織進(jìn)行標(biāo)記或染色， 因此， 拉曼光譜能直接提供被測(cè)樣本的分子信息， 并且樣本細(xì)胞不會(huì)由于外部標(biāo)記物的作用而變性[5]。 拉曼光譜由于其出色的光譜分辨率， 對(duì)新鮮組織分析的適用性以及與其他技術(shù)相比較短的數(shù)據(jù)采集時(shí)間， 已成為化學(xué)、 物理學(xué)、 生物學(xué)、 醫(yī)學(xué)等交叉學(xué)科領(lǐng)域卓有成效的研究手段。 拉曼光譜成像是基于樣品的拉曼光譜生成的偽彩圖像， 能直觀的反映樣本的成分和結(jié)構(gòu)， 能顯示普通光學(xué)顯微鏡下觀察不到的化學(xué)成分分布， 因此， 拉曼光譜成像在生物醫(yī)學(xué)等很多不同領(lǐng)域更是非常有價(jià)值的技術(shù)。

因此， 拉曼光譜技術(shù)在分子水平上顯示出微創(chuàng)、 無(wú)標(biāo)記和客觀診斷的潛力， 使其有利于對(duì)軟骨、 軟骨下骨、 滑膜液等生化成分及其濃度含量變化等進(jìn)行研究， 并可根據(jù)拉曼峰值的強(qiáng)度提供精確的定量描述。 拉曼光譜還能識(shí)別OA不同階段蛋白質(zhì)、 脂質(zhì)和核酸含量的相對(duì)變化， 有助于從細(xì)胞水平探討OA的發(fā)病機(jī)制， 為OA 的早期臨床診斷奠定了基礎(chǔ)。 本文針對(duì)當(dāng)前幾種不同拉曼光譜技術(shù)在關(guān)節(jié)軟骨和OA方面的創(chuàng)新性研究成果進(jìn)行綜述。

1 宏觀拉曼在關(guān)節(jié)軟骨和骨關(guān)節(jié)炎研究中的應(yīng)用

宏觀拉曼技術(shù)是直接利用拉曼光譜儀測(cè)量樣品的拉曼光譜， 不耦合顯微鏡等其他儀器， 屬自由拉曼模式。 除了金屬與合金材料， 固體、 液體、 氣體、 膠體都可以使用宏觀拉曼進(jìn)行分析。

Mangueira等[6]試圖用拉曼光譜提供的光譜信息闡明低能量激光治療(LLLT)對(duì)受損軟骨的影響， 通過(guò)主成分分析(PCA)表征激光治療后損傷軟骨上的拉曼特征。 他們發(fā)現(xiàn)， LLLT能刺激軟骨修復(fù)和膠原合成的細(xì)胞活動(dòng)， 并刺激成纖維細(xì)胞合成修復(fù)Ⅲ型膠原蛋白， 表明LLLT(主要在660 nm)能促進(jìn)OA軟骨修復(fù)。

為了使激發(fā)光透過(guò)軟骨直接探測(cè)到軟骨下骨， 高浩等[7]采用拉曼光譜技術(shù)結(jié)合組織光透明技術(shù)來(lái)研究軟骨組織的光透明效果。 采用磷酸基團(tuán)與酰胺Ⅰ帶積分面積比值來(lái)定性表征軟骨內(nèi)礦物質(zhì)與有機(jī)組分的變換及光透明效應(yīng)。 他們發(fā)現(xiàn)， 相比于無(wú)透明劑情形， 碘海醇、 甘油兩種透明劑均使該強(qiáng)度比信號(hào)增強(qiáng)。 在同一時(shí)間范圍內(nèi)， 甘油和碘海醇分別在60%和150 mg·mL-1濃度下能獲得較好的透明效果； 而在不同濃度下， 甘油的透明效果均在20 min最強(qiáng)， 而碘海醇的透明效果一般是在50 min后開(kāi)始增強(qiáng)。

Vardaki等[8]利用拉曼光譜掃描人類股骨頭， 研究關(guān)節(jié)軟骨與軟骨下骨之間的化學(xué)差異。 他們發(fā)現(xiàn)， 非礦化軟骨中不存在礦物質(zhì)帶， 還檢測(cè)到軟骨(Ⅱ型膠原)和骨(Ⅰ型膠原)中兩種膠原蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)的顯著差異。 另一方面， 在骨關(guān)節(jié)炎中軟骨并不表現(xiàn)出明顯拉曼光譜的變化， 但可以觀察出鈣化現(xiàn)象和板層厚度減少。

Lim等[9]利用偏振拉曼光譜探測(cè)受不同壓力沖擊的豬脛骨軟骨早期生化組成和方向變化。 平行偏振條件下， 吡喃糖環(huán)拉曼帶在1 126 cm-1處顯著降低表明早期損傷軟骨中糖胺聚糖(glycosaminoglycan, GAG)含量降低， 這是早期骨關(guān)節(jié)炎的標(biāo)志。 因此， 在平行偏振條件下， 可利用平均吡喃糖環(huán)拉曼帶強(qiáng)度將對(duì)照組與受沖擊組分開(kāi)。 此外， 受沖擊組中顯示平行偏振光譜中856 cm-1(脯氨酸)與875 cm-1(羥脯氨酸)的平均拉曼帶面積比值顯著降低(p<0.05)， 該比值的變化提示膠原螺旋穩(wěn)定性可能受到?jīng)_擊的影響。 利用該面積比區(qū)分對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組， 靈敏度為95%， 特異性為88%。 在撞擊后， 酰胺Ⅲ在垂直偏振拉曼光譜中， 拉曼帶表現(xiàn)出從1 264～1 274 cm-1的藍(lán)移。 與對(duì)照組1 268 cm-1處的單峰相比， 受沖擊組酰胺Ⅲ拉曼譜帶在1 264和1 274 cm-1處表現(xiàn)為雙峰， 表明酰胺Ⅲ振動(dòng)受到抑制， 反映了膠原纖維中C—N振動(dòng)可能被抑制。 垂直偏振拉曼帶中也觀察到酰胺Ⅲ帶的一個(gè)小分裂， 表明偏振拉曼信號(hào)來(lái)自于軟骨表層和深層受影響的羰基。 表1列出了關(guān)節(jié)軟骨及下骨中大部分主要拉曼帶的特征分配， 這將有利于人們進(jìn)一步理解軟骨和下骨在OA前后的分子變化機(jī)制。

Takahashi等[10]也專注于關(guān)節(jié)軟骨的拉曼光譜中的酰胺Ⅲ帶， 首次將酰胺Ⅲ帶比(1 241/1 269 cm-1)應(yīng)用于人體關(guān)節(jié)軟骨的分析。 從健康到疾病狀態(tài)， 位于1 241 cm-1的酰胺Ⅲ帶的強(qiáng)度顯著增加。 Dehring[11]等也觀察到了這一光譜變化趨勢(shì)。 值得注意的是， Ⅰ級(jí)OA到Ⅱ級(jí)OA， 酰胺Ⅲ比率顯著增加， 表明人類膝關(guān)節(jié)軟骨的微結(jié)構(gòu)變化也發(fā)生在OA的早期階段。 酰胺Ⅲ帶比(I1 241/I1 269)可以被認(rèn)為是關(guān)節(jié)軟骨的膠原二級(jí)結(jié)構(gòu)無(wú)序程度的標(biāo)志。

膠原微觀結(jié)構(gòu)的快速退化是Ⅰ級(jí)OA和Ⅱ級(jí)OA之間的一個(gè)重要特征， 其引發(fā)軟骨表面的不可逆損傷并最終導(dǎo)致Ⅲ級(jí)和Ⅳ級(jí)的更嚴(yán)重的OA狀態(tài)發(fā)生。 這一結(jié)果表明化學(xué)、 機(jī)械和環(huán)境因素都會(huì)導(dǎo)致人體軟骨的微觀結(jié)構(gòu)的改變和退化。 最近的研究證實(shí)[13]， 隨著OA進(jìn)展， 由于潤(rùn)滑素濃度降低， 摩擦系數(shù)顯著增加， 特別是在軟骨內(nèi)側(cè)區(qū)域。 此外， 與I級(jí)OA相比， Ⅱ級(jí)OA的表面粗糙度明顯增加， 導(dǎo)致接觸處局部摩擦力增加， 潤(rùn)滑劑快速減少。

表1 關(guān)節(jié)組織中典型的拉曼譜峰歸屬表[9, 16, 19-21, 24-25, 29]

2 顯微拉曼在關(guān)節(jié)軟骨和骨關(guān)節(jié)炎研究中的應(yīng)用

顯微拉曼是拉曼光譜與顯微鏡的結(jié)合， 可以在獲取拉曼光譜圖像的同時(shí)， 提供關(guān)于生化成分的空間分布信息。 拉曼光譜儀與光學(xué)顯微鏡的耦合具有比紅外光譜成像更好的空間分辨率。 通過(guò)使用電動(dòng)顯微鏡載物臺(tái)， 可以從任意點(diǎn)收集拉曼光譜， 獲得樣品的拉曼圖譜， 并利用計(jì)算機(jī)處理所獲得的高光譜數(shù)據(jù)集， 以生成、 顯示組織中存在的化學(xué)物質(zhì)分布的圖像。

為了驗(yàn)證拉曼光譜識(shí)別OA軟骨下骨基質(zhì)中異常分子變化的可行性， Kerns等[13]采用顯微拉曼光譜、 電子計(jì)算機(jī)斷層掃描(computed tomography， CT)和化學(xué)分析方法對(duì)人關(guān)節(jié)樣本進(jìn)行分析。 比較OA樣本與非OA樣本中的膝關(guān)節(jié)外側(cè)譜帶， 發(fā)現(xiàn)在850和910 cm-1處的譜帶， 以及963和956 cm-1(磷酸鹽帶)存在差異。 比較兩組樣本膝關(guān)節(jié)的內(nèi)側(cè)譜帶， 發(fā)現(xiàn)在944和953 cm-1(磷酸鹽帶)， 1 275 cm-1(酰胺Ⅲ帶)和1 650 cm-1(橫跨酰胺I的寬區(qū)域)中存在差異。 表明OA和非OA組織可以根據(jù)膝關(guān)節(jié)外側(cè)和內(nèi)側(cè)區(qū)之間的光譜差異進(jìn)行鑒別。 拉曼光譜的磷酸鹽與酰胺的比率與CT掃描結(jié)果表明， OA期間， 軟骨下骨不僅變厚， 還發(fā)生生化成分的變化。 在OA標(biāo)本中， 還發(fā)現(xiàn)正常區(qū)域的外側(cè)也發(fā)生相關(guān)的光譜變化， 表明整個(gè)關(guān)節(jié)受到影響。 雖然該區(qū)域沒(méi)有表現(xiàn)出OA的宏觀癥狀， 但它表現(xiàn)出微小的變化， 暗示著OA的早期征象。

2012年， Buchwald團(tuán)隊(duì)[14]應(yīng)用顯微拉曼技術(shù)， 對(duì)海綿骨和軟骨下骨ECM的生化成分進(jìn)行研究。 實(shí)驗(yàn)觀察到， 在不同載荷的股骨頭部位， 羥基磷灰石與膠原、 碳酸鹽磷灰石與羥基磷灰石、 α-螺旋與β-折疊面積的比值無(wú)明顯變化， 表明載荷的增加不會(huì)引起軟骨下骨成分和結(jié)構(gòu)的改變。 他們還發(fā)現(xiàn)， 與對(duì)照組相比， OA患者的軟骨下骨礦化程度較低， 膠原基質(zhì)排列有序性也相對(duì)較低， 并且隨著OA疾病的進(jìn)展， α螺旋結(jié)構(gòu)向無(wú)序結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變的程度進(jìn)一步增加。 結(jié)果表明， 在OA中， 生物化學(xué)因素對(duì)軟骨下骨的生化組成和分子結(jié)構(gòu)的影響大于機(jī)械因素。

Pudlas研究組[15]利用顯微拉曼光譜對(duì)人和豬關(guān)節(jié)軟骨的PG含量及軟骨分區(qū)進(jìn)行了詳細(xì)研究。 脯氨酸振動(dòng)譜帶在表層區(qū)域獲得更高的信號(hào)強(qiáng)度。 但是， 硫酸軟骨素(CS)、 聚集蛋白聚糖以及GAG的拉曼譜帶， 在深區(qū)顯示出更高的信號(hào)強(qiáng)度。 這些發(fā)現(xiàn)表明， 在軟骨表層， 以膠原蛋白含量為主， 在軟骨深部區(qū)域， 以PG和GAG含量為主。 因此， 顯微拉曼可根據(jù)蛋白質(zhì)， PG和GAG含量的差異來(lái)鑒定人和豬軟骨的不同區(qū)域。

Gamsjaeger團(tuán)隊(duì)[16]也鑒定了表征PG的拉曼譜帶， 并通過(guò)拉曼成像和層次聚類分析測(cè)試這些譜帶在軟骨和骨組織中的適用性。 PG振動(dòng)產(chǎn)生1 060和1 375 cm-1的兩條拉曼譜帶。 拉曼光譜分析發(fā)現(xiàn)酰胺Ⅲ帶、 B型碳酸鹽帶以及羥基磷灰石的磷酸鹽帶與PG的1 060 cm-1拉曼譜帶重疊， 而1 375 cm-1拉曼譜帶僅由GAG振動(dòng)引起的。 他們還發(fā)現(xiàn)1 375 cm-1拉曼譜帶與組織取向無(wú)關(guān)， 因此， 1 375 cm-1可用作軟骨和骨中的PG標(biāo)記譜帶。

Albro團(tuán)隊(duì)[17]將拉曼光譜成像結(jié)合多元曲線分辨(MCR)定量測(cè)定軟骨ECM組分(GAG、 膠原和水)在動(dòng)物關(guān)節(jié)軟骨和工程軟骨組織中濃度分布。 分析動(dòng)物關(guān)節(jié)軟骨的拉曼光譜發(fā)現(xiàn)， GAG和膠原濃度隨著軟骨的深度增加而增加， 而工程軟骨的GAG和膠原濃度隨著軟骨的深度增加而降低， 經(jīng)酶處理的軟骨外植體的GAG濃度隨著離外植體表面的深度距離的增加而增加， 但膠原的濃度基本不變， 生化測(cè)定顯示類似的深度梯度。 拉曼光譜還發(fā)現(xiàn)， 水的濃度隨著離關(guān)節(jié)面的距離增加而降低。 動(dòng)物關(guān)節(jié)軟骨對(duì)GAG和膠原均表現(xiàn)出較低的組織異質(zhì)性， 工程軟骨的組織異質(zhì)性較高， 并且周圍區(qū)域比中心區(qū)域進(jìn)一步增加。

2017年， Tong等[18]采用顯微拉曼光譜法對(duì)豬軟骨磨損樣本和健康樣本進(jìn)行切片檢測(cè)來(lái)表征磨損試驗(yàn)后ECM的全深度變化。 他們發(fā)現(xiàn)早期軟骨損傷的顯著差異主要出現(xiàn)在軟骨中上區(qū)， 這表明損傷不僅發(fā)生在表面， 也發(fā)生在表面以下。 PCA結(jié)合單變量分析表明， 在某些深度(相對(duì)于軟骨表面20%～30%)的膠原蛋白含量損失是磨損期間的主要變化， 膠原纖維取向和PG含量均未發(fā)生明顯改變。

Mansfield等[19]將受激拉曼散射(SRS)應(yīng)用于未染色的新鮮馬掌指關(guān)節(jié)， 研究ECM、 細(xì)胞周圍基質(zhì)、 軟骨細(xì)胞和脂滴的成分。 ECM在2 800～3 000 cm-1范圍的自發(fā)拉曼光譜分析顯示， ECM中以膠原含量為主， 蛋白多糖含量次之。 SRS光譜顯示非鈣化軟骨的拉曼光譜主要由Ⅱ型膠原的峰主導(dǎo)。 在骨和鈣化軟骨中， 發(fā)現(xiàn)959 cm-1處存在非常強(qiáng)的磷酸鹽拉曼帶， 1 070 cm-1處存在較弱的碳酸鹽拉曼帶， 表明SRS還能對(duì)軟骨的礦物質(zhì)含量進(jìn)行成像。 在淺表軟骨細(xì)胞的周圍基質(zhì)中還存在2 840 cm-1拉曼譜帶， 表明細(xì)胞周圍基質(zhì)中存在脂質(zhì)， 并且為不飽和脂肪酸， 但ECM中不存在。 拉曼成像揭示了淺表區(qū)和深部區(qū)域之間的差異， 最明顯的是， 僅在淺表區(qū)域中細(xì)胞周圍可檢測(cè)到脂質(zhì)。

Kumar等[20-21]利用顯微拉曼鑒定OA進(jìn)程中生物分子變化的光譜特征和OA不同階段的主要光譜差異。 他們發(fā)現(xiàn)1 612～1 696 cm-1(酰胺Ⅰ)、 1 229～1 300 cm-1(酰胺Ⅲ)和1 001～1 007 cm-1(苯丙氨酸)的面積大小隨著OA等級(jí)的增加而一致降低， 并且觀察到細(xì)胞死亡的增加。 在OA進(jìn)程中， 軟骨細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)含量普遍下降， 但PG含量的降低僅在OA晚期才顯著。 酰胺Ⅲ強(qiáng)度比(I1 245/I1 270)隨著國(guó)際軟骨修復(fù)協(xié)會(huì)(ICRS)分級(jí)的增加而增加， 這意味膠原蛋白的紊亂程度隨著OA的進(jìn)展而進(jìn)一步增加。 此外， 隨著細(xì)胞內(nèi)核酸含量(780～794 cm-1)的減少， 蛋白質(zhì)含量也隨之減少。 PCA和交叉驗(yàn)證能夠鑒定OA軟骨細(xì)胞的不同階段， 發(fā)現(xiàn)Ⅰ級(jí)OA軟骨中獲得的軟骨細(xì)胞的分類精度高于其他級(jí)別。 分類錯(cuò)誤主要發(fā)生在Ⅱ級(jí)和Ⅲ級(jí)軟骨細(xì)胞之間， 表明與Ⅰ級(jí)OA軟骨相比， Ⅱ和Ⅲ級(jí)OA軟骨細(xì)胞在生化成分上有更高的異質(zhì)性。

Kunstar等[22]利用胎兒股骨的關(guān)節(jié)軟骨， 驗(yàn)證在無(wú)標(biāo)記情況下， 顯微拉曼光譜是否能有效的區(qū)分軟骨樣本中的不同組織成分。 層次聚類方法分析拉曼光譜， 結(jié)果顯示， 軟骨細(xì)胞存在1 576 cm-1處的DNA/RNA譜帶， 而ECM中不存在該譜帶， 這證實(shí)了軟骨細(xì)胞和ECM可以根據(jù)拉曼光譜進(jìn)行有效的分離。 除了1 576 cm-1譜帶的差異外， 還發(fā)現(xiàn)PG峰在ECM中的峰值更強(qiáng)。 主成分分析細(xì)胞聚類平均值， 發(fā)現(xiàn)軟骨細(xì)胞與胎兒股骨生長(zhǎng)面細(xì)胞之間的差異主要來(lái)源于細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)含量的不同。 對(duì)ECM-聚類均值的主成分分析， 發(fā)現(xiàn)軟骨成骨ECM與其他部位的差異主要來(lái)源于磷酸鹽含量的不同。

Bonifacio等[23]采集豬肱骨肩胛關(guān)節(jié)軟骨的拉曼光譜， 研究軟骨組織中軟骨細(xì)胞與ECM的光譜差異。 分析CS和膠原蛋白的平均拉曼光譜發(fā)現(xiàn)PG/膠原蛋白比值在深層高于淺表區(qū)。 拉曼光譜的單變量分析發(fā)現(xiàn)CS在軟骨細(xì)胞周圍基質(zhì)中有較高的濃度， 而膠原蛋白在ECM或區(qū)域間基質(zhì)中最密集。 四種多變量方法都能有效的區(qū)分軟骨細(xì)胞與ECM， 并且檢測(cè)到ECM中主要由PG和膠原蛋白組成。 但PCA能以較低的計(jì)算量有效地區(qū)分軟骨細(xì)胞和ECM， CS和膠原蛋白。 PLSR模型可以區(qū)分α-螺旋蛋白和β-折疊蛋白， 可以觀察到軟骨細(xì)胞中含有更豐富的α-螺旋蛋白， 而β-折疊蛋白同時(shí)存在于軟骨細(xì)胞和ECM中。 層次聚類分析、 模糊聚類分析發(fā)現(xiàn)ECM存在異質(zhì)性， 即不同的區(qū)域的ECM具有不同的特性， 這清楚地顯示了在ECM中膠原蛋白/PG的比值的變化。

Esmonde-White等[24-25]將液滴沉積結(jié)合拉曼光譜技術(shù)， 檢查40名膝骨關(guān)節(jié)炎患者的關(guān)節(jié)滑液， 識(shí)別與膝關(guān)節(jié)OA損傷相關(guān)的關(guān)節(jié)滑液中的化學(xué)變化， 并且利用損傷關(guān)節(jié)的X射線評(píng)估拉曼光譜的有效性。 SF收集的光譜中， 損傷組中1 235/1 260 cm-1(酰胺Ⅲ比率)和1 670/1 655 cm-1(酰胺Ⅰ比率)顯著增加， 表明蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)無(wú)規(guī)卷曲的程度更高， 蛋白質(zhì)的無(wú)序性增加， 進(jìn)一步表明SF大分子之間相互破壞。 比較樣本1 080/1 001 cm-1拉曼帶強(qiáng)度比， 發(fā)現(xiàn)損傷組中該譜帶的強(qiáng)度比顯著升高， 表明OA損傷的過(guò)程中， 蛋白質(zhì)骨架發(fā)生改變。 拉曼光譜對(duì)蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)中的酰胺比率的改變極其敏感， 酰胺Ⅰ拉曼帶強(qiáng)度比、 1 080/1 001 cm-1拉曼帶強(qiáng)度比可用于評(píng)估OA“是/否”損傷， 并且兩個(gè)比率隨著K/L得分而增加， 并顯示出一定的線性變化。

Dehring等[26]通過(guò)檢測(cè)SF中透明質(zhì)酸的拉曼光譜來(lái)驗(yàn)證表面增強(qiáng)拉曼光譜(SERS)用于體外OA生物標(biāo)志物檢測(cè)的可行性。 他們發(fā)現(xiàn)， 不論是人造的SF還是犬的SF， 在低濃度的HA下， 都能有效的檢測(cè)到HA， 并且發(fā)現(xiàn)其最低檢出閾值為0.5 mg·mL-1， 接近病理性SF中的HA濃度。 也說(shuō)明了SERS技術(shù)用于組織液檢測(cè)的潛力和可行性。

3 光纖拉曼在關(guān)節(jié)軟骨和骨關(guān)節(jié)炎研究中的應(yīng)用

光纖拉曼是在常規(guī)拉曼光譜儀上耦合光纖探針， 利用探針檢測(cè)收集組織樣本的拉曼光譜。 光纖探針主要由激發(fā)光纖和收集光纖構(gòu)成， 其中激發(fā)光纖將激光傳輸至目標(biāo)區(qū)域， 再通過(guò)收集光纖將拉曼散射收集傳輸?shù)綑z測(cè)器。 光纖拉曼探針的引入使得基于拉曼光譜的人體體內(nèi)組織的在體原位檢測(cè)成為可能。

2013年， Buckley等[27]使用三種不同的多元技術(shù)(帶目標(biāo)熵最小化(BTEM)、 多元曲線分辨和并行因子分析(PARAFAC))來(lái)處理光纖拉曼光譜數(shù)據(jù)， 并比較三種技術(shù)的處理性能。 這三種技術(shù)均能準(zhǔn)確地重建磷酸鹽與碳酸鹽的比值， 每種分析的誤差均小于2%， 但PARAFAC最接近測(cè)定的礦物與膠原的比值。 因此， 使用PARAFAC能夠解決較復(fù)雜的礦物質(zhì)與膠原的比值(復(fù)雜程度取決于軟組織層和骨中的膠原蛋白)， 并且有足夠的準(zhǔn)確性來(lái)檢測(cè)與骨關(guān)節(jié)炎、 骨質(zhì)疏松和成骨不全相關(guān)的成分差異。 雖然不可能通過(guò)直接測(cè)量志愿者的骨骼來(lái)驗(yàn)證， 但這些數(shù)據(jù)與來(lái)自尸體組織的脛骨骨膜拉曼光譜吻合得很好。

2017年， Stevens等[28]將近紅外光纖拉曼光譜結(jié)合組織工程(TE)技術(shù)， 進(jìn)行在線監(jiān)測(cè)并量化軟骨構(gòu)建過(guò)程中活細(xì)胞組織中的ECM成分含量變化。 實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)動(dòng)物關(guān)節(jié)軟骨和TE構(gòu)建軟骨在不同時(shí)間點(diǎn)的平均拉曼光譜標(biāo)準(zhǔn)差表現(xiàn)出高度可重復(fù)性的特征， 具有微妙的生物分子可變性， 而且隨著ECM沉積的積累， TE構(gòu)建軟骨的生物分子組成逐漸變得與動(dòng)物關(guān)節(jié)軟骨更為相似。 隨著時(shí)間的推移， TE構(gòu)建軟骨的光學(xué)性質(zhì)不會(huì)因?yàn)榧ぐl(fā)和散射拉曼光子的穿透深度和收集效率的改變而導(dǎo)致生化定量改變。 結(jié)構(gòu)力學(xué)性能與GAG和膠原含量密切相關(guān)， 表明ECM生化指標(biāo)可以作為工程軟骨組織力學(xué)完整性的可靠指標(biāo)。

Esmonde-White等[29]利用光纖拉曼光譜對(duì)人關(guān)節(jié)組織進(jìn)行了檢測(cè)， 重點(diǎn)研究了軟骨下骨生化成分的變化。 設(shè)計(jì)了一種鋼筆式的光纖探針， 用于檢測(cè)膝關(guān)節(jié)組織中的軟骨下骨。 探針的外環(huán)中有激發(fā)光纖， 內(nèi)環(huán)中有收集光纖， 其中收集光纖與激發(fā)光纖在空間上偏移， 可以最大限度地收集關(guān)節(jié)組織信號(hào)。 從這些探針中收集到的拉曼光譜主要由軟骨和軟骨下骨信號(hào)組成， 存在少量脂肪信號(hào)。 實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)， 1 063 cm-1拉曼帶是軟骨中硫酸化GAG特有的拉曼帶， 可作為軟骨的光譜標(biāo)記物。 碳酸磷灰石礦物骨特有的拉曼帶在958和1 070 cm-1處， 對(duì)應(yīng)于磷酸鹽ν1和碳酸鹽ν1， 可作為骨的光譜標(biāo)記物。 1 301和1 744 cm-1的譜帶是脂質(zhì)獨(dú)有的， 歸因于松質(zhì)骨中的骨髓脂質(zhì)， 作為松質(zhì)骨的光譜標(biāo)記物。 完整軟骨的拉曼光譜顯示軟骨和骨發(fā)出的信號(hào)， 并且有少量的松質(zhì)骨信號(hào)， 但其貢獻(xiàn)最小。 與顯微光譜相似， 1 200～1 700 cm-1處有明顯的重疊現(xiàn)象， 因?yàn)檐浌侵械蘑蛐湍z原和骨中的I型膠原具有相似的拉曼光譜。 局部性病灶的光譜包含軟骨的信號(hào)， 和更強(qiáng)烈的磷酸鹽ν1信號(hào)， 并且在1 072 cm-1出現(xiàn)碳酸鹽的譜帶， 表明軟骨下骨的貢獻(xiàn)強(qiáng)于軟骨的信號(hào)。 全深度腐蝕區(qū)域的拉曼光譜中， 未觀察到1 063 cm-1的譜帶， 表明該區(qū)域只包含來(lái)自軟骨下骨的信號(hào)。 通過(guò)計(jì)算組織模型1 063/958 cm-1拉曼帶強(qiáng)度比發(fā)現(xiàn)， 拉曼光譜信號(hào)與組織的散射水平有關(guān)， 并且進(jìn)一步證實(shí)可使用1 063/958 cm-1比率作為軟骨與骨的相對(duì)含量的光譜標(biāo)記。 人體關(guān)節(jié)和組織模型的測(cè)量表明， 使用光纖探針在關(guān)節(jié)面采集的拉曼光譜包含了底層骨組織的貢獻(xiàn)， 骨信號(hào)隨軟骨厚度和散射水平的變化而變化。

目前也有一些關(guān)于光纖拉曼用于骨的研究報(bào)道。 Schulmerich等[30]將拉曼光譜結(jié)合光纖探針準(zhǔn)確無(wú)創(chuàng)地評(píng)估了活體小鼠皮膚下的骨組織成分， 并采用多因素分析從經(jīng)皮測(cè)量中恢復(fù)骨光譜。 Maher等[31]將空間偏移拉曼光譜結(jié)合光纖探針進(jìn)一步進(jìn)行骨的非侵入性體內(nèi)測(cè)量， 準(zhǔn)確預(yù)測(cè)樣本的骨折狀況。 本課題組將內(nèi)窺鏡與光纖拉曼相結(jié)合， 設(shè)計(jì)了一種可內(nèi)窺光纖拉曼探針。 該探針的整體設(shè)計(jì)思路是在盡量減小光纖探針直徑和體積的前提下， 實(shí)現(xiàn)內(nèi)窺成像與拉曼光譜的在體檢測(cè)一體化。 文獻(xiàn)報(bào)道的現(xiàn)有的光纖拉曼探針則是將其放置于內(nèi)窺鏡器械通道， 在內(nèi)鏡檢查時(shí)進(jìn)行拉曼檢測(cè)， 因此該類光纖拉曼探針尺寸受器械通道空間尺寸限制， 而一體化設(shè)計(jì)的內(nèi)窺成像與拉曼光譜相融合， 探針直徑將不再受限， 使得探針適用于更多應(yīng)用環(huán)境。

4 結(jié)論與展望

精確的原位探測(cè)及在高空間分辨率下主成分含量分布和結(jié)構(gòu)排列變化探測(cè)， 越來(lái)越成為各種軟骨和OA研究中的硬性要求。 拉曼光譜能以較高的靈敏度和特異性檢測(cè)OA進(jìn)程中關(guān)節(jié)軟骨、 軟骨下骨、 SF中的生化成分的變化以及濃度分布， 能根據(jù)光譜特性鑒定OA的不同階段(即ICRS分級(jí)[20])， 評(píng)估不同方法手段對(duì)OA的診療效果， 區(qū)分樣本中的不同組織。 即使是在疾病早期， 也能在微米級(jí)水平提供各組織的生物分子變化[32]。 拉曼光譜峰值的強(qiáng)度與物質(zhì)分子的濃度成正比， 因此可對(duì)待測(cè)樣本定量分析。 在測(cè)量樣本前， 也不需要復(fù)雜的樣本制備。

目前為止， 現(xiàn)有宏觀及顯微拉曼系統(tǒng)體積較大， 主要應(yīng)用于對(duì)生物的體外和離體(切片)組織的拉曼光譜采集， 無(wú)法進(jìn)行在體(活體內(nèi))生物組織拉曼檢測(cè)。 因此拉曼光譜仍多局限于實(shí)驗(yàn)室環(huán)境， 直接應(yīng)用于OA臨床監(jiān)測(cè)和診斷仍有較大難度。 另一方面， 由于OA病因及發(fā)病機(jī)制尚不明確， 早期OA組織生化成分之間的關(guān)系也需要進(jìn)一步的探索。

隨著拉曼光譜技術(shù)的日益完善， 越來(lái)越多的創(chuàng)新性研究成果被發(fā)現(xiàn)。 特別是微型拉曼光纖探針的研制， 將使得拉曼光譜從原先的實(shí)驗(yàn)室研究走向臨床， 使得基于拉曼光譜的人體體內(nèi)組織的在體原位檢測(cè)成為可能。 光纖探針整體體積小、 高度靈活， 更加適用于生物在體拉曼檢測(cè)， 開(kāi)發(fā)新的內(nèi)窺光纖拉曼探針， 將為推進(jìn)關(guān)節(jié)軟骨和OA的診斷研究有著重要意義。