蘇琰，李融

1(合肥職業(yè)技術(shù)學(xué)院，安徽 合肥，238000)2(巢湖學(xué)院，安徽 合肥，238000)

變態(tài)反應(yīng)(allergy)是PIRQUET于1906年基于其傳染病學(xué)和免疫學(xué)領(lǐng)域的臨床研究提出的[1]，指機(jī)體免疫防御功能亢進(jìn)引起的一種異常免疫應(yīng)答。過(guò)敏原(allergen)即引起超敏反應(yīng)的抗原。超敏反應(yīng)的臨床表現(xiàn)多種多樣，其中食物過(guò)敏(food allergy)是由食物某些成分的誘導(dǎo)而產(chǎn)生以特異性IgE為主的病理性免疫應(yīng)答，其癥狀不僅表現(xiàn)在消化道方面，也包括皮膚、神經(jīng)系統(tǒng)及呼吸系統(tǒng)等。

2015年我國(guó)嬰幼兒過(guò)敏流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果表明，大約40.9%嬰幼兒(2歲以下)家長(zhǎng)報(bào)告嬰幼兒有過(guò)敏性疾病發(fā)生[2]。食品中過(guò)敏原的體外檢測(cè)主要包括蛋白質(zhì)檢測(cè)與核酸檢測(cè)兩方面[3]。其中基于蛋白質(zhì)檢測(cè)方法主要包括酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)和色譜分析(chromatography)等，傳統(tǒng)的基于蛋白質(zhì)的過(guò)敏原檢測(cè)方法因食物在生產(chǎn)加工過(guò)程中蛋白質(zhì)易變性和降解而導(dǎo)致假陰性結(jié)果；基于核酸水平檢測(cè)包括針對(duì)過(guò)敏原基因的擴(kuò)增技術(shù)和雜交技術(shù)等，近年來(lái)核酸檢測(cè)技術(shù)尤其是PCR技術(shù)不斷建立并推廣應(yīng)用。本文主要從食品過(guò)敏原的核酸擴(kuò)增檢測(cè)技術(shù)和核酸雜交檢測(cè)技術(shù)兩方面，綜述了過(guò)敏原的核酸檢驗(yàn)技術(shù)的研究進(jìn)展。

1 常見(jiàn)過(guò)敏原

國(guó)際食品法典委員會(huì)是聯(lián)合國(guó)糧食及農(nóng)業(yè)組織和世界衛(wèi)生組織于1963年共同設(shè)立的國(guó)際組織并制定了具有重要指導(dǎo)意義的食品國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)，其公布的《預(yù)包裝食品標(biāo)簽通用標(biāo)準(zhǔn)》中對(duì)食品中可能存在的致敏成分應(yīng)予以說(shuō)明。國(guó)家食品發(fā)典委員會(huì)中規(guī)定的八類(lèi)過(guò)敏原有：谷類(lèi)(含麩質(zhì)蛋白)；甲殼綱類(lèi)動(dòng)物及甲殼類(lèi)制品，如蟹、蝦等；蛋類(lèi)及蛋類(lèi)制品，如雞蛋等；魚(yú)類(lèi)及其魚(yú)類(lèi)制品，如鱸魚(yú)、鱈魚(yú)等；花生、大豆及其制品；乳及乳制品(包括乳糖)；堅(jiān)果及其制品，如杏仁、腰果、核桃等；濃度大于等于10 mg/kg的亞硫酸鹽[4]。

我國(guó)相關(guān)食品標(biāo)簽法規(guī)對(duì)八大類(lèi)過(guò)敏原及其他過(guò)敏原種類(lèi)做出了強(qiáng)制或推薦標(biāo)識(shí)的相關(guān)規(guī)定[5]。日本自2015年發(fā)布了《食品標(biāo)識(shí)基準(zhǔn)》對(duì)相關(guān)食品標(biāo)簽作出規(guī)定[6]，韓國(guó)也對(duì)須標(biāo)注的一些食品過(guò)敏原作出強(qiáng)制標(biāo)注的規(guī)定。歐盟除強(qiáng)制標(biāo)注八大類(lèi)過(guò)敏原以外，還增加了芹菜及其制品等，將強(qiáng)制性標(biāo)注過(guò)敏原種類(lèi)增加到14類(lèi)[7-8]。

2 基于核酸的分子檢驗(yàn)技術(shù)在食品過(guò)敏原檢測(cè)中的應(yīng)用

2.1 核酸擴(kuò)增技術(shù)檢測(cè)過(guò)敏原

1985年MULLIS[9]發(fā)明了聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction，PCR)，最初的PCR技術(shù)采用的是大腸桿菌DNA聚合酶I的Klenow片段，缺點(diǎn)是不耐熱，SAIKI等[10]于1988提取了水生嗜熱桿菌的耐熱的DNA聚合酶，提高了擴(kuò)增特異性和靈敏度，極大推動(dòng)分子生物學(xué)的發(fā)展。由普通PCR的定性或半定量檢測(cè)逐步發(fā)展到實(shí)時(shí)熒光定量PCR和數(shù)字PCR的定量檢測(cè)[11]，檢測(cè)準(zhǔn)確度不斷提高，可擴(kuò)增目的基因片段逐漸增大，引物設(shè)計(jì)也多樣化[12]。近年來(lái)衍生出RT-PCR、巢式-PCR、DPO-PCR、實(shí)時(shí)熒光定量PCR、多重PCR、數(shù)字PCR、PCR芯片和菌落PCR等，廣泛應(yīng)用于食品安全檢測(cè)、基因分型、臨床檢驗(yàn)和環(huán)境監(jiān)測(cè)等各領(lǐng)域。實(shí)時(shí)熒光定量PCR實(shí)時(shí)測(cè)定探針標(biāo)記的靶基因的熒光信號(hào)，通過(guò)信號(hào)強(qiáng)度、Ct值和靶基因的起始濃度之間的關(guān)系計(jì)算其擴(kuò)增拷貝數(shù)或表達(dá)水平。與第一代PCR相比，該技術(shù)實(shí)現(xiàn)了定量檢測(cè)，然而其檢測(cè)靈敏度也受到模板濃度等的影響。數(shù)字PCR是近幾年來(lái)迅速發(fā)展的新型PCR檢測(cè)技術(shù)，被稱(chēng)為第三代PCR技術(shù)，在克服了前兩代PCR缺點(diǎn)的基礎(chǔ)上，數(shù)字PCR具有對(duì)樣本需求量低、靈敏度高和絕對(duì)定量等優(yōu)點(diǎn)[13]。

2.1.1 普通PCR檢測(cè)過(guò)敏原

與蛋白質(zhì)檢測(cè)方法相比，核酸檢測(cè)的優(yōu)勢(shì)在于：熱變性條件下DNA仍可有效提取且穩(wěn)定性較好。普通PCR檢測(cè)過(guò)敏原基因的方法建立較早，如YANO等[14]在2007年就針對(duì)核桃matK基因設(shè)計(jì)了WAL-F/WAL-R引物對(duì)，建立了普通PCR方法對(duì)食品中的微量核桃進(jìn)行定性檢測(cè)。然而最初的傳統(tǒng)PCR檢測(cè)技術(shù)僅能定性或半定量檢測(cè)食品中某一種過(guò)敏原基因，隨著分子生物學(xué)檢驗(yàn)技術(shù)的不斷發(fā)展，能夠同時(shí)檢測(cè)多種過(guò)敏原或者準(zhǔn)確度更高的PCR方法被不斷設(shè)計(jì)出。

2.1.2 多重PCR檢測(cè)過(guò)敏原

多重PCR(multiplex polymerase chain reaction，MPCR)是1988年由CHAMBERLAIN等提出[15]，與普通PCR相比，其原理及結(jié)果分析與普通PCR一致，不同點(diǎn)在于設(shè)計(jì)2對(duì)或多對(duì)引物在同一反應(yīng)體系擴(kuò)增出2個(gè)或多個(gè)相應(yīng)基因片段。多重PCR既擁有傳統(tǒng)PCR較高特異性和靈敏度等的特點(diǎn)，也體現(xiàn)出同時(shí)擴(kuò)增多種目的基因的高效性。由于多對(duì)引物在同一體系內(nèi)擴(kuò)增，為了準(zhǔn)確擴(kuò)增出目的條帶而不受其他因素干擾，對(duì)擴(kuò)增條件要求較高，對(duì)引物設(shè)計(jì)、循環(huán)條件優(yōu)化等方面要求較嚴(yán)格。目前該技術(shù)已廣泛應(yīng)用于食品安全檢測(cè)，轉(zhuǎn)基因檢測(cè)及醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)等領(lǐng)域[16-17]。加工食品中可能會(huì)同時(shí)含有多種過(guò)敏原，單一成分過(guò)敏原檢測(cè)費(fèi)時(shí)費(fèi)力，可同時(shí)檢測(cè)多種過(guò)敏原成分的多重PCR檢測(cè)技術(shù)的高效性則顯得尤為重要，食品過(guò)敏原的多重PCR檢測(cè)應(yīng)用見(jiàn)表1。

2.1.3 熒光定量PCR檢測(cè)過(guò)敏原

1996年美國(guó)Applied Biosystems公司推出實(shí)時(shí)熒光定量PCR(quantitative real-time PCR)，可分為兩類(lèi)：一類(lèi)是DNA結(jié)合染料如SYBR Green Ⅰ等以提高熒光強(qiáng)度進(jìn)行檢測(cè)；另一類(lèi)特異性檢測(cè)方法是Taqman法，即在PCR體系中引入Taqman探針，DNA聚合酶延伸至于探針?biāo)谖恢脤⑵渌猱a(chǎn)生熒光信號(hào)進(jìn)行檢測(cè)。該技術(shù)的出現(xiàn)使分子檢驗(yàn)技術(shù)領(lǐng)域發(fā)生重大的變化，目前已廣泛地應(yīng)用于臨床醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)、動(dòng)植物病原體感染以及食品安全如過(guò)敏原檢測(cè)等定量檢驗(yàn)檢測(cè)等領(lǐng)域[22-23]。實(shí)時(shí)熒光定量PCR較上述幾種PCR技術(shù)靈敏度高，可定量檢測(cè)分析。也可將實(shí)時(shí)熒光定量PCR與多重PCR相結(jié)合，建立更為快捷準(zhǔn)確的檢測(cè)體系。近年來(lái)建立多種食源性過(guò)敏原的qPCR檢測(cè)方法，詳見(jiàn)表2。

表1 基于多重PCR的食品過(guò)敏原檢測(cè)方法Table 1 Multiplex PCR based methods for food allergens

2.1.4 數(shù)字PCR檢測(cè)過(guò)敏原

數(shù)字PCR(digital PCR，dPCR)是將待檢核酸樣本分成多份，隨機(jī)分布于大量的獨(dú)立擴(kuò)增體系中，盡可能使每擴(kuò)增體系只包含單個(gè)拷貝模板，并對(duì)其反應(yīng)信號(hào)進(jìn)行檢測(cè)和統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，從而實(shí)現(xiàn)絕對(duì)定量檢測(cè)。數(shù)字PCR于1999年由VOGELSTEIN等提出，并在96孔和384孔微量反應(yīng)孔中進(jìn)行致癌突變基因ras定量分析[34]。

表2 基于實(shí)時(shí)熒光定量PCR的食品過(guò)敏原檢測(cè)方法Table 2 Quantitative real-time PCR based methods for food allergens

與qPCR相比，數(shù)字PCR無(wú)需依賴(lài)標(biāo)準(zhǔn)品或建立標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，檢測(cè)結(jié)果不受擴(kuò)增效率的影響，最終的檢測(cè)結(jié)果通過(guò)對(duì)陽(yáng)性和陰性反應(yīng)單元數(shù)統(tǒng)計(jì)分析以及泊松分布修正，從而實(shí)現(xiàn)絕對(duì)定量分析。且隨著微納制造等相關(guān)技術(shù)和產(chǎn)業(yè)化的發(fā)展，實(shí)現(xiàn)了數(shù)以萬(wàn)計(jì)甚至更多的PCR獨(dú)立反應(yīng)單元的制備，全球各大生物儀器公司紛紛開(kāi)發(fā)出各類(lèi)商業(yè)化的數(shù)字PCR檢測(cè)系統(tǒng)[11]。

根據(jù)反應(yīng)單元的劃分，目前商業(yè)化數(shù)字PCR平臺(tái)主要分為芯片式和微液滴式。微孔芯片dPCR系統(tǒng)指的是樣本分布在微容量固體反應(yīng)單元中進(jìn)行目的基因擴(kuò)增并對(duì)每單元進(jìn)行實(shí)時(shí)或終點(diǎn)熒光檢測(cè)分析。如Life Technologies公司的Open Array dPCR系統(tǒng)、QuantStudioTM12K Flex dPCR系統(tǒng)和QuantStudioTM3D dPCR系統(tǒng)等。微液滴式dPCR系統(tǒng)指的是將樣本分散在獨(dú)立的“油包水”微小液滴反應(yīng)單元中進(jìn)行目的基因擴(kuò)增，并對(duì)每單元擴(kuò)增結(jié)果進(jìn)行實(shí)時(shí)或終點(diǎn)熒光檢測(cè)分析。如Bio-Rad公司開(kāi)發(fā)的QX200TMdPCR系統(tǒng)和RainDance公司的RainDropTMdPCR系統(tǒng)[35]。目前，基于上述芯片式dPCR系統(tǒng)或微滴式dPCR系統(tǒng)商業(yè)檢測(cè)平臺(tái)已較多應(yīng)用于轉(zhuǎn)基因、食品安全檢測(cè)以及臨床醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)等各領(lǐng)域[36-37]。

利用數(shù)字PCR系統(tǒng)檢驗(yàn)食品過(guò)敏原的方法研究近年來(lái)也逐步開(kāi)展和建立。PIERBONI等[38]建立了食品中大豆和花生的數(shù)字PCR檢測(cè)方法，針對(duì)大豆的Glym30、Glym5、Lectin基因和花生的Arah1、Arah2基因設(shè)計(jì)引物，利用dPCR檢測(cè)大豆和花生，并同時(shí)將dPCR與qPCR及ELISA等作對(duì)比研究。MAYER等[39]針對(duì)大豆的葉綠體DNA的ndhH基因設(shè)計(jì)數(shù)字PCR引物檢測(cè)大豆成分，靈敏度達(dá)到0.16 mg/kg。

2.1.5 環(huán)介導(dǎo)的核酸等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)檢測(cè)過(guò)敏原

NOTOMI等開(kāi)發(fā)了環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(loop-mediated isothermal amplification，LAMP)[40]，根據(jù)6對(duì)特異序列設(shè)計(jì)2對(duì)內(nèi)外引物：2條較長(zhǎng)的內(nèi)引物和2條較短的外引物，通過(guò)鏈置換DNA聚合酶在約60～65 ℃等溫下完成基因的循環(huán)擴(kuò)增，最終形成不同的梯度結(jié)構(gòu)[41]。LAMP的焦磷酸鎂沉淀產(chǎn)物肉眼即可觀察其渾濁變化程度從而判斷來(lái)是否有目的基因擴(kuò)增。除此以外，也可觀察凝膠電泳是否為梯形條帶；或?qū)晒馊玖蠐饺敕磻?yīng)產(chǎn)物中，用紫外燈照射直接觀察其顏色的變化以判斷檢驗(yàn)結(jié)果[42]；或通過(guò)比濁法檢測(cè)焦磷酸鎂沉淀。LAMP與普通PCR相比，檢測(cè)速度更快，不需要進(jìn)行模板的變性、循環(huán)及電泳等過(guò)程，是一種新型的簡(jiǎn)單、快速、特異性強(qiáng)、檢驗(yàn)成本較低且可以不需要依賴(lài)精密儀器設(shè)備的分子生物學(xué)檢驗(yàn)技術(shù)。LAMP目前已經(jīng)應(yīng)用于動(dòng)植物病毒、細(xì)菌、真菌毒素、醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)以及食品安全監(jiān)測(cè)等各領(lǐng)域[43-44]，具有較為廣闊的應(yīng)用前景。環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增與其他擴(kuò)增技術(shù)相比，更為簡(jiǎn)單快捷，可不依靠精密儀器等優(yōu)點(diǎn)，在食源性過(guò)敏原的快速檢測(cè)領(lǐng)域也逐漸受到關(guān)注(表3)。

表3 基于環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)的食品過(guò)敏原檢測(cè)方法Table 3 Loop-mediated isothermal amplification based methods for food allergens

2.2 核酸分子雜交技術(shù)檢測(cè)過(guò)敏原

基于核酸的分子雜交技術(shù)有固相、液相和原位雜交等。固相核酸雜交技術(shù)將待檢DNA/RNA轉(zhuǎn)移并固定在固相膜上，對(duì)應(yīng)的互補(bǔ)探針在載體膜上與待檢靶序列雜交反應(yīng)，并檢測(cè)雜交的探針信號(hào)。該技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)是高靈敏度、高效及高通量等，也已應(yīng)用于動(dòng)、植物等病毒檢測(cè)、食品安全檢測(cè)以及基因的鑒定及定性分析等[51]。液相反應(yīng)系統(tǒng)如懸浮芯片技術(shù)(suspension array technology，SAT)是用特殊編碼的微球顆粒作為載體來(lái)固定探針，是一種集編碼、流式細(xì)胞技術(shù)和電子信息技術(shù)等于一體的檢測(cè)技術(shù)。該技術(shù)在食品過(guò)敏原檢測(cè)也有應(yīng)用，CHRISTOPOULOU等人設(shè)計(jì)了探針微球同時(shí)檢測(cè)加工食品中所含榛子、花生和核桃3種過(guò)敏原，最低檢出限可達(dá)0.01%[52]。

2.2.1 基于DNA的芯片檢測(cè)技術(shù)檢測(cè)過(guò)敏原

基于核酸的生物芯片檢測(cè)技術(shù)是利用核酸分子雜交的原理，將其中已知序列核酸鏈(探針)標(biāo)記后固化于芯片基質(zhì)表面，與待測(cè)樣本核酸(靶序列)利用堿基互補(bǔ)配對(duì)原則進(jìn)行分子雜交檢測(cè)，通過(guò)雜交信號(hào)檢測(cè)完成對(duì)靶序列的定性或定量檢測(cè)，分析待測(cè)樣本靶基因的有無(wú)或其表達(dá)的變化[53]。因此，與傳統(tǒng)的核酸印跡雜交技術(shù)如DNA印跡(southern blotting)或RNA印跡(northern blotting)等不同，基因芯片技術(shù)采用的是一種反向雜交。其突出優(yōu)點(diǎn)是能夠大規(guī)模、高通量、準(zhǔn)確快速地同步分析待檢基因。

2.2.2 基于DNA的生物傳感器檢測(cè)技術(shù)檢測(cè)過(guò)敏原

基于DNA的生物傳感器是將核酸雜交信號(hào)通過(guò)轉(zhuǎn)換器轉(zhuǎn)換為光電等物理信號(hào)并對(duì)此進(jìn)行定量檢測(cè)，將高度特異性的核酸雜交與高度敏感性的物理信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)相互協(xié)作[54]，具有準(zhǔn)確、高效、自動(dòng)化、專(zhuān)一性強(qiáng)，可連續(xù)重復(fù)利用以及操作簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn)。

核酸雜交檢測(cè)技術(shù)在過(guò)敏原檢測(cè)領(lǐng)域具有突出優(yōu)勢(shì)，通過(guò)開(kāi)發(fā)精密檢測(cè)儀器不斷提高檢測(cè)的準(zhǔn)確度，多種過(guò)敏原的相關(guān)鑒定方法相繼建立(表4)。

3 展望

隨著食品加工技術(shù)的多元化發(fā)展，加工食品的功能和特性均得到了提升改善，但亦可能在生產(chǎn)過(guò)程中引入多種過(guò)敏原，從而增加了過(guò)敏風(fēng)險(xiǎn)，因此建立高效準(zhǔn)確的食源性過(guò)敏原的檢測(cè)方法具有重要意義。

目前過(guò)敏原檢測(cè)仍然以蛋白質(zhì)檢測(cè)為主，其中應(yīng)用較為廣泛的是免疫學(xué)檢驗(yàn)技術(shù)，如酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)和化學(xué)發(fā)光免疫分析等，具有特異性強(qiáng)和準(zhǔn)確率高等優(yōu)點(diǎn)，但檢測(cè)耗時(shí)較長(zhǎng)。市場(chǎng)上大部分商業(yè)化的試劑盒仍然是針對(duì)食品中單一過(guò)敏原成分進(jìn)行檢測(cè)，不能同時(shí)檢測(cè)多種蛋白過(guò)敏原，且在痕量檢測(cè)方面略顯不足。近年來(lái)也相繼建立起多種過(guò)敏原的質(zhì)譜檢測(cè)體系[60]，需注意的是不同樣本處理方法對(duì)結(jié)果影響較大且成本較高。

表4 基于核酸雜交技術(shù)的食品過(guò)敏原檢測(cè)方法Table 4 Nucleic acid hybridization based methods for food allergens

與蛋白質(zhì)檢測(cè)相比，基于核酸的分子生物學(xué)檢測(cè)技術(shù)能夠更加簡(jiǎn)便、快捷、高靈敏度地檢測(cè)食品中存在的過(guò)敏原基因。基于基因擴(kuò)增的PCR技術(shù)從定性檢測(cè)發(fā)展到定量檢測(cè)，其檢測(cè)精確度不斷提高，引物設(shè)計(jì)越來(lái)越多樣化，可檢測(cè)范圍逐漸擴(kuò)大。核酸雜交技術(shù)可在同時(shí)、短時(shí)內(nèi)分析多種過(guò)敏原基因，使得過(guò)敏原基因檢測(cè)更加簡(jiǎn)便快速，實(shí)現(xiàn)了高通量和自動(dòng)化檢測(cè)。然而核酸檢測(cè)技術(shù)也存在一些缺點(diǎn)，比如對(duì)儀器設(shè)備要求高，檢測(cè)步驟較為繁瑣以及檢測(cè)時(shí)間較長(zhǎng)，檢測(cè)對(duì)象為核酸而非致敏蛋白等。

綜上所述，現(xiàn)階段的檢測(cè)手段仍不能完全滿(mǎn)足實(shí)際檢測(cè)工作的需求。對(duì)于過(guò)敏原的核酸檢測(cè)技術(shù)，今后一方面需對(duì)核酸檢測(cè)技術(shù)的條件進(jìn)行優(yōu)化和改進(jìn)，不斷提高其特異性和靈敏度；另一方面則需要研發(fā)更為先進(jìn)便攜的檢測(cè)設(shè)備，為實(shí)現(xiàn)快速高效的現(xiàn)場(chǎng)核酸檢測(cè)提供方便。此外，蛋白質(zhì)檢測(cè)和核酸檢測(cè)各具優(yōu)點(diǎn)，可將多種檢測(cè)技術(shù)相互結(jié)合以滿(mǎn)足實(shí)際檢測(cè)工作中的多元化要求。