余 剛 蔡 薇 宋田源 姜澤東，3* 倪 輝，3 劉光明，4

（1 集美大學(xué)食品與生物工程學(xué)院 福建廈門361021 2 廈門市疾病預(yù)防控制中心 福建廈門361021 3 福建省食品微生物與酶工程重點實驗室 福建廈門361021 4 廈門市海洋功能食品重點實驗室 福建廈門361021）

海藻多糖具有多種優(yōu)良的生物活性， 如免疫調(diào)節(jié)、降血脂、降血壓、抗凝血、抗氧化、抗腫瘤、抗病毒、抑菌活性等[1-8]，特別是其免疫調(diào)節(jié)活性，在功能食品和醫(yī)藥品領(lǐng)域有重要的開發(fā)和應(yīng)用價值。 目前已有多種海藻多糖被發(fā)現(xiàn)具有強效的免疫調(diào)節(jié)活性，如巖藻聚糖、泡葉藻聚糖、紫菜多糖、龍須菜多糖等[3，9-10]。 隨著對海藻多糖活性研究的深入， 海藻多糖的作用機理和功效關(guān)系已成為多糖領(lǐng)域的研究熱點之一。

紅毛藻（Bangia fusco-purpure）是我國東南沿海特有的經(jīng)濟(jì)紅藻資源，又稱紅毛菜、紅棉藻等，屬紅藻門，原紅藻綱，紅毛菜目，紅毛菜科，紅毛菜屬，在福建沿海分布較廣，莆田市南日島鎮(zhèn)是其主要產(chǎn)地之一。相關(guān)研究和民間應(yīng)用實踐表明，紅毛藻具有提高免疫力、降血壓、降血脂、滋陰祛火和防止動脈粥狀硬化等心血管疾病的食、藥用功效，而對其作用機理尚不明確。 多糖是紅毛藻藻體的主要結(jié)構(gòu)物質(zhì)之一， 同時也是主要的生物活性成分之一，目前關(guān)于紅毛藻多糖的結(jié)構(gòu)、生物活性及活性機理鮮有報道[11-13]。

通過熱水抽提和乙醇沉淀的方法提取紅毛藻粗多糖[14]，用陽離子交換柱層析和葡聚糖凝膠過濾柱層析對粗多糖進(jìn)行初步純化， 獲得紅毛藻多糖BFP。 Jiang 等[15]研究表明BFP 是一種硫酸化多糖，主要由半乳糖、糖醛酸和硫酸基團(tuán)組成；本研究采用DEAE-cellulose52 陰離子交換柱層析的方法分級制備紅毛藻多糖3 個組分F1、F2 和F3，對其進(jìn)行單糖組成及化學(xué)組成分析， 明確其多糖的基本組成特征。 利用小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7 模型，圍繞紅毛藻多糖BFP 及其分級純化多糖組分F1、F2、F3 的誘導(dǎo)RAW264.7 細(xì)胞活化釋放免疫因子，包括一氧化氮（nitric oxide，NO）、腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor-α，TNF-α）和活性氧簇（reactive oxygen species， ROS）的活性（體外免疫誘導(dǎo)活性檢測指標(biāo)）展開研究[16-17]，旨在明確其免疫調(diào)節(jié)活性和相關(guān)機理， 闡明紅毛藻具有提高免疫力功效的作用機制， 為紅毛藻及其多糖組分在食品和醫(yī)藥領(lǐng)域的開發(fā)和應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料和試劑

紅毛藻藻體，采集于福建省莆田市南日島海域。

小鼠巨噬細(xì)胞系RAW264.7， 購自中科院上海細(xì)胞庫。

胎牛血清（FBS），中國賽默飛世爾科技公司；100X 青鏈雙抗溶液， 美國sigma 公司； 高 糖DMEM培養(yǎng)基， 美 國Hyclone 公 司；噻唑藍(lán)（MTT），美國sigma 公司；四唑氮藍(lán)（NBT），美國sigma 公 司；Mouse TNF-α Colorimetric ELISA kit， 美 國Thermo Fisher Scientific 公司；DEAEcellulose 52 填料， 美國Whatman 公司；Sephadex G-75 葡聚糖凝膠層析柱和Superdex 75 10/300 GL 凝膠層析柱， 瑞典GE 公司； 牛血清蛋白（BSA），美國Sigma 公司；標(biāo)準(zhǔn)單糖和內(nèi)標(biāo)：D-阿拉伯糖（Ara）、D-半乳糖（Gal）、L-木糖（Xyl）、L-巖藻糖（Fuc）、D-甘露糖（Man）、D-葡萄糖（Glc），美國Sigma 公司；1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮（PMP）， 阿拉丁試劑 （上海）有限公司； 抑制劑SB203580，SP600125，U0126，美國Sigma 公司；抑制劑PDTC，碧云天生物技術(shù)研究所；其余試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器和設(shè)備

Avanti J26XP 高速冷凍離心機， 德國貝克曼公司；Free Zone 6 plus 真空冷凍干燥機， 美國Labconco 公司；BioTek Cytation-5 細(xì)胞成像多功能檢測系統(tǒng)，美國伯騰儀器有限公司；1360 Infinity 超高壓高效液相色譜儀（配有可變波長紫外檢測器和Inert SustainRC18 色譜柱）， 中國安捷倫科技有限公司；iS50 FT-IR 紅外光譜儀，中國賽默飛世爾科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 紅毛藻多糖的提取及純化 預(yù)處理： 紅毛藻藻體洗凈，烘干，經(jīng)粉碎后過100 目篩網(wǎng)得到藻粉。 準(zhǔn)確稱取50 g 干燥藻粉，加入300 mL 甲醇，攪拌后浸泡過夜以除去醇溶性色素和雜質(zhì)， 反復(fù)抽提3 次后，烘干備用。

多糖提取[18]：稱取50 g 上述預(yù)處理后的干燥藻粉加入1 L 超純水，置于電熱磁力攪拌器上，攪拌轉(zhuǎn)速200 r/min，于95 ℃進(jìn)行熱水抽提2 h，離心（4 000 g，20 min），收集上清液，殘渣中再加入1 L超純水，繼續(xù)提取2 h，離心，合并2 次提取的上清液， 減壓蒸發(fā)濃縮至300～400 mL。 用體積分?jǐn)?shù)75%乙醇沉淀粗多糖，4 ℃靜置過夜后， 離心（8 000 g，20 min），收集沉淀。收集的沉淀用少量超純水復(fù)溶，置于3 500 u 分子質(zhì)量截留的透析袋中，超純水透析48 h。收集透析袋中溶液并冷凍干燥以獲得紅毛藻粗多糖。

多糖純化：采用Sevage 法[14]除去粗多糖中的蛋白質(zhì)， 去除蛋白質(zhì)后多糖采用上述體積分?jǐn)?shù)75%乙醇沉淀法回收，經(jīng)透析、冷凍干燥后備用。將去除蛋白質(zhì)的多糖配制成多糖溶液（5 mg/mL），上Dowex 50W×8 陽離子交換柱層析（26 mm I.D.× 200 mm），用超純水進(jìn)行洗脫，并采用苯酚-硫酸法[19]在490 nm 下的吸光值（OD490）來檢測洗脫液中多糖含量，收集含有多糖的洗脫液，調(diào)節(jié)pH至7.0，經(jīng)48 h 超純水透析、冷凍干燥后備用。 將經(jīng)陽離子交換柱層析后的多糖用0.1 mol/L NaCl制成5 mg/mL 多糖溶液，經(jīng)0.22 m 的濾膜過濾后，上Sephadex G75 凝膠過濾柱層析（16 mm I.D.×1 000 mm），用0.1 mol/L NaCl 溶液進(jìn)行洗脫，控制流速為0.2 mL/min， 利用色譜樣品自動收集器連續(xù)收集40 管，每管5 mL，并采用苯酚-硫酸法在490 nm 下的吸光值（OD490）來檢測每管多糖含量，以洗脫體積為橫坐標(biāo)，OD490為縱坐標(biāo)作圖， 繪制洗脫曲線。 收集處于洗脫峰處管中的洗脫液，經(jīng)48 h 超純水透析、 冷凍干燥后， 獲得紅毛藻多糖（B. fusco-purpure polysaccharide，BFP）。

1.3.2 紅毛藻多糖的分級分離 將BFP 溶于超純水制成5 mg/mL 的多糖溶液， 經(jīng)0.22 μm 的濾膜過濾后， 取3 mL 上樣于DEAE-cellulose 52 離子交換色譜柱（26 mm I.D. × 200 mm），分別選取不同濃度（0，0.1，0.3，0.5 和1.0 mol/L）的NaCl 溶液對BFP 進(jìn)行梯度洗脫。 按每管10 mL 進(jìn)行收集， 采用苯酚-硫酸法檢測每管中多糖的含量，于490 nm 處測定吸光值（OD490）。 以O(shè)D490對洗脫體積作圖，繪制曲線。 經(jīng)多次重復(fù)后，收集相同出峰位置的多糖組分，超純水透析48 h 后，冷凍干燥，獲得紅毛藻多糖組分。

1.3.3 多糖的化學(xué)組成分析 采用苯酚-硫酸法，以葡萄糖為標(biāo)準(zhǔn)品，測定總糖含量；采用BCA法[20]，以BSA 為標(biāo)準(zhǔn)品，測定蛋白質(zhì)含量；采用氯化鋇明膠比濁法[21]，以K2SO4為標(biāo)準(zhǔn)樣品，測定硫酸根含量；采用咔唑-硫酸法[22]，以葡萄糖醛酸為標(biāo)準(zhǔn)品，測定糖醛酸含量；采用Folin-酚試劑法[23]，以沒食子酸作為標(biāo)準(zhǔn)品，定量檢測多酚的含量。

1.3.4 多糖平均分子質(zhì)量的測定 使用凝膠色譜法[24]測定BFP 及各多糖組分的平均分子質(zhì)量。 將100 μL 的多糖樣品溶液（5 mg/mL），用0.22 μm 濾膜過濾除雜后，上樣于制備型液相色譜儀（AKTApurify）， 檢測柱為Superdex 75 10/300 GL （10 mm I.D. × 400 mm）。 在室溫條件下用0.1 mol/L的NaCl 溶液進(jìn)行洗脫， 洗脫流速為0.5 mL/min。利用苯酚-硫酸法檢測收集的洗脫液中多糖的含量， 根據(jù)洗脫體積和各管吸光度值繪制出洗脫曲線。 以分子質(zhì)量為5，12，25 和50 ku 的葡聚糖作為標(biāo)準(zhǔn)品， 多糖樣品用上述同樣方法并結(jié)合分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)曲線計算多糖的平均分子質(zhì)量。

1.3.5 紅毛藻多糖的單糖組成分析 多糖的水解：取4 mg 的多糖，加入2 mL 2 mol/L 的三氟乙酸，密封，100 ℃水解3 h，60 ℃烘干除去三氟乙酸溶液， 殘余物中加入4 mL 正丁醇， 渦旋振蕩2 min，60 ℃烘干后再加入正丁醇，混勻烘干，如此反復(fù)2～3 次，以徹底除凈三氟乙酸，殘余物用1 mL的蒸餾水溶解，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

單糖組成分析：采用柱前PMP 衍生法[25-26]衍生單糖標(biāo)準(zhǔn)品和多糖的水解產(chǎn)物。 配制一定濃度的Man，Xyl，Glc，Gal，Ara 和Fuc 的單糖標(biāo)準(zhǔn)溶液和混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。 各標(biāo)準(zhǔn)溶液分別取50 μL 置于具塞試管中， 各加50 μL 0.6 mol/L 的NaOH 溶液，漩渦混勻；再加100 μL 0.5 mol/L 的PMP 甲醇溶液， 漩渦混勻后置于70 ℃的烘箱中避光反應(yīng)100 min，取出避光放置，冷卻至室溫，加50 μL 0.3 mol/L 的HCl 溶液， 用超純水補充至2 mL，再加2 mL 的三氯甲烷，漩渦混勻，靜置，棄去三氯甲烷相后重新加2 mL 三氯甲烷，如此萃取3 次。 將水相用0.22 μm 微孔膜過濾后， 用HPLC 進(jìn)行分析。 多糖水解樣品以上述同樣的方法進(jìn)行處理并分析。

1.3.6 紅毛藻多糖的紅外分析 將多糖樣品烘干至恒重后，與KBr 粉末充分混合、研磨均勻，壓片后使用is50 FT-IR 紅外光譜儀在4 000～400 cm-1范圍內(nèi)掃描，記錄多糖樣品的譜圖。

1.3.7 細(xì)胞培養(yǎng) 小鼠巨噬細(xì)胞系RAW264.7 采用含10% FBS、100 U/mL 青霉素及100 μg/mL 鏈霉素的高糖DMEM 培養(yǎng)基， 于37 ℃、5% CO2的CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。 在試驗過程中對培養(yǎng)細(xì)胞進(jìn)行分組，如下：

陰性對照組（Control）：不含LPS 和多糖；陽性對照組：以2 ng/mL 的LPS 處理；樣品組（Sample）：不同質(zhì)量濃度（0～100 μg/mL）的BFP，各組分（F1、F2、F3）溶液；空白組（Blank）：DMEM 生長培養(yǎng)基。

1.3.8 細(xì)胞活力分析 通過MTT 法[27]來測定多糖樣品對RAW264.7 細(xì)胞活力的影響。 將處于對數(shù)生長時期的RAW264.7 細(xì)胞以3×104細(xì)胞/孔的濃度接種于96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板， 于37 ℃、5% CO2的CO2培養(yǎng)箱中孵育24 h 后， 用不同質(zhì)量濃度的各多糖樣品溶液（0～100 μg/mL）孵育24 h，除去上清后，每孔加入終質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%的MTT 溶液，繼續(xù)孵育30 min，移去上清后，加入100 μL DMSO，振蕩20 min， 于細(xì)胞成像多功能檢測系統(tǒng)測量570 nm 處吸光值（OD570）。采用以下公式計算計算細(xì)胞活力。

1.3.9 多糖誘導(dǎo)RAW264.7 細(xì)胞活化釋放免疫因子NO、TNF-α 和ROS 的測定

1.3.9.1 NO 測定 通過Griess 法測定RAW264.7細(xì)胞釋放NO[28]。 參照1.3.8 節(jié)方法將細(xì)胞接種于細(xì)胞培養(yǎng)板中。 經(jīng)過夜培養(yǎng)后， 分別向貼壁的RAW264.7 細(xì)胞中加入100 μL 不同質(zhì)量濃度 （0～100 μg/mL）的多糖樣品溶液，設(shè)置空白對照和陽性對照組， 并以0 μg/mL 質(zhì)量濃度的多糖處理組為陰性對照， 多糖樣品溶液每個濃度和各對照組均做3～5 個平行，于37 ℃、5% CO2的條件下培養(yǎng)24 h 后，每孔取出50 μL 培養(yǎng)上清液置于新的96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，然后向上清液中加入100 μL 的Griess 試劑 （含3 mmol/L 磺胺酸，30 mg/L N-1-（萘基）乙二胺二鹽酸鹽， 質(zhì)量分?jǐn)?shù)25%的冰醋酸），室溫避光孵育20 min 后，檢測540 nm 下的吸光值（OD540）。 同時，用不同濃度的NaNO2標(biāo)準(zhǔn)溶液繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算培養(yǎng)上清液中NO 濃度。

1.3.9.2 TNF-α 測定 采用ELISA 測定RAW264.7細(xì)胞分泌的TNF-α[3]。 細(xì)胞接種方法參照1.3.8 節(jié)中方法，用不同質(zhì)量濃度（0～100 μg/mL）的多糖樣品溶液在37 ℃、5% CO2的條件下處理培養(yǎng)板中貼壁的RAW264.7 細(xì)胞24 h 后，每孔取出4 μL 培養(yǎng)上清液用含有4% BSA 的PBS 溶液稀釋50倍，然后，根據(jù)Mouse TNF-α Colorimetric ELISA kit 說明手冊所示的操作步驟對稀釋后培養(yǎng)上清中TNF-α 進(jìn)行定量測定。 同時，利用不同濃度的TNF-α 標(biāo)準(zhǔn)溶液繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線， 計算培養(yǎng)上清液中TNF-α 的含量。

1.3.9.3 ROS 測定 多糖誘導(dǎo)RAW264.7 細(xì)胞產(chǎn)生ROS 采用NBT 還原法檢測[29-30]。 將RAW264.7細(xì)胞接種于24 孔細(xì)胞培養(yǎng)板（5×106細(xì)胞/孔）中。經(jīng)貼壁培養(yǎng)后， 用含Ca2+和Mg2+的Hank’s Balanced Salt Solution （HBSS）輕輕沖洗貼壁細(xì)胞2次，分別向每孔加入450μL 的不同質(zhì)量濃度（0～100 μg/mL）的多糖樣品溶液在37 ℃、5% CO2的條件下誘導(dǎo)RAW264.7 細(xì)胞。10 min 后，每孔加入NBT 溶液（質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.25%）。 經(jīng)1 h 繼續(xù)培養(yǎng)，用HBSS 輕輕洗去每孔過量NBT 溶液， 加入600 μL 的DMSO 充分溶解細(xì)胞中的甲瓚，再加入700 μL 的2 mol/L KOH 溶液混勻顯色， 檢測630 nm波長下的吸光值（OD630）。

1.3.10 多糖誘導(dǎo)RAW264.7 細(xì)胞釋放NO 及分泌TNF-α 信號通路分析[31]將RAW264.7 細(xì)胞接種于96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中， 細(xì)胞接種參照1.3.8 節(jié)中方法。 分別用50μL 的含U0126（ERK）、SB203580（P38）、SP600125（JNK）和PDTC（NF-κB）不同細(xì)胞信號通路抑制劑的DMEM 生長培養(yǎng)基預(yù)處理貼壁的RAW264.7 細(xì)胞1 h， 抑制劑終濃度為20 μmol/L，然后加入50 μL 的多糖樣品溶液（質(zhì)量濃度為20 μg/mL），設(shè)置只用多糖樣品處理的陽性對照組、 不加多糖樣品陰性對照組和只用各抑制劑處理的空白對照組，每組設(shè)置3～5 個平行試驗。將加樣后的細(xì)胞置于37 ℃、5.0% CO2的條件下培養(yǎng)24 h，取培養(yǎng)上清分別按照1.3.9 節(jié)中Giress 法和ELISA 法測定培養(yǎng)上清中RAW264.7 細(xì)胞釋放出NO 和分泌出TNF-α 的含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 多糖的分離純化

紅毛藻粗多糖采用Sevage 法脫除蛋白質(zhì)后，經(jīng)過陽離子交換柱層析初步純化后， 上樣Sephadex G75 凝膠柱層析，用濃度為0.1 mol/L 的NaCl 溶液進(jìn)行洗脫，結(jié)果如圖1a 所示，紅毛藻粗多糖的洗脫曲線得到單一對稱峰，命名為BFP；將多糖BFP 上樣于DEAE-cellulose 52 層析柱，用不同濃度的NaCl 溶液進(jìn)行梯度洗脫， 結(jié)果如圖1b 所示。 當(dāng)NaCl 溶液濃度為0.1，0.3，0.5 mol/L時，各有一個洗脫峰出現(xiàn)，收集各洗脫峰溶液，分別命名為F1、F2 和F3。

2.2 紅毛藻多糖的基本組成結(jié)果

由表1 可知， 與標(biāo)準(zhǔn)單糖出峰的保留時間相比較， 多糖BFP 及多糖組分F1、F2 和F3 均為雜多糖。 Jiang 等[15]報道表明BFP 的單糖組成主要為Gal、Man、Glc 和糖醛酸， 并含有少量Fuc、Xyl 和Ara，其物質(zhì)的量比為11.23∶1.02∶1.00∶2.36∶0.34∶0.35∶0.16 （Glc 的物質(zhì)的量為1.00）。 本研究表明F1 主要由Gal、Man、Glc、糖醛酸、Ara 和Fuc 組成， 其物質(zhì)的 量比為1.43 ∶0.62 ∶1.00 ∶0.31 ∶0.51 ∶0.50；F2 主要由Gal、Man、Glc、糖醛酸和Ara 組成，其物質(zhì)的量比為1.14∶1.38∶1.00∶0.37∶1.12；F3的主要單糖組成為Man、Glc 和Ara， 并含有少量的糖醛酸和Gal，其物質(zhì)的量比為0.53∶1.99∶1.00∶2.92∶1.06。BFP、F1、F2 和F3 中硫酸根含量分別為10.34%，2.73%，3.09%和2.20%， 含有少量蛋白質(zhì)（分別占0.31%，0.14%，0.15%和2.19%）， 且?guī)缀醪缓喾印Ｆ骄肿淤|(zhì)量分析結(jié)果表明，多糖BFP分子質(zhì)量為43.16 ku，而組分F1、F2 和F3 分子質(zhì)量分別為2.07，32.07 和28.32 ku。

圖1 紅毛藻多糖Sephadex G75 凝膠過濾層析洗脫曲線圖（a）和DEAE-cellulose 52陰離子交換柱層析洗脫曲線圖（b）Fig.1 Elution profile of polysaccharide isolated from B. fusco-purpureaon on a Sephadex G75 gel permeation chromatography （a）and gradient elution profile of BFP on a DEAE-cellulose 52 anion exchange chromatography（b）

表1 BFP、F1、F2 和F3 的單糖、硫酸基團(tuán)組成和分子質(zhì)量Table 1 Monosaccharide compositions， sulfate group compositions and molecular mass of BFP， F1， F2 and F3

2.3 BFP、F1、F2 和F3 的紅外光譜學(xué)特征

由圖2 可得，在3 400 cm-1處的寬強峰是分子內(nèi)O-H 的伸縮振動的吸收峰，由于分子內(nèi)羥基間形成氫鍵而使吸收峰變寬[32]；在3 000～2 800 cm-1區(qū)較弱的吸收峰和1 400～1 200 cm-1區(qū)較寬的吸收峰是C-H 伸縮振動吸收和變角振動吸收，這兩個區(qū)域的吸收峰是糖類的特征吸收峰[33]；1 230 cm-1處是硫酸基中S=O 的伸縮振動吸收[34-35]，BFP、F1、F2 在此吸收峰較強， 說明F1、F2 含較多的硫酸根，F(xiàn)3 硫酸根含量較低， 這與上述化學(xué)分析的結(jié)果一致；1 200～1 000 cm-1間的強吸收峰是由兩種C-O 伸縮振動所引起的， 一種屬于C-O-H，另一種是糖環(huán)C-O-C[36]；沒有930 cm-1處的吸收峰， 提示BFP、F1、F2 和F3 不含或很少含有3，6-內(nèi)醚-L-半乳糖[37]。 892 cm-1處的弱帶則表明存在α-糖苷鍵[38]。 在820 cm-1處的吸收峰可能是由D-半乳糖的C-6 位的硫酸根基團(tuán)引起的[34]。 F1、F2、F3 在1 740 cm-1處吸收峰較弱表明含少量糖醛酸，BFP 有較強峰表明糖醛酸含量較高[38]。 在1 633 cm-1和1 644 cm-1處的獨特吸光度強烈表明BFP、F1、F2 和F3 中的羧基[39]。

2.4 紅毛藻多糖對RAW264.7 細(xì)胞活力的影響

由圖3 可知， 在本文所設(shè)定的多糖質(zhì)量濃度（0～100 μg/mL）和作用時間（24 h）范圍內(nèi)，BFP、F1、F2 和F3 對細(xì)胞活力沒有顯著的影響。

圖2 BFP、F1、F2 和F3 的紅外光譜圖Fig.2 FT-IR spectra characteristics of BFP， F1，F(xiàn)2 and F3

2.5 紅毛藻多糖誘導(dǎo)RAW264.7 細(xì)胞活化釋放免疫因子NO、TNF-α 和ROS 的結(jié)果

多糖樣品誘導(dǎo)細(xì)胞釋放的NO 溶于細(xì)胞培養(yǎng)上清液形成NO2-， 以細(xì)胞上清液中NO2-濃度表示樣品誘導(dǎo)細(xì)胞釋放NO 的活性，其結(jié)果如圖4a 所示： 多糖BFP、F1、F2、F3 在所測定質(zhì)量濃度 （0～100 μg/mL）范圍內(nèi)顯著誘導(dǎo)RAW264.7 細(xì)胞活化釋放NO，與陰性對照組相比差異極顯著（P<0.01），且BFP、F1、F2、F3 誘導(dǎo)RAW264.7 細(xì)胞釋放NO 能力在多糖質(zhì)量濃度為0～12.5 μg/mL 范圍內(nèi)呈現(xiàn)濃度依賴性， 隨著多糖質(zhì)量濃度的升高而增加； 當(dāng)多糖質(zhì)量濃度為0～6.25 μg/mL 時，BFP、F1、F2、F3 誘導(dǎo)細(xì)胞釋放NO 的量開始呈現(xiàn)出F2＞F1＞F3＞BFP 的差異；當(dāng)多糖質(zhì)量濃度為12.5～100 μg/mL 時，BFP、F1、F2、F3 誘導(dǎo)細(xì)胞釋放NO量趨于平穩(wěn)，不呈現(xiàn)多糖質(zhì)量濃度依賴性。

圖4b 表明，多糖BFP、F1、F2、F3 在所測定質(zhì)量濃度（0～100 μg/mL）范圍內(nèi)顯著誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞活化分泌TNF-α， 其活性呈現(xiàn)多糖質(zhì)量濃度依賴性；多糖組分F1 和F2 誘導(dǎo)細(xì)胞分泌TNF-α的量與陰性對照組相比差異極顯著 （P<0.01）；多糖BFP 和組分F3 在質(zhì)量濃度為25～100 μg/mL時，其誘導(dǎo)細(xì)胞分泌TNF-α 的量與陰性對照組相比，存在極顯著差異性（P<0.01），而BFP 和F3 的質(zhì)量濃度為12.5 μg/mL 時， 其誘導(dǎo)RAW264.7 細(xì)胞分泌TNF-α 活性與陰性對照組相比差異顯著（P<0.05），當(dāng)多糖質(zhì)量濃度為0～6.25 μg/mL 時，無顯著差異。

圖3 BFP、F1、F2 和F3 對RAW264.7 細(xì)胞活性的影響Fig.3 Effects of BFP， F1， F2 and F3 at different concentrations on the viabilities of RAW264.7 cells

紅毛藻多糖誘導(dǎo)RAW264.7 細(xì)胞活化產(chǎn)生ROS 的結(jié)果是通過溶解其胞內(nèi)的甲瓚， 并以在630 nm 處的吸光值OD630來表示， 其結(jié)果如圖4c所示。 多糖質(zhì)量濃度為0～100 μg/mL 的范圍內(nèi)，BFP、F1、F2 和F3對細(xì)胞產(chǎn)生ROS沒有顯著影響， 表明BFP、F1、F2 和F3 在所測定質(zhì)量濃度范圍內(nèi)沒有誘導(dǎo)RAW264.7 細(xì)胞產(chǎn)生ROS 的活性。

2.6 不同信號通道抑制劑對紅毛藻多糖誘導(dǎo)RAW264.7 細(xì)胞活化釋放NO 和分泌TNF-α的影響

MAPK 信號通路和NF-κB 信號通路在巨噬細(xì)胞活化釋放NO 和分泌TNF-α過程中起重要作用[40-41]。 為闡明MAPK 和NF-κB 信號傳導(dǎo)通路是否參與紅毛藻多糖誘導(dǎo)RAW264.7 細(xì)胞活化釋放NO 和分泌TNF-α，本文利用ERK MAPK （U0126）、JNKMAPK（SP600125）、p38 MAPK（SB203580）的3 種經(jīng)典MAPK 信號通路特異性抑制劑和NF-κB信號通路特異性抑制劑PDTC 分別預(yù)處理細(xì)胞，阻斷相應(yīng)信號通路， 來分析參與紅毛藻多糖誘導(dǎo)RAW264.7 細(xì)胞活化釋放NO 和分泌TNF-α 的相關(guān)細(xì)胞信號通路。 抑制劑對BFP、F1、F2 和F3 誘導(dǎo)細(xì)胞活化釋放NO 和分泌TNF-α 的結(jié)果如表2和表3 所示。 抑制劑SP600125 和PDTC 均顯著抑制BFP、F1、F2 和F3 誘導(dǎo)細(xì)胞活化釋放NO，而抑制劑U0126 只顯著抑制 BFP 誘導(dǎo)細(xì)胞活化釋放NO （表1）。 抑制劑SP600125 和U0126 均顯著抑制BFP、F1、F2 和F3 誘導(dǎo)細(xì)胞活化分泌TNF-α。抑制劑SB203580 只顯著抑制BFP 和F1 誘導(dǎo)細(xì)胞活化分泌TNF-α，而PDTC 對F1 誘導(dǎo)細(xì)胞活化分泌TNF-α 無明顯的抑制作用（表2）。 以上結(jié)果表明，BFP 主要通過誘導(dǎo)RAW264.7 細(xì)胞中NFκB、JNK MAPK 和ERK MAPK 信號通路活化釋放NO，而誘導(dǎo)NF-κB、ERK MAPK 和p38 MAPK 信號通路活化分泌TNF-α；F1 主要通過誘導(dǎo)細(xì)胞中的NF-κB、和JNK MAPK 信號通路活化使細(xì)胞釋放NO，通過誘導(dǎo)JNK、ERK 和p38 MAPK 信號通路活化分泌TNF-α；F2 和F3 作用機制相似，主要通過激活細(xì)胞的NF-κB 和JNK MAPK 信號通路使細(xì)胞釋放NO， 并通過誘導(dǎo)細(xì)胞中NF-κB、JNK MAPK 和ERK MAPK 信號通路活化分泌TNF-α。

圖4 不同質(zhì)量濃度（0～100 μg/mL）的BFP、F1、F2 和F3 誘導(dǎo)RAW264.7 細(xì)胞活化產(chǎn)生NO （a）、TNF-α （b）和ROS （c）的水平Fig.4 NO （a）， TNF-α （b）and ROS （c）levels in RAW264.7 cells induced by various concentration （0～100 μg/mL）of BFP， F1， F2 and F3

表2 抑制劑對BFP、F1、F2 和F3 誘導(dǎo)RAW264.7 細(xì)胞產(chǎn)生NO 的影響aTable 2 Effects of inhibitors on the BFP， F1， F2 and F3 induced NO production from RAW264.7 cellsa

表3 抑制劑對BFP、F1、F2 和F3 誘導(dǎo)RAW264.7 細(xì)胞產(chǎn)生TNF-α 的影響aTable 3 Effects of inhibitors on the BFP， F1， F2 and F3 induced TNF-α production from RAW264.7 cellsa

3 結(jié)論

從紅毛藻中提取多糖BFP 經(jīng)陽離子交換柱層析、 再經(jīng)Sephadex G75 凝膠過濾柱層析和DEAE-cellulose 52 陰離子交換柱分離純化得到3個多糖組分：F1、F2 和F3。多糖組成分析結(jié)果表明BFP、F1、F2 和F3 均為雜多糖且單糖組成存在較大差異（表1）。 分子質(zhì)量分析結(jié)果表明，4 個片段分子質(zhì)量相差較大， 其中BFP 分子質(zhì)量為43.16 ku，而F1、F2 和F3 片段分子質(zhì)量分別為2.07，32.07和28.32 ku。 活性研究結(jié)果表明BFP、F1、F2 和F3均能夠顯著誘導(dǎo)RAW264.7 細(xì)胞活化釋放NO 和分泌TNF-α，并且組分F1 和F2 的活性顯著高于多糖BFP 和F3， 說明F1 和F2 是BFP 中具有免疫誘導(dǎo)活性的主要活性組分。 通過進(jìn)一步分析多糖誘導(dǎo)細(xì)胞活化的胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路， 推測紅毛藻多糖BFP 共同通過誘導(dǎo)NF-κB 和ERK MAPK信號通路使RAW264.7 細(xì)胞活化釋放NO 和分泌TNF-α，BFP 通過分別激活細(xì)胞中JNK 和p38 MAPK 釋放NO 和分泌TNF-α；F1 主要通過JNK MAPK 信號通路活化RAW264.7 細(xì)胞釋放NO 和分泌TNF-α，F(xiàn)1 通過分別誘導(dǎo)細(xì)胞中NF-κB 和ERK、p38 MAPK 活化釋放NO 和分泌TNF-α；F2和F3 主要通過NF-κB 和JNK MAPK 信號通路誘導(dǎo)細(xì)胞活化釋放NO， 并通過NF-κB、JNK MAPK 和ERK MAPK 信號通路誘導(dǎo)細(xì)胞活化分泌TNF-α。