婁海偉 余穎豪 林俊芳 郭麗瓊* 葉志偉 李 艷 魏 韜 云 帆

（1 華南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院生物工程系 廣州510642 2 河南工業(yè)大學(xué)糧油食品學(xué)院 鄭州 450001 3 廣東省微生態(tài)制劑工程技術(shù)研究中心 廣州510642 4 廣州市澳鍵豐澤生物科技股份有限公司 廣州510760）

蛹蟲草（Cordyceps militaris）是一種重要的食藥兩用真菌， 它具有和冬蟲夏草相似的藥用價值和活性成分[1]，被廣泛作為冬蟲夏草的替代品。 蛹蟲草含有蟲草素[2]、蟲草酸[3]、蟲草多糖[4]等生物活性成分，具有免疫調(diào)節(jié)[5]、抗疲勞[6]、抗腫瘤[7]等活性，已成為研究的熱點。隨著菌體中噴司他丁等抗癌化合物的發(fā)現(xiàn)[8]， 蛹蟲草的市場需求量逐漸增大。雖然蛹蟲草的人工栽培技術(shù)已推廣應(yīng)用，但產(chǎn)量仍無法滿足日益增長的市場需求， 其主要原因是價格較高的菌體中生物活性成分含量低。 基因工程是提高蛹蟲草生物活性成分的有效方法，然而大多數(shù)與生物活性成分合成相關(guān)的基因的功能仍然未知， 主要是因為蛹蟲草具有一層較厚且致密的細(xì)胞壁，這給基因工程操作中載體DNA 的轉(zhuǎn)化帶來很大困難。目前，蛹蟲草遺傳轉(zhuǎn)化的方法主要有農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化法[9]、基因槍法[10]、聚乙二醇（polyethylene glycol，PEG）介導(dǎo)的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化法[11]。 相對于基因槍法，PEG 介導(dǎo)原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化法設(shè)備條件要求低，方法簡單。相對于農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化法，PEG 介導(dǎo)轉(zhuǎn)化原生質(zhì)體法試驗周期短。 另外， 通過原生質(zhì)體融合亦可選育高產(chǎn)生物活性成分的優(yōu)良蛹蟲草菌株[12]。 原生質(zhì)體的制備是實現(xiàn)蛹蟲草原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化和原生質(zhì)體融合的技術(shù)關(guān)鍵。

對于食用真菌， 制備原生質(zhì)體的材料主要有菌絲、芽生孢子、分生孢子等。在基因工程操作中，通常需要單細(xì)胞核的受體材料， 且細(xì)胞壁易被酶水解。 蛹蟲草產(chǎn)菌絲、芽生孢子[13]、分生孢子[14]。 芽生孢子細(xì)胞壁薄[15]，易被溶壁酶水解釋放原生質(zhì)體，是良好的制備原生質(zhì)體的材料。 目前，還未見有關(guān)蛹蟲草芽生孢子細(xì)胞核觀察的報道， 亦未見采用蛹蟲草芽生孢子制備原生質(zhì)體的報道。 本文以蛹蟲草芽生孢子為材料，觀察其細(xì)胞核數(shù)，對其原生質(zhì)體制備條件和再生培養(yǎng)基中的滲透壓穩(wěn)定劑進(jìn)行優(yōu)化， 為蛹蟲草原生質(zhì)體的轉(zhuǎn)化和原生質(zhì)體的融合提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 菌株與試劑

蛹蟲草10 號菌株（CM-10）保藏于華南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院天然產(chǎn)物實驗室。 4’，6-二脒基-2-苯 基吲哚 （4’，6 -diamidino -2 -phenylindole，DAPI），Solarbio 公 司； 熒光增白劑（Fluorescent Brightener 28），Sigma 公司；溶壁酶，廣東省微生物研究所；氯化鉀、氯化鈉、甘露醇、山梨醇、葡萄糖、蔗糖、磷酸二氫鉀、硫酸鎂等均為分析純，購自廣州化學(xué)試劑廠。

1.2 培養(yǎng)基

馬鈴薯葡萄糖水（Potato dextrose broth，PDB）培養(yǎng)基：馬鈴薯20.0%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)，下同）、葡萄糖2.0%、硫酸鎂0.15%、磷酸二氫鉀0.3%。

馬鈴薯葡萄糖瓊脂 （Potato dextrose agar，PDA）培養(yǎng)基：PDB 培養(yǎng)基、瓊脂2.0%。

再生培養(yǎng)基（Regeneration medium，RM）：PDA培養(yǎng)基、滲透壓穩(wěn)定劑。

1.3 儀器與設(shè)備

DMi8L 徠卡熒光顯微鏡， 德國徠卡微系統(tǒng)有限公司；SW-CJ-1FD 超凈工作臺， 江蘇蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；MQD-S2R 振蕩培養(yǎng)箱， 上海旻泉儀器有限公司；MJ-Ⅱ霉菌培養(yǎng)箱，上海一恒科技有限公司；5804R 高速冷凍離心機，Eppendorf公司。

1.4 方法

1.4.1 芽生孢子的收集 將菌株CM-10 接種到PDA 培養(yǎng)皿上，25 ℃培養(yǎng)28 d，得到活化母種。 用接種刀從CM-10 母種培養(yǎng)皿上取4 塊1 cm×1 cm 的菌塊接種于100 mL PDB 培養(yǎng)基中，25 ℃振蕩培養(yǎng)4 d（150 r/min），得到發(fā)酵液。 用6 層滅菌紗布過濾發(fā)酵液，離心（8 000 r/min，10 min）濾液（含芽生孢子），棄上清，用滅菌雙蒸水（doubledistilled water，ddH2O）清洗3 次即得蛹蟲草芽生孢子，用于熒光染色和原生質(zhì)體的制備。

1.4.2 芽生孢子的熒光染色 取適量芽生孢子與500 μL 10%甲醛溶液混合， 靜置24 h 后離心（8 000 r/min，10 min）棄上清，加入50 μL 2.5 μg/mL 熒光增白劑（染色細(xì)胞壁）和50 μL 5 μg/mL的DAPI（染色細(xì)胞核）靜置染色30 min，取10 μL染色后的芽生孢子滴加至載玻片，加蓋蓋玻片，在1 000 倍熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞核數(shù) （激發(fā)波長340 nm）。

1.4.3 原生質(zhì)體的制備 將芽生孢子用0.8 mol/L的KCl 清洗3 次， 并重懸于0.8 mol/L 的KCl 中，通過血球計數(shù)板計數(shù)法調(diào)整其濃度至1×109個/mL。 取100 μL 芽生孢子液，離心（8 000 r/min，10 min）并棄上清，加1 mL 溶壁酶液（溶壁酶粉末溶解于0.8 mol/L 的KCl 中，經(jīng)0.22 μm 微孔濾膜過濾除菌）混勻，置于恒溫?fù)u床中（90 r/min）酶解一定時間， 酶解后經(jīng)4 層擦鏡紙過濾得包含原生質(zhì)體的濾液，4 ℃離心 （4 000 r/min，10 min）后棄上清，加1 mL 0.8 mol/L 的KCl 重新懸浮原生質(zhì)體，在400 倍顯微鏡下采用血球計數(shù)板對其計數(shù)。

1.4.4 原生質(zhì)體制備條件的單因素試驗 在預(yù)試驗的基礎(chǔ)上，選取酶質(zhì)量分?jǐn)?shù)、酶解溫度、酶解時間作為原生質(zhì)體制備的影響因素， 以原生質(zhì)體得率為評價指標(biāo)，進(jìn)行單因素試驗。調(diào)節(jié)酶質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.5%，1.0%，1.5%，2.0%，2.5%，3.0%，酶解溫度為18，22，26，30，35，40 ℃， 酶解時間為1.0，1.5，2.0，2.5，3.0，3.5，4.0，5.0 h。

1.4.5 原生質(zhì)體制備條件的優(yōu)化 根據(jù)單因素試驗結(jié)果，選擇酶質(zhì)量分?jǐn)?shù)、酶解溫度、酶解時間為自變量（xi），以原生質(zhì)體得率為響應(yīng)值（Y），選用Box-Behnken 試驗設(shè)計[16]。各因素變化區(qū)間根據(jù)單因素試驗確定。每個試驗點均做3 個平行樣。因素水平編碼見表1。

表1 Box-Behnken 試驗因素水平編碼表Table 1 Factors and levels of Box-Behnken experimental design

1.4.6 RM 中滲透壓穩(wěn)定劑的單因素試驗 原生質(zhì)體的再生受到RM 中的滲透壓穩(wěn)定劑種類和濃度的影響， 本試驗選取6 種常用的滲透壓穩(wěn)定劑（氯化鉀、氯化鈉、甘露醇、山梨醇、葡萄糖、蔗糖），以滲透壓穩(wěn)定劑種類和濃度為影響因子， 以原生質(zhì)體再生率為評價指標(biāo)，進(jìn)行單因素試驗。調(diào)節(jié)滲透壓穩(wěn)定劑的濃度為0.2，0.4，0.6，0.8，1.0 mol/L。

在響應(yīng)面優(yōu)化條件下制備原生質(zhì)體， 用0.8 mol/L KCl 調(diào)整濃度至1×103個/mL， 取50 μL 涂布于RM 上，同時取50 μL 涂布于PDA 培養(yǎng)基上做對照，25 ℃避光培養(yǎng)6 d， 計算原生質(zhì)體的再生率。

原生質(zhì)體再生率 （%）=（RM 上的菌落數(shù) -PDA 培養(yǎng)基上的菌落數(shù)）/ 涂布原生質(zhì)體數(shù) ×100%

1.5 統(tǒng)計分析

應(yīng)用Design-Expert 8.0.6 軟件進(jìn)行Box-Behnken 試驗設(shè)計和分析；Origin 9.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和圖形的制作（P<0.01 表明差異極顯著；P<0.05 表明差異顯著；P>0.05 表明差異不顯著）。

2 結(jié)果與分析

2.1 蛹蟲草芽生孢子的細(xì)胞核觀察

蛹蟲草芽生孢子在1 000 倍的明場顯微鏡下呈棒狀結(jié)構(gòu)（圖1a），這與前人的研究結(jié)果一致[13-14]。在1 000 倍的熒光顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)， 蛹蟲草芽生孢子為單核的細(xì)胞（圖1b）。 以上結(jié)果表明，蛹蟲草可以產(chǎn)芽生孢子，且為單個細(xì)胞核，適合作為基因工程操作的材料。

圖1 蛹蟲草芽生孢子的顯微觀察Fig.1 Microscopic observation of Cordyceps militaris blastospores

2.2 原生質(zhì)體制備的單因素試驗結(jié)果

2.2.1 酶質(zhì)量分?jǐn)?shù)對原生質(zhì)體得率的影響 溶壁酶的主要作用是水解細(xì)胞壁， 使芽生孢子釋放原生質(zhì)體，是影響原生質(zhì)體釋放的主要因素。本試驗在酶解溫度30 ℃、酶解時間3 h 條件下，調(diào)節(jié)酶質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.5%，1.0%，1.5%，2.0%，2.5%，3.0%進(jìn)行酶解試驗，結(jié)果見圖2。

由圖2 可知，在酶質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.5%～2.0%時，隨著酶質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加， 原生質(zhì)體的得率逐漸增加，這是因為此階段芽生孢子足夠多，而酶相對較少，隨著酶質(zhì)量分?jǐn)?shù)增加，原生質(zhì)體釋放量增多，當(dāng)酶質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2.0%時，原生質(zhì)體的得率達(dá)到最大值。 當(dāng)酶質(zhì)量分?jǐn)?shù)大于2.0%，隨著酶質(zhì)量分?jǐn)?shù)增加，原生質(zhì)體得率呈下降趨勢，這可能是因為酶已飽和或過飽和， 過多的酶作用于已形成的原生質(zhì)體， 使已形成的原生質(zhì)體破裂而造成原生質(zhì)體得率降低[17]。 以上結(jié)果表明，2.0%的溶壁酶質(zhì)量分?jǐn)?shù)較適合蛹蟲草原生質(zhì)體的制備。

圖2 溶壁酶質(zhì)量分?jǐn)?shù)對原生質(zhì)體得率的影響Fig.2 The effect of lywallzyme concentration on the yield of protoplasts

2.2.2 酶解溫度對原生質(zhì)體得率的影響 在溶壁酶質(zhì)量分?jǐn)?shù)2.0%、酶解時間3 h 條件下，調(diào)節(jié)酶解溫度為18，22，26，30，35，40 ℃進(jìn)行酶解試驗，結(jié)果見圖3。

由圖3 可知，隨著酶解溫度的升高，原生質(zhì)體的得率顯著升高，當(dāng)溫度升高至26 ℃時，原生質(zhì)體的得率達(dá)到最大值。 當(dāng)酶解溫度高于26 ℃時，隨著溫度的升高，原生質(zhì)體的得率迅速下降。與其它酶促反應(yīng)一樣， 溫度是影響酶活性的主要因素之一，大多數(shù)酶都具有最適酶活性溫度，溶壁酶亦是如此，越偏離最適酶活性溫度，酶活性越低[18]。當(dāng)酶解溫度偏離26 ℃時， 原生質(zhì)體的得率下降，這是因為溶壁酶的活性降低， 由此可知溶壁酶的最適酶活性溫度為26 ℃左右。

2.2.3 酶解時間對原生質(zhì)體得率的影響 在溶壁酶質(zhì)量分?jǐn)?shù)2.0%，酶解溫度26 ℃條件下，調(diào)節(jié)酶解時間為1.0，1.5，2.0，2.5，3.0，3.5，4.0，5.0 h 進(jìn)行

圖3 酶解溫度對原生質(zhì)體得率的影響Fig.3 The effect of temperature on the yield of protoplasts

2.3 原生質(zhì)體制備條件的優(yōu)化

2.3.1 模型方程建立與顯著性檢驗 在單因素試驗基礎(chǔ)上， 采用響應(yīng)面法對原生質(zhì)體的制備條件進(jìn)行優(yōu)化。試驗方案設(shè)計和響應(yīng)值見表2。通過分析自變量和因變量得到一個能夠在給定的范圍內(nèi)預(yù)測原生質(zhì)體得率的回歸模型， 該回歸模型方程為：Y = -1.55518×108+ 2.55208×107x1+ 6.51302×106x2+4.13958×107x3-2.91667×105x1x2+5.83333×105x1x3- 1.45833×105x2x3- 4.70833×106x12-1.06120×105x22-7.54167×106x32。

Box-Behnken 試驗設(shè)計的方差分析見表3。由表3 可知，本研究所得回歸模型極顯著（P<0.0001），失擬不顯著（P=0.8395），決定系數(shù)R2為0.9917，說明建立的模型與實際情況擬合良好，誤差小， 能較好的表明各因素與原生質(zhì)體得率之間的關(guān)系。 根據(jù)方差分析和回歸方程系數(shù)顯著性檢酶解試驗，結(jié)果見圖4。

由圖4 可知，隨著酶解時間的延長，原生質(zhì)體的得率迅速升高， 當(dāng)酶解時間延長至2.5 h 時，原生質(zhì)體的得率達(dá)到最大值。 但當(dāng)酶解時間超過2.5 h 后，原生質(zhì)體的得率逐漸降低。 以上結(jié)果表明適宜的酶解時間是制備原生質(zhì)體的重要條件，酶解時間過短，芽生孢子的細(xì)胞壁去除不徹底，導(dǎo)致原生質(zhì)體的得率低[19]；酶解時間過長，導(dǎo)致已生成的原生質(zhì)體皺縮， 損害細(xì)胞質(zhì)膜并使原生質(zhì)體破裂，從而引起原生質(zhì)體的得率降低[17]。 以上結(jié)果表明，酶解2.5 h 較適合蛹蟲草原生質(zhì)體的制備。驗的結(jié)果， 將差異不顯著的因子剔除后得到的回歸方程為：Y = - 1.58435×108+ 2.69792 × 107x1+6.51302 × 106x2+ 4.25625 × 107x3- 2.91667 ×105x1x2-1.45833×105x2x3-4.70833×106x12-1.06120×105x22-7.54167×106x32。

圖4 酶解時間對原生質(zhì)體得率的影響Fig.4 The effect of time on the yield of protoplasts

2.3.2 自變量對原生質(zhì)體得率的影響 原生質(zhì)體的得率受回歸方程的回歸系數(shù)的影響。 由表3 可知，x1、x2、x3、x1x2、x2x3、x12、x22、x32項對原生質(zhì)體的得率均有顯著影響，x1x3影響不顯著。 根據(jù)回歸方程中的回歸系數(shù)絕對值的大小可分析各個因素的改變對原生質(zhì)體得率影響的大小。 回歸方程一次項的回歸系數(shù)絕對值大小依次為x3、x1、x2，表明酶解時間對原生質(zhì)體得率的影響最大， 其次是酶質(zhì)量分?jǐn)?shù)、酶解溫度。 固定3 個因素中的1 個因素在0水平， 得出其余2 個因素的交互作用對原生質(zhì)體得率影響的響應(yīng)面圖， 如圖5～圖7。 由圖5～圖7可知，3 個因素與原生質(zhì)體得率呈拋物線的關(guān)系，即隨著各影響因素值的增加， 原生質(zhì)體得率先升高后降低， 這說明各因素與響應(yīng)值之間并非單純的直線線性關(guān)系。 響應(yīng)曲面的陡峭程度反應(yīng)變量對原生質(zhì)體得率的影響程度， 曲面越陡表明影響越大，反之則較小。 圖5～圖7 表明，任何兩個因素的交互作用都存在最高點， 即各因素在所選取的范圍內(nèi)均能得到最大響應(yīng)值， 表明各因素所選擇的試驗范圍合理有效。

表2 Box-Behnken 試驗設(shè)計和響應(yīng)值Table 2 Experimental design of Box-Behnken and response values

表3 回歸模型方差分析表Table 3 Analysis of variance of regression model

2.3.3 最適條件和回歸模型的驗證 根據(jù)上述建立的回歸模型， 采用Design-Expert 8.0.6 軟件優(yōu)化原生質(zhì)體的制備條件，得出最適制備條件為：酶質(zhì)量分?jǐn)?shù)2.06%，酶解溫度26.1 ℃，酶解時間2.57 h， 在此條件下， 原生質(zhì)體得率的預(yù)測值為8.97×106個/mL，而實際測得的原生質(zhì)體得率為（9.17±0.29）×106個/mL， 實際值與預(yù)測值之間的相對誤差為2.18%，差異不顯著，說明該模型對原生質(zhì)體制備條件的優(yōu)化可靠性強，具有一定的實用價值。

2.4 蛹蟲草原生質(zhì)體的顯微觀察

在響應(yīng)面優(yōu)化的條件下制備原生質(zhì)體， 并直接在1 000 倍的明場顯微鏡下觀察， 結(jié)果見圖8。通過顯微觀察可知， 蛹蟲草原生質(zhì)體呈半透明狀態(tài)、圓形，與棒狀的芽生孢子形態(tài)差異顯著，易于區(qū)分，在制備原生質(zhì)體時，可隨時顯微觀察芽生孢子的酶解情況。

2.5 RM 中滲透壓穩(wěn)定劑對蛹蟲草原生質(zhì)體再生的影響

2.5.1 RM 中滲透壓穩(wěn)定劑種類對原生質(zhì)體再生率的影響 原生質(zhì)體對不同種類的滲透壓穩(wěn)定劑耐受能力不一[20]，本試驗設(shè)定RM 中滲透壓穩(wěn)定劑的濃度為0.8 mol/L， 研究6 種常用的滲透壓穩(wěn)定劑對原生質(zhì)體再生率的影響（圖9）。

由圖9 可知，RM 中的6 種滲透壓穩(wěn)定劑對原生質(zhì)體的再生有顯著的影響。 甘露醇作為RM 中的滲透壓穩(wěn)定劑時，再生率最高（大于40%），其次是山梨醇、氯化鉀、葡萄糖、蔗糖，其再生率均在19%以上。 而以氯化鈉作為滲透壓穩(wěn)定劑時，原生質(zhì)體的再生率最低，僅為13.67%±2.52%。因此，選用甘露醇作為RM 中的滲透壓穩(wěn)定劑。

2.5.2 RM 中甘露醇濃度對原生質(zhì)體再生率的影響 以甘露醇作為RM 中的滲透壓穩(wěn)定劑， 調(diào)節(jié)甘露醇的濃度分別為0.2，0.4，0.6，0.8，1.0 mol/L，研究RM 中甘露醇濃度對原生質(zhì)體再生率的影響，結(jié)果見圖10。

由圖10 可知，隨著RM 中甘露醇濃度的增加，原生質(zhì)體的再生率逐漸升高， 當(dāng)甘露醇濃度達(dá)到1.0 mol/L 時，原生質(zhì)體的再生率達(dá)到最大值（43.67%±2.08%），且與0.8 mol/L 甘露醇（再生率43.33%±2.08%）對再生率的影響差異不顯著，因此，為節(jié)約成本，本試驗選取0.8 mol/L 甘露醇作為RM 中的最適濃度和滲透壓穩(wěn)定劑。

圖5 溶壁酶質(zhì)量分?jǐn)?shù)和酶解溫度對原生質(zhì)體得率影響的響應(yīng)面圖Fig.5 Response surface for effects of lywallzyme concentration and temperature on the yield of protoplasts

圖6 溶壁酶質(zhì)量分?jǐn)?shù)和酶解時間對原生質(zhì)體得率影響的響應(yīng)面圖Fig.6 Response surface for effects of lywallzyme concentration and time on the yield of protoplasts

圖7 酶解溫度和酶解時間對原生質(zhì)體得率影響的響應(yīng)面圖Fig.7 Response surface for effects of temperature and time on the yield of protoplasts

圖8 蛹蟲草原生質(zhì)體的顯微觀察（1 000×）Fig.8 Microscopic observation of Cordyceps militaris protoplasts

圖9 滲透壓穩(wěn)定劑對原生質(zhì)體再生率的影響Fig.9 Effects of osmotic stabilizers on the regeneration rate of protoplasts

圖10 甘露醇濃度對原生質(zhì)體再生率的影響Fig.10 The effect of mannitol concentration on the regeneration rate of protoplasts

3 結(jié)論

通過顯微鏡觀察， 蛹蟲草的芽生孢子呈棒狀結(jié)構(gòu)、 單個細(xì)胞核， 原生質(zhì)體呈半透明的圓形結(jié)構(gòu)。在單因素試驗的基礎(chǔ)上，通過響應(yīng)面法優(yōu)化了蛹蟲草原生質(zhì)體的制備條件， 建立了多元回歸模型，模型顯著且擬合度良好。酶解條件對原生質(zhì)體得率的影響大小順序為：酶解時間> 溶壁酶質(zhì)量分?jǐn)?shù)> 酶解溫度。 優(yōu)化的最適酶解條件為：溶壁酶質(zhì)量分?jǐn)?shù)2.06%，酶解溫度26.1 ℃，酶解時間2.57 h。 在此條件下， 原生質(zhì)體的得率達(dá)到了（9.17±0.29）×106個/mL。 再生培養(yǎng)基中的最適滲透壓穩(wěn)定劑的濃度和種類為0.8 mol/L 甘露醇。