郭茹，孫世海，葉霞，華仁銳

（天津農(nóng)學院園藝園林學院，天津300384）

藍莓，又稱越桔或藍漿果，屬于杜鵑花科（Ericaceae）越桔屬（Vaccinium）植物，多年生落葉或常綠灌木。全世界約400 個種，廣泛分布于北半球，以北美資源最為豐富。中國藍莓栽培起步較晚，自20 世紀80 年代初，有關單位先后從國外引進100 多個藍莓品種，并進行了栽培和育苗研究[1]。藍莓果中含有花色素苷、黃酮等多種多酚類生理活性物成分，聯(lián)合國糧農(nóng)組織將藍莓列為人類五大健康食品之一，同時被認為是21 世紀最有發(fā)展前途的新型高檔果樹樹種[2-3]。藍莓的常規(guī)繁殖方法較多，有種子育苗、綠枝扦插、硬枝扦插、根插和分株嫁接等，但繁殖系數(shù)低，生長速度慢，品種易退化[4-6]。利用組織培養(yǎng)的方法可以在短期內(nèi)大大提高繁殖系數(shù)，縮短繁殖時間，并且可以保持品種的優(yōu)良特性，現(xiàn)己成為近年來眾多學者研究的熱點之一[7-10]。多數(shù)研究者認為，玉米素（ZT）是促進越橘屬植物離體快繁的最佳外源調(diào)節(jié)劑，比如蔓越橘、矮叢藍莓、越橘加入ZT 后其離體繁育的增殖效果明顯[11-12]。關于不同類型的支撐物在組培中的應用效果研究鮮少報道，國內(nèi)有柴慈江[13-15]研究，以土壤作為支撐物，進行葡萄、珠美海棠以及栒子的生根培養(yǎng)。為了進一步研究提高生產(chǎn)效率，并降低生產(chǎn)成本，該試驗通過探索不同支撐物、不同營養(yǎng)液濃度以及ZT 濃度對藍莓試管苗靜置培養(yǎng)增殖的影響，從而獲得適合藍莓試管苗增殖生長的最適培養(yǎng)條件，推動試管苗的大規(guī)模生產(chǎn)。

斯巴坦（Spartan）作為北高叢藍莓的一種早熟品種，1978 年由美國農(nóng)業(yè)部選育，由‘Earlyblue’בUS11-93’雜交育成。早產(chǎn)豐產(chǎn)、品質(zhì)優(yōu)良，極具栽培潛力。該研究以斯巴坦試管苗的莖段為外植體，對斯巴坦在不同增殖培養(yǎng)基上培養(yǎng)后的芽數(shù)、芽高、增殖系數(shù)、年繁殖數(shù)進行測定計算，觀察藍莓斯巴坦不同培養(yǎng)的生長特性，篩選出藍莓斯巴坦的最佳增殖培養(yǎng)基，為藍莓斯巴坦進一步大規(guī)模生產(chǎn)提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試品種取自天津農(nóng)學院園藝植物組織培養(yǎng)實驗室盆栽的藍莓斯巴坦品種，取外植體進行初代培養(yǎng)，并且連續(xù)繼代培養(yǎng)3 次后，保證組培苗的健壯。取組培苗高3.0±0.5 cm 且長勢一致的藍莓斯巴坦繼代組培苗為增殖的接種材料。蛭石、珍珠巖均購自朝日物產(chǎn)（天津）園藝科技股份有限公司，其中珍珠巖用自來水淘洗3 遍后烘干備用。

1.2 試驗方法

1.2.1 初代培養(yǎng)。供試藍莓品種為斯巴坦，在春季藍莓新枝生長旺盛時期的晴天上午選取當年生健壯的半木質(zhì)化嫩枝，去除葉片，在流水下沖洗3～5 min，剪去頂端最嫩莖節(jié)。置超凈工作臺上，將其剪成2 cm 左右的帶單芽的莖段，用75%的酒精消毒15 s 后，無菌水蕩洗3 次，再用0.1%升汞溶液消毒7 min，無菌水蕩洗5 次，每次30 s，備用。

1.2.2 增殖培養(yǎng)。將組培苗接入到不同的培養(yǎng)基中，即3因素3 水平正交試驗[L9（33）]設計的誘導增殖培養(yǎng)基見表1。藍莓斯巴坦增殖培養(yǎng)基成分見表2。試驗設9 個處理，每個處理接種20 瓶，每瓶接入3 株，共計60 株。培養(yǎng)基pH 5.2±0.1。培養(yǎng)40 d 后統(tǒng)計植株長勢、株高、增殖系數(shù)、年繁殖數(shù)。

表1 L9（33）因素及水平

表2 增殖培養(yǎng)基成分

計算公式：增殖系數(shù)=培養(yǎng)后總芽數(shù)/接種時總芽數(shù)×100%；

年繁殖數(shù)=m·Xn

其中，m：無菌母株苗數(shù)；X：平均每個培養(yǎng)周期的增殖系數(shù)；n：每年可增殖的周期次數(shù)。

使用100 mL 廣口的培養(yǎng)瓶，以瓊脂為支撐物的培養(yǎng)基分別添加蔗糖20 g/L、瓊脂8 g/L；以蛭石、珍珠巖為支撐物的培養(yǎng)基，蛭石、珍珠巖的用量每瓶均為8 g，再加入營養(yǎng)液40 mL，各處理支撐物及相應營養(yǎng)液分裝后，置于高壓蒸汽滅菌鍋中121℃下滅菌20 min。

1.2.3 培養(yǎng)條件。將培養(yǎng)瓶放入培養(yǎng)室內(nèi)，培養(yǎng)溫度為23±2℃，光照強度為2000 lx，光照時間為12 h。

1.3 數(shù)據(jù)分析

采用Microsoft Excel 完成對數(shù)據(jù)的基本處理，采用SPSS17.0 軟件進行數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同處理藍莓試管苗增殖的生長狀況

選取生長健壯且大小一致的藍莓試管苗接種于增殖培養(yǎng)基上，接種15 d 后觀察生長狀況，40 d 調(diào)查芽數(shù)、芽高及芽生長勢，并計算增殖系數(shù)和年繁殖數(shù)（40 d 為1 個周期，1 年繁殖9 次），不同處理結(jié)果詳見表3。

表3 不同處理藍莓組培苗增殖情況

在試驗中發(fā)現(xiàn)，藍莓斯巴坦的增殖隨著不同的處理表現(xiàn)出不同的差異。接種15 d 后，處理4 和處理5 大部分在節(jié)間處形成芽，且處理4 的葉片大而綠，芽粗壯。處理1 和處理2 只有少部分在節(jié)間處形成芽，芽小且葉片呈淡綠色。接種40 d 后，對其增殖系數(shù)、平均芽高和年增殖數(shù)進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析，調(diào)查藍莓斯巴坦組培苗在9 個不同處理中的增殖情況。由表3 可知，處理4 增殖系數(shù)最高，為5.14，采用這一技術，理論上1 株試管苗1 年可以生產(chǎn)藍莓組培苗約為2505733.52 株，明顯超過其他處理。結(jié)合藍莓幼苗的生長狀況，較優(yōu)的處理是處理1、處理2、處理4 和處理5。根據(jù)正交試驗結(jié)果，分別對各處理的增殖系數(shù)和平均芽高進行極差分析（表4）。

2.2 不同因素對藍莓試管苗增殖影響的極差分析

不同因素對藍莓叢生芽增殖影響的極差分析如表4所示。根據(jù)各因素的極差值來分析其對藍莓斯巴坦組培苗增殖的影響程度，R 值越大說明影響越顯著。

由表4 可知，各因素對藍莓斯巴坦試管苗增殖情況的影響大小不同，且影響的規(guī)律也不相同。支撐物、營養(yǎng)液、ZT 濃度3 個因素對增殖系數(shù)的影響大小順序為支撐物＞ZT 濃度＞營養(yǎng)液濃度，支撐物對藍莓斯巴坦增殖效果的影響最大，而營養(yǎng)液濃度的影響最小；對平均芽高影響大小順序為支撐物＞營養(yǎng)液濃度＞ZT 濃度，支撐物對藍莓斯巴坦增殖效果的影響最大，而ZT 濃度的影響最小。

表4 不同因素對藍莓試管苗增殖影響的極差分析

2.3 不同因素對藍莓試管苗增殖影響的方差分析

不同因素對藍莓斯巴坦叢生芽增殖的影響方差分析如表5 所示。由表5 可知，支撐物、培養(yǎng)物和ZT 濃度3 個因素對增殖系數(shù)和平均芽高的影響均達到了顯著差異。因此需要對支撐物、培養(yǎng)物和ZT 濃度各水平作進一步的多重比較分析。

表5 不同因素對藍莓試管苗增殖的影響方差分析

2.4 不同因素對藍莓試管苗增殖影響的多重比較

支撐物、培養(yǎng)基、ZT 濃度各水平增殖系數(shù)差異顯著。因而還需進行支撐物、培養(yǎng)基、ZT 濃度各水平增殖系數(shù)的多重比較。詳見表6～8。

由表6 可知，支撐物為珍珠巖處理的平均增殖系數(shù)最高達到3.5421，支撐物為瓊脂和支撐物為蛭石處理的差異不顯著，二者均與支撐物為珍珠巖處理差異顯著，其中，支撐物為蛭石處理的增殖系數(shù)最低，為1.5491；珍珠巖處理的平均芽高最大，為3.2600 cm，3 種不同支撐物處理的間的平均芽高均達到極顯著水平。

表6 支撐物各水平LSD 檢驗

由表7 可知，營養(yǎng)液WPM 處理的平均增殖系數(shù)最高，達到3.1716，其中WPM 處理與1/4WPM 處理差異極顯著，二者均與1/2WPM 處理差異顯著；WPM 處理的平均芽高最大，為2.7744 cm，與1/2WPM 處理的差異達顯著水平，與1/4WPM 處理的差異達到極顯著水平，1/2WPM 處理和1/4WPM 處理的差異也達到極顯著水平，1/4WPM 處理的平均芽高最低，為1.2267 cm。

表7 營養(yǎng)液濃度各水平LSD 檢驗

由表8 可知，1 mg/L ZT 處理的平均增殖系數(shù)和平均芽高均最大，分別為3.3194 和2.5489 cm，0.5 mg/L ZT處理與1.2 mg/L ZT 處理差異不顯著，二者均與1 mg/L ZT 處理差異顯著。綜合正交試驗和方差分析結(jié)果得知，營養(yǎng)液靜置培養(yǎng)增殖的最優(yōu)水平可設定為珍珠巖+WPM+1mg/LZT。

表8 ZT 濃度各水平LSD 檢驗

3 結(jié)論與討論

目前，部分藍莓的組培快繁體系已經(jīng)在MS、WPM、改良WPM 等基本培養(yǎng)基上成功建立。藍莓在WPM 培養(yǎng)基上有較高的增殖系數(shù)和株高。所以，該試驗研究不同倍數(shù)WPM 作為營養(yǎng)液的增殖效果。傳統(tǒng)組培用蔗糖作為支撐物起到固定作用，進行增殖培養(yǎng)，在藍莓組織培養(yǎng)過程中，細胞分裂素對芽的誘導和增殖起到至關重要的作用，其中ZT 是藍莓叢生芽誘導和增殖中使用最為廣泛的一種，且其用量在藍莓不同品種中也存在差異，所以值得進一步探究適合藍莓斯巴坦增殖的ZT 濃度。

試驗利用正交設計進行了極差和方差分析，比較了影響藍莓斯巴坦增殖的主要因素，以此篩選出藍莓斯巴坦增殖組織培養(yǎng)適宜的培養(yǎng)條件。在植物離體快繁中，支撐物、培養(yǎng)基以及ZT 濃度都會影響組培苗的生長和分化，其中支撐物對增殖系數(shù)和芽高的影響最大。該研究結(jié)果表明藍莓斯巴坦在以珍珠巖為支撐物時，長勢優(yōu)于以瓊脂為支撐物和以蛭石為支撐物。當支撐物相同時，以WPM 為營養(yǎng)液的處理效果最佳，增殖系數(shù)和芽高都好于其他2 個濃度。以瓊脂為支撐物，處理1 和處理2 芽數(shù)相對較多且較高；處理3 的平均芽數(shù)相對較少，葉片呈淡綠色。以珍珠巖為支撐物，處理4、處理5 的芽在高度上明顯高于其他處理，且葉片呈綠色；處理4 的增殖系數(shù)高達5.14，生長旺盛，分支多，植株粗壯，而且植株較高。以蛭石為支撐物，處理7、處理8 和處理9 的芽相對較矮，且數(shù)量少，但是葉片都呈綠色。通過試驗得到如下結(jié)論：藍莓最適叢生芽增殖的培養(yǎng)基為珍珠巖+WPM+1 mg/L ZT，對組培育苗技術的推廣應用具有重要意義。