任興權(quán),劉盼,蘇菊,王蓉,曾文錦,周麗,史蓉,李婷婷,段亭

(酒泉市食品檢驗檢測中心，甘肅 酒泉， 735000)

馬鈴薯是全世界重要的糧食作物之一，由于光照、貯藏不當(dāng)，致使馬鈴薯發(fā)芽或皮變綠，在這一過程中產(chǎn)生了一類甾體糖苷類生物堿[1]，被稱為龍葵素，其成分為α-茄堿、β-茄堿、γ-茄堿、α-卡茄堿、β-卡茄堿、γ-卡茄堿6種成分，主要以α-茄堿、α-卡茄堿的形式存在，占總的糖苷生物堿的95%。這類生物堿有較強的毒性[2-12]，當(dāng)成年人一次攝入龍葵素超過200 mg時就會引起中毒[2]，含量更高時就會導(dǎo)致舌頭發(fā)麻、嘔吐、腹瀉、頭暈?zāi)垦?，甚至昏迷、抽搐、呼吸困難、死亡?？茖W(xué)準(zhǔn)確地檢測馬鈴薯中α-茄堿、α-卡茄堿的含量對保障我們每一個人的身體健康具有重要的實際意義。

目前已報道的馬鈴薯中α-茄堿、α-卡茄堿檢測方法主要有比色法[13]、液相色譜法[14-25]、液相色譜-質(zhì)譜法[26-30]，后兩種方法研究的比較多。邵慧凱等[15]用異丁醇萃取-高效液相色譜法測定馬鈴薯中的α-茄堿，運用異丁醇萃取，在210 nm波長處檢測，從檢測譜圖可以看出其檢測限偏高，達(dá)不到實際檢測的需求。趙丹青等[16]用V(乙醇)∶V(乙酸)=100∶30溶液提取，過SPE NH2小柱，V(甲醇)∶V(二氯甲烷)=5∶95洗脫用液相檢測，只檢測了α-茄堿，沒有完全將α-茄堿和α-卡茄堿分開，不能準(zhǔn)確地測定α-茄堿和α-卡茄堿的各自含量。張舵[21]用無水乙醇-乙酸提取后液相色譜檢測，檢測的峰型不好，并且有雙頭峰。王建鳳等[26]用V(1%甲酸)∶V(甲醇)=1∶1提取，采用液質(zhì)法檢測。劉紅河等[27]用超高液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法檢測馬鈴薯及制品中α-茄堿，用V(甲酸)∶V(甲醇)=1∶1作為溶劑提取，并且用MCX固相萃取柱萃取過程復(fù)雜，提取效果不是很理想。戴超等[29]運用液質(zhì)聯(lián)用法分析貯藏對馬鈴薯中α-茄堿含量的影響中用V(乙酸)∶V(乙醇)=1∶10混合溶劑振蕩提取，其提取效果不佳。現(xiàn)有的液相色譜普遍存在前處理復(fù)雜，提取效果差，檢出限偏高，檢測結(jié)果不理想的問題，而現(xiàn)有的液相-質(zhì)譜聯(lián)用法則存在提取不完全，對儀器性能要求高等問題。

本研究在綜合分析現(xiàn)有方法的基礎(chǔ)上，創(chuàng)新了前處理方法，采用液相色譜法分析檢測，同時與液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法進行分析比對，該方法操作簡單、檢測靈敏度高、穩(wěn)定性好，能有效監(jiān)測馬鈴薯龍葵素的含量，為防止食物中毒提供技術(shù)支撐，尤其是可以普及應(yīng)用到基層的檢測機構(gòu)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

馬鈴薯，市購。

甲醇、乙腈(均為色譜純)，默克股份兩合公司；甲酸(色譜純)，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；無水硫酸鈉、無水乙酸鎂、無水硫酸鎂、無水乙酸鈉、乙酸、乙醇、異丁醇(分析純)，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；磷酸二氫鉀(色譜純)，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；α-茄堿(C45H73NO15，CAS號：20562-02-1，純度≥99.9%)，多倫多研究化學(xué)公司；α-卡茄堿(C45H73NO14，CAS號：20562-03-2，純度≥99.9%)，ChromaDex公司。

1.2 儀器與設(shè)備

島津LC-20AT型液相色譜儀，日本島津公司；艾柯Advanced-Ⅱ-12型高純水機，成都唐氏康寧科技發(fā)展有限公司；寧波新芝SB25-12DTD型超聲波清洗機，寧波新芝生物科技有限公司；長沙英泰TG16型離心機，長沙英泰儀器有限公司；IKA MS3型渦旋混合器，IKA公司；賽多利斯SQP型電子天平，賽多利斯科學(xué)儀器(北京)有限公司；梅特勒PL602E/02便攜式天平，梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 HPLC條件

色譜柱：Hubble C18液相色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm);流動相A為0.02 mol/L磷酸二氫鉀溶液，流動相B為乙腈，流動相比例：A為70%，B為30%，流速0.2 mL/min，柱溫30 ℃，進樣量10 μL，二級管陣列檢測器檢測范圍190～810nm，檢測波長195 nm。

1.3.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液的配制

分別稱取10 mg α-茄堿和α-卡茄堿于10 mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容，配制成1mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲備液；用甲醇逐級稀釋成0.2、2、10、20、50、100、200 μg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)系列溶液。

1.3.3 樣品前處理

用均質(zhì)器將樣品充分打碎混勻，放入分裝容器中，密封并標(biāo)記，于-20 ℃以下冷凍存放。

稱取試樣1～2 g(精確至0.001 g)于50 mL具塞離心管中，加入3.0～5.0 mL水渦旋混勻1 min，再準(zhǔn)確加入25.0 mL酸化甲醇[V(甲酸)∶V(甲醇)=1∶99]，渦旋混勻1 min。之后，向離心管中加入1.0～2.0 g 無水硫酸鈉，1.0 g 無水乙酸鎂。手動劇烈搖動1 min后渦旋混勻1 min。再將離心管置于離心機中，在室溫條件下以10 000 r/min的速度，離心5 min。試樣為芽和綠皮時取1 mL上清液于10 mL容量瓶中，加入甲醇水溶液[40%(體積分?jǐn)?shù))甲醇]定容至刻度；試樣為馬鈴薯肉和制品時取5 mL上清液于試管中氮吹濃縮近干，然后加入1 mL甲醇水溶液[40%(體積分?jǐn)?shù))甲醇]復(fù)溶；過微孔濾膜(0.22 μm，尼龍)后上機測定。

1.3.4 定性、定量方法

在以α-茄堿和α-卡茄堿保留時間定性的基礎(chǔ)上，與全掃描光譜定性和色譜峰純度分析相結(jié)合的多重定性方法。以外標(biāo)法對α-茄堿和α-卡茄堿進行定量分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 提取方式的選擇

馬鈴薯中α-茄堿、α-卡茄堿的常用提取方法有乙醇法、乙醇-乙酸混合劑法、異丁醇萃取法、乙酸-乙腈法、乙醇-乙腈法等，雖然均能不同程度的提取，但是提取效果均不能達(dá)到最佳理想狀態(tài)。本研究先加入少量水再用酸化甲醇提取，通過加入無水硫酸鈉、無水乙酸鎂這2種在提取中不參加反應(yīng)而吸收多余的水，最后在高速離心機上離心。由表1可以看出，通過不同方法的對比得出酸化甲醇能夠最大限度地提取α-茄堿、α-卡茄堿，同時與吸水性較弱的無水硫酸鎂、無水乙酸鈉對比，無水硫酸鈉和無水乙酸鎂的吸水性更強。這是由于在酸性、含水量少的環(huán)境中α-茄堿、α-卡茄堿易溶于甲醇，無水硫酸鎂、無水乙酸鈉有很強的的吸水能力，致使大量的水分被吸收。

表1 不同試劑提取效果的對比 單位：μg/mL

2.2 色譜條件的選擇

2.2.1 檢測波長的選擇

馬鈴薯淀粉含量高，在酸性介質(zhì)中樣品易水解，檢測基質(zhì)復(fù)雜，同時α-茄堿和α-卡茄堿保留時間相近，僅依據(jù)保留時間定性易出現(xiàn)假陽性。二極管陣列檢測可進行全波長掃面，通過對待測樣品譜圖與α-茄堿和α-卡茄堿標(biāo)準(zhǔn)譜圖的掃描光譜和最大吸收波長進行比較，同時可進行色譜峰的純度分析，利用多重定性方法，排除了基質(zhì)的干擾，防止假陽性結(jié)果的出現(xiàn)，提高了定性分析的準(zhǔn)確度。

采用二極管陣列檢測器的全波長3D掃描功能，在190～810 nm對α-茄堿和α-卡茄堿進行掃描。掃描結(jié)果表明α-茄堿和α-卡茄堿的全波長掃描圖基本一致，在190～205 nm時掃描圖差別較小，在特征波長195 nm處α-茄堿和α-卡茄堿均有最強的紫外吸收，峰面積和峰高度均達(dá)到最高值，具體對比結(jié)果見圖1，因此本研究確定195 nm作為本方法的定性檢測波長。

2.2.2 色譜柱的選擇

液相色譜法最常用的多為反相色譜C18柱，因為α-茄堿和α-卡茄堿為疏水性物質(zhì)，并且在提取介質(zhì)中加入了甲酸，致使提取液的酸性較強，一般的C18柱無法有效分離，本方法采用了OmniBond HPLC Column Hubble C18(250 mm×4.6 mm，5 μm),它采用了超純硅膠和深度鍵合這2種技術(shù)，具有高柱效，高選擇性，高pH穩(wěn)定性。同時對同類型Hubble C18(150 mm×4.6 mm，5μm)進行對比試驗發(fā)現(xiàn)無法分離α-茄堿和α-卡茄堿。結(jié)果表明HubbleC18(250 mm×4.6 mm，5 μm)色譜柱能夠很好的分離、檢測α-茄堿和α-卡茄堿，色譜峰的基線平穩(wěn)。

2.2.3 流動相體系的選擇

檢測α-茄堿和α-卡茄堿的流動相體系一般由0.4%磷酸/乙腈、0.1%甲酸水溶液/乙腈、甲醇/甲酸銨、甲醇/乙酸銨、甲醇/甲酸、乙腈/磷酸二氫鉀。通過比較乙腈體系的基線噪音比甲醇體系小，分離效果更佳，同時，磷酸二氫鉀比乙酸銨、甲酸銨、磷酸、甲酸有更好的分離效果。因此，選用乙腈/磷酸二氫鉀作為流動相的體系，并且對磷酸二氫鉀的濃度和乙腈的配比進行了對比，發(fā)現(xiàn)0.2 mol/L磷酸二氫鉀能夠很好的調(diào)節(jié)流動相體系的pH，而當(dāng)V(磷酸二氫鉀)∶V(乙腈)=70∶30時流動相體系的pH為6.0，α-茄堿和α-卡茄堿可以完全分開，并且峰型良好，是最佳的分析條件。

a-190 nm波長的譜圖；b-195 nm波長的譜圖；c-200 nm波長的譜圖；d-190、195、200 nm波長下色譜峰的相關(guān)信息
圖1 不同波長時α-茄堿和α-卡茄堿的色譜圖及峰表
Fig.1 Chromatogram and peak table of α-solanine and α-chaconine at different wavelengths

2.2.4 流動相淋洗方式的選擇

流動相采用梯度淋洗時能夠較早的出峰，但是基線不平穩(wěn)，致使α-卡茄堿分離的效果不佳。因為α-茄堿和α-卡茄堿出峰時間相差很小，用等度淋洗時，可以保持流動相體系的酸性環(huán)境穩(wěn)定，在有效分離α-茄堿的同時也可有效分離α-卡茄堿。

2.2.5 流動相流速的選擇

分別對0.10、0.15、0.20、0.25、0.30、0.40、0.50、0.60、0.80、1.00 mL/min時的分離效果進行了比對。研究結(jié)果表明，隨著流速的增大，保留時間縮短，峰寬變窄，峰面積降低，α-茄堿和α-卡茄堿的峰重疊越嚴(yán)重。綜合保留時間、峰面積、分離度等因素，最終確定流動相流速為0.2 mL/min,。在此優(yōu)化條件下，α-茄堿和α-卡茄堿分離效果良好，標(biāo)準(zhǔn)譜圖見圖2，馬鈴薯芽樣品中的α-茄堿和α-卡茄堿譜圖見圖3。

圖2 100.0 μg/mL α-茄堿和α-卡茄堿標(biāo)準(zhǔn)溶液液相色譜圖
Fig.2 Liquid chromatogram of 100.0 μg/mL α - solanine and α-chaconine standard solution

圖3 馬鈴薯芽中α-茄堿和α-卡茄堿的色譜圖
Fig.3 Chromatogram of α - solanine and α-chaconine in potato bud

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線與檢出限

分別以質(zhì)量濃度(X, μg/mL)為橫坐標(biāo)、峰面積(Y)為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，α-茄堿和α-卡茄堿的線性方程及其相關(guān)系數(shù)見表2。由表2可以看出在質(zhì)量濃度0.20～200 μg/mL時，2種茄堿的線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)(R2)為0.999 3～0.999 8，滿足定量分析的要求。

表2 α-茄堿和α-卡茄堿的線性方程、相關(guān)系數(shù)(R2)、 及其方法檢出限Table 2 Linear equation, correlation coefficient (R2) and detection limit of α-solanine and α-chaconine

以不含茄堿的新鮮馬鈴薯肉作為空白基質(zhì)，在其中加入低濃度α-茄堿和α-卡茄堿，按照本研究的上述方法進行前處理和分析檢測，以3倍、10倍信噪比分別計算得到本方法中α-茄堿和α-卡茄堿的檢出限均為0.5 mg/kg，定量限均為1.7 mg/kg，說明本方法的靈敏度很高。

2.4 回收率和精密度

選用已測定α-茄堿和α-卡茄堿含量的馬鈴薯芽，分別添加4.0、6.0、10.0 μg/mL 三個質(zhì)量濃度水平的α-茄堿和α-卡茄堿混合標(biāo)準(zhǔn)溶液,配成加標(biāo)樣品，按照上述方法進行前處理，每個加標(biāo)水平的樣品平行測定6次，結(jié)果加標(biāo)回收率為98%～107%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.05%～0.44%(表3)，說明本方法有較高的準(zhǔn)確度和精密度，完全適合馬鈴薯中α-茄堿和α-卡茄堿的分析檢測。

表3 α-茄堿和α-卡茄堿的回收率和精密度Table 3 Recoveries and RSDs of α-solanine and α-chaconine

2.5 馬鈴薯樣品分析

用本方法對馬鈴薯的芽、綠皮、肉、馬鈴薯淀粉、馬鈴薯粉條的5種樣品平行測定2次，平均結(jié)果見圖4，由檢測結(jié)果可看出，馬鈴薯芽中的α-茄堿和α-卡茄堿含量是很高的，在馬鈴薯芽、綠皮、肉、淀粉、粉條依次降低。

圖4 馬鈴薯樣品中龍葵素含量(α-茄堿+α-卡茄堿) 柱形圖
Fig.4 Column chart of α-solanine and α-chaconine content in potato samples

2.6 與液-質(zhì)法的對比

對馬鈴薯的肉、白芽、綠芽分別用本研究方法和土豆及其制品中α-茄堿和α-卡茄堿的測定補充方法中液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀法(BJS201806)進行提取、測定，檢測結(jié)果見表4，可以看出2種方法的檢測結(jié)果的相對偏差為4.0%～8.8%，本研究的液相色譜法檢測的含量均比補充方法BJS201806高。說明本方法能夠更加科學(xué)準(zhǔn)確地測定α-茄堿和α-卡茄堿的含量。

表4 液相色譜法與液相-質(zhì)譜法檢測結(jié)果的對比Table 4 Comparison between the results of liquid chromatography and liquid mass spectrometry

3 結(jié)論

本研究建立了高效液相色譜-二極管陣列檢測器測定馬鈴薯中α-茄堿和α-卡茄堿的方法。利用酸化甲醇提取，以二極管陣列檢測器的全掃描和色譜純度分析進行定性，很大程度解決了現(xiàn)有報道文獻方法中提取不完全、分析檢測不準(zhǔn)確的問題。該方法前處理簡單、靈敏度高，具有良好的精密度、準(zhǔn)確度，可作為馬鈴薯及其制品中α-茄堿和α-卡茄堿監(jiān)測分析，防止馬鈴薯存儲不善而食用后引起的食物中毒事件發(fā)生，該方法可普及到市、縣級基層檢驗檢測機構(gòu)，對于食品安全監(jiān)管具有重要的現(xiàn)實意義。