楊 俊，胡 克，杜春玲，盧進昌，周 磊，湯繼英

(1.武漢大學人民醫(yī)院呼吸內科，湖北 武漢 430060； 2.復旦大學附屬中山醫(yī)院青浦分院呼吸內科，上海 201700； 3.湖北醫(yī)藥學院胚胎干細胞研究湖北省重點實驗室，湖北 十堰 442000)

放射性肺損傷為胸部惡性腫瘤放射治療常見并發(fā)癥之一，早期可致肺部充血、肺泡纖維蛋白滲出增多[1]。隨著放射劑量及放療時間的增加，最終可形成肺間質纖維化[2]。研究結果顯示，接受放療的非小細胞肺癌患者放射性肺損傷發(fā)生率約為20%，并隨放療劑量增加而明顯升高[3]。放射性肺損傷是影響胸部惡性腫瘤患者放療效果的重要因素之一[4]。因此，積極防治放射性肺損傷對惡性腫瘤患者治療的有效性具有重要意義。目前，放射性肺損傷發(fā)病機制尚未明確，大多認為與肺組織受照射后腫瘤壞死因子α(TNF-α)、白細胞介素6(IL-6)及白細胞介素1β(IL-1β)參與趨化炎癥反應導致肺組織異常損傷及修復有關[5]。高遷移率族蛋白B1(high mobility group protein B1，HMGB1)為重要炎癥介質，既可由活化后巨噬細胞和單核細胞主動分泌，又可由損傷壞死細胞被動釋放[6]。有研究結果發(fā)現(xiàn)，HMGB1可參與放射性肺損傷過程，與肺纖維化改變有關[7]。烏司他丁是一種具有抑制多種蛋白水解酶活力作用的糖蛋白，常用于治療胰腺炎[8]。烏司他丁可通過抑制HMGB1蛋白表達減輕急性肺損傷程度[9]。因此，本研究基于HMGB1信號通路，探討烏司他丁對早期放射性肺損傷的保護機制，希望為臨床防治放射性肺損傷提供更多參考。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

SD大鼠36只，雌性，SPF級，周齡為10周，體質量180～270 g，平均體質量(241.36±5.42) g，購置于南京君科生物工程有限公司，貨號J001。置于光暗周期12 h，室溫20～26 ℃，濕度40%～70%環(huán)境中適應性喂養(yǎng)1周，分籠喂養(yǎng)，自由飲食及飲水。本研究符合《實驗動物管理條例》相關規(guī)定，并通過醫(yī)學倫理委員會審核。根據(jù)干預方式的不同將大鼠分為正常對照組、放射性肺損傷組及烏司他丁組，每組12只。

1.2 主要試藥與儀器

10%水合氯醛溶液(上海信帆生物科技有限公司，貨號XFA1600)；注射用烏司他丁(廣東天普生化醫(yī)藥股份有限公司，批準文號為國藥準字H19990134，規(guī)格為10萬IU/瓶)；烏拉坦(美國Sigma公司，貨號U2500)；PBS溶液、中性甲醛固定液、蘇木素染色液、伊紅染色液、酸性乙醇分化液(0.5%)、氨水溶液(0.5%)、中性樹膠、全蛋白提取試劑盒、硝酸纖維素膜(0.45 μm)、5%BSA封閉液、ECL化學發(fā)光法檢測試劑盒(小鼠IgG)、麗春紅染色液(1×)、總RNA提取試劑盒及反轉錄試劑盒均購自北京索萊寶生物科技有限公司；快速瑞式-姬姆薩復合染液(上海鈺博生物科技有限公司)；HMGB1、晚期糖基化終末產物受體(RAGE)、核轉錄因子κB(NF-κB)、TNF-α、IL-6、IL-1β及甘油醛-3-磷酸脫氫酶(Glycer-aldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)一抗均購自美國Abcam公司；HRP標記羊抗兔二抗購自美國Abcam公司；氯化鈉注射液(四川科倫藥業(yè)股份有限公司，批準文號為國藥準字H51021157，規(guī)格為250 ml∶2.25 g)；腫瘤放療模擬定位機(德國西門子公司)；60Co-γ射線放射治療機(醫(yī)院放療科)；化學發(fā)光凝膠成像系統(tǒng)(美國Alpha公司)；紫外可見分光光度計(美國Thermo Fisher公司，型號GENESYS 180)。

1.3 放射性肺損傷大鼠模型構建與干預

適應性飼養(yǎng)大鼠1周后，以10%水合氯醛溶液腹腔注射，400 mg/kg，仰臥于處置板上充分暴露胸部，模擬機下定位；鉛塊遮擋左肺以及縱膈，正常對照組大鼠不進行照射，放射性肺損傷組和烏司他丁組大鼠以60Co-γ射線照射右肺，源皮距100 cm，照射視野2 cm×3 cm，照射總量30 Gy；照射完畢后，三組大鼠分籠喂養(yǎng)，自由飲食及飲水；照射后48 h，烏司他丁組大鼠給予注射用烏司他丁10 萬IU/kg，尾靜脈注射，給予正常對照組和放射性肺損傷組大鼠相同體積的氯化鈉注射液，尾靜脈注射；注射完畢后4 h，麻醉處死大鼠。

1.4 實驗取材

(1)肺支氣管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid，BALF)細胞涂片：腹腔注射烏拉坦1 g/kg；頸部正中切口分離氣管，環(huán)狀軟骨處作小切口，結扎左主支氣管，以氯化鈉注射液5 ml灌洗右肺，重復3次；離心處理棄上清液，加入PBS溶液重懸細胞制作細胞涂片。(2)肺組織：收集BALF后行開胸手術取右肺中葉組織，PBS溶液沖洗3次，裁剪為0.5 cm×2 mm組織塊，置于中性甲醛固定液中固定24 h，取出依次進行脫水、透明、浸蠟和包埋處理，將蠟塊置于切片機上，制成厚度為4 μm的連續(xù)切片。

1.5 肺組織形態(tài)學

采用蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin，HE)染色法。取大鼠肺組織切片，依次進行脫蠟、脫水處理后滴加蘇木素染色液染色5 min，PBS溶液沖洗；滴加酸性乙醇分化液分化，PBS溶液沖洗5 min；滴加氨水溶液反應30 s，PBS溶液沖洗2 min；滴加伊紅染色液染色2 min，依次進行脫水和透明處理，利用中性樹膠封片，顯微鏡(400×)下觀察染色結果。

1.6 BALF白細胞計數(shù)

采用瑞式-姬姆薩染色法。取大鼠BALF細胞涂片以快速瑞式-姬姆薩復合染液染色2 min，顯微鏡下觀察涂片體、尾交界處染色情況，隨機選取200個細胞進行細胞分類，中性粒細胞細胞質為粉紅色含紫紅色顆粒，嗜酸粒細胞含大量橘黃色顆粒，單核細胞質為灰藍色，淋巴細胞為淡藍色。

1.7 肺組織中HMGB1蛋白及下游基因蛋白表達

采用蛋白免疫印跡法。按照全蛋白提取試劑盒說明書操作，提取大鼠肺組織中總蛋白，并進行定性和定量分析；吸取40 μg蛋白樣品進行聚丙烯酰胺凝膠電泳，電泳至溴酚藍跑出，終止電泳進行轉膜；硝酸纖維素膜置于水上預處理2 h后將蛋白轉移至膜上，置于脫色搖床以麗春紅染色液染色5 min，自來水沖洗后將膜晾干；PBS溶液從下往上將膜浸濕后，移至含5%BSA封閉液的平皿中，室溫下置于脫色搖床封閉1 h；分別滴加一抗后，4 ℃過夜；滴加二抗，室溫孵育2 h；按照ECL化學發(fā)光法檢測試劑盒說明書操作，利用化學發(fā)光凝膠成像系統(tǒng)分析條帶并計算各蛋白表達量。

1.8 肺組織中HMGB1蛋白及下游基因mRNA表達

采用實時熒光定量聚合酶鏈式反應(quantitative real-time polymerase chain reaction，qRT-PCR)。按照總RNA提取試劑盒說明書操作，提取大鼠肺組織中RNA，利用紫外可見分光光度計測定260 nm和280 nm波長處吸光度，以A260/A280比值判定RNA純度，A260/A280比值介于1.8～2.0，提示樣品中RNA純度佳可進行下一步實驗。按照反轉錄試劑盒說明書操作，將RNA逆轉錄為cDNA；以GAPDH為內參基因，GAPDH上游引物為5′-AGGTCGGTGTGAACGGATT-3′，下游引物為5′-GGGGT CGTTGATGGCAACA-3′，HMGB1上游引物5′-GCTGACAAGGC TGCTTATG-3′，下游引物為5′-CCTTTGATTCGGGCCCTATC-3′，RAGE上游引物為5′-CTTG CTCTATGGGCAGCTAC-3′，下游引物為5′-ATTGCCTCGCACCGGAATTC-3′，NF-κB上游引物為5′-ATGGCAGAGGATCAGTCCTA-3′，下游引物為5′-CGGAATCGAA TAAGGCCCTT-3′，TNF-α上游引物為5′-CAGGCGGTGCC TATGTCGTC-3′，下游引物為5′-CAGGCGGTGCCTATGTCTCG-3′，IL-6上游引物為5′-CTGCAAGCAGACTTCCATCC-3′，下游引物為5′-AGTAGTATAGACAGGTCTGT-3′，IL-1β上游引物為5′-GCACGACTTGCTACGTTCAT-3′，下游引物為5′-CATGATCTT GGGGCTACTAT-3′；反應體系：SYBR Premix Ex Taq 10 μl、上游引物0.4 μl、下游引物 0.4 μl、ROX Reference Dye Ⅱ 0.4 μl、cDNA 2 μl、ddH2O 6.8 μl，總體積20 μl；反應條件：95 ℃ 5 min，1個循環(huán)，94 ℃ 30 s，55 ℃ 40 s，72 ℃ 1 min，35個循環(huán)，72 ℃ 10 min，1個循環(huán)；取10 μl擴增產物置于1%瓊脂糖凝膠中進行電泳，利用Image J軟件測定灰度值，以2-ΔΔCt表示各蛋白mRNA相對表達量。

1.9 統(tǒng)計學方法

2 結果

2.1 各組大鼠肺組織形態(tài)學

經射線照射處理2周后，正常對照組大鼠肺組織支氣管、黏膜下及肺間質中無炎癥細胞浸潤；放射性肺損傷組大鼠肺組織支氣管、黏膜下及肺間質中有大量炎癥細胞浸潤，肺間質增厚；與放射性肺損傷組比較，烏司他丁組大鼠肺組織支氣管、黏膜下及肺間質中炎癥細胞明顯減少，肺間質水腫明顯緩解，見圖1。

A.正常對照組；b.放射性肺損傷組；c.烏司他汀組A.normal control group; B.radiation-induced pulmonary injury group; C. ulinastatin group

2.2 各組大鼠BALF中白細胞種類計數(shù)比較

與正常對照組比較，放射性肺損傷組和烏司他丁組大鼠BALF中嗜酸性粒細胞、中性粒細胞、淋巴細胞及單核細胞比例升高，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；與放射性肺損傷組比較，烏司他丁組大鼠BALF中嗜酸性粒細胞、中性粒細胞、淋巴細胞及單核細胞比例降低，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見表1。

2.3 各組大鼠肺組織中HMGB1蛋白及下游基因蛋白表達

與正常對照組比較，放射性肺損傷組和烏司他丁組大鼠肺組織中HMGB1、RAGE、NF-κB、TNF-α、IL-6及IL-1β蛋白表達水平明顯升高，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；與放射性肺損傷組比較，烏司他丁組大鼠肺組織中HMGB1、RAGE、NF-κB、TNF-α、IL-6及IL-1β蛋白表達水平明顯降低，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見圖2。

表1 三組大鼠BALF中白細胞種類所占比例比較

注：與正常對照組比較，*P<0.05；與放射性肺損傷組比較，#P<0.05

Note:vs. normal control group，*P<0.05；vs. radiation-induced lung injury group，#P<0.05

2.4 各組大鼠肺組織中HMGB1及下游基因mRNA表達

與正常對照組比較，放射性肺損傷組和烏司他丁組大鼠肺組織中HMGB1、RAGE、NF-κB、TNF-α、IL-6及IL-1β mRNA表達水平明顯升高，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；與放射性肺損傷組比較，烏司他丁組大鼠肺組織中HMGB1、RAGE、NF-κB、TNF-α、IL-6及IL-1β mRNA表達水平明顯降低，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見表2。

圖2 各組大鼠肺組織中HMGB1蛋白及下游基因蛋白表達

表2 各組大鼠肺組織中HMGB1及下游基因mRNA表達

注：與正常對照組比較，*P<0.05；與放射性肺損傷組比較，#P<0.05

Note:vs. normal control group，*P<0.05；vs. radiation-induced lung injury group，#P<0.05

3 討論

放療為胸部惡性腫瘤重要治療手段之一，主要通過α、β、γ射線以及各類X射線殺死處于分裂周期的惡性腫瘤細胞[10]。放射線在殺死惡性腫瘤細胞的同時，也不可避免地對靶器官或組織造成不同程度的直接或間接損傷。放射性肺損傷為胸部惡性腫瘤患者放療常見并發(fā)癥，肺部組織纖維化的改變不僅可限制放療劑量，還可對患者治療效果產生影響[11]。放射性肺損傷根據(jù)發(fā)生時間不同可分為早期和晚期。目前，早期放射性肺損傷患者多可通過對癥處理得到緩解，而晚期患者肺損傷多不可逆，預后較差。因此，早期放射性肺損傷的防治成為目前臨床研究熱點。HMGB1是一種高度保守的炎癥介質，廣泛分布于哺乳動物細胞內。HMGB1可通過參與腫瘤細胞自噬、凋亡、增殖過程及促進炎癥反應，造成腫瘤細胞對化療、放療等治療產生抵抗[12]。徐僑翌等[13]的研究結果發(fā)現(xiàn)，在脂多糖誘導的肺成纖維細胞異常增殖小鼠肺成纖維細胞核內存在HMGB1的主動分泌。烏司他丁為一種蛋白水解酶抑制劑，其可通過清除機體內氧自由基和抑制炎癥因子釋放，減少細胞或組織損傷[14]。烏司他丁是否對放射性肺損傷具有保護作用，本研究基于HMGB1信號通路進行了分析。

本研究中HE染色結果顯示，正常對照組大鼠肺組織支氣管、黏膜下及肺間質中無炎癥細胞浸潤，放射性肺損傷組大鼠肺組織支氣管、黏膜下及肺間質中有大量炎癥細胞浸潤，肺間質增厚；烏司他丁組大鼠肺組織支氣管、黏膜下及肺間質中炎癥細胞較放射性肺損傷組明顯減少，肺間質水腫明顯緩解。同時對大鼠BALF中白細胞種類進行計數(shù)發(fā)現(xiàn)，與正常對照組比較，放射性肺損傷組和烏司他丁組大鼠BALF中嗜酸性粒細胞、中性粒細胞、淋巴細胞及單核細胞比例升高，與放射性肺損傷組比較，烏司他丁組大鼠BALF中嗜酸性粒細胞、中性粒細胞、淋巴細胞及單核細胞比例降低。以上結果提示，早期放射性肺損傷主要表現(xiàn)為肺組織支氣管、黏膜下及肺間質炎癥細胞浸潤、肺間質水腫，烏司他丁對減輕肺部損傷具有一定作用。NF-κB是一類關鍵性核轉錄因子，廣泛存在于幾乎所有類型細胞細胞質內。研究結果顯示，TNF-α、IL-6及IL-1β等參與炎癥反應各階段的炎癥因子均可受NF-κB調控[15]。時磊等[16]的研究結果發(fā)現(xiàn)，NF-κB的活化與放射性肺損傷肺部炎癥反應和纖維化有關。RAGE基因是體內過量的糖與蛋白質結合的產物，可與人體內各種組織細胞結合參與糖尿病、動脈粥樣硬化等慢性退化性疾病[17]。研究結果顯示，HMGB1主要通過與RAGE結合參與炎癥反應等病理過程[18]。TNF-α、IL-6及IL-1β為常見促炎因子，與放療所致肺損傷密切相關[19-20]。本研究結果顯示，與正常對照組比較，放射性肺損傷組和烏司他丁組大鼠肺組織HMGB1、RAGE、NF-κB、TNF-α、IL-6及IL-1β蛋白和mRNA表達水平明顯升高，而烏司他丁組大鼠肺組織HMGB1、RAGE、NF-κB、TNF-α、IL-6及IL-1β蛋白和mRNA表達水平較放射性肺損傷組明顯降低。

綜上所述，烏司他丁可能通過降低HMGB1及其下游蛋白表達，中斷HMGB1信號通路，減輕早期放射性肺損傷大鼠肺部炎癥細胞浸潤，有可能成為預防和治療早期放射性肺損傷的藥物。