于佳印，趙庭，劉中美，周麗，周哲敏

(江南大學(xué) 生物工程學(xué)院，江蘇 無錫，214122)

L-天冬氨酸-β-脫羧酶(L-aspartate-β-decarboxylase, EC 4.1.1.12 Asd)又稱L-天冬氨酸-4-脫羧酶，以5′-磷酸吡哆醛(pyridoxal5-phosphatemonohydrate,PLP)為輔酶因子[1-2]，是目前為止自然界中發(fā)現(xiàn)的唯一的氨基酸-β-脫羧酶，可以催化底物L(fēng)-天冬氨酸脫去β位羧基生成L-丙氨酸和CO2，α-酮戊二酸對(duì)其脫羧反應(yīng)具有激活作用[3]。同時(shí)，L-天冬氨酸-β-脫羧酶是一個(gè)多功能酶，具有較低的轉(zhuǎn)氨活性以及β-消除活性[4]。L-天冬氨酸-β-脫羧酶一般以同型十二聚體形式存在，單亞基分子質(zhì)量均為60 kDa左右[5]。已有研究報(bào)道，L-天冬氨酸-β-脫羧酶存在于哺乳動(dòng)物細(xì)胞[6]以及多種微生物中，如假單胞菌[7]、糞產(chǎn)堿菌[8]、糞腸球菌[9]、放線菌[10]以及真菌[11]，目前已用來生產(chǎn)L-丙氨酸和拆分DL-天冬氨酸生產(chǎn)D-天冬氨酸[12]。關(guān)于L-天冬氨酸-β-脫羧酶來源與性質(zhì)的研究始于20世紀(jì)50年代，主要集中在20世紀(jì)70年代至21世紀(jì)初。

L-丙氨酸具有重要的生理功能，如參與糖代謝、在轉(zhuǎn)氨反應(yīng)中提供氨基，并且參與體內(nèi)氨基酸循環(huán)、氨基酸與糖原轉(zhuǎn)換等過程。同時(shí)，L-丙氨酸在日化、醫(yī)藥、食品等領(lǐng)域均有廣泛用途[13]。在日化領(lǐng)域，L-丙氨酸是合成氨基酸表面活性劑的原料[14]；在醫(yī)藥應(yīng)用方面，L-丙氨酸是合成VB6和L-氨基丙醇[15](鹽酸左氧氟沙星合成前體)的主要原料；同時(shí)，L-丙氨酸是復(fù)合氨基酸注射液和輸液的主要成分，也是心肌功能增強(qiáng)劑。它可以用于配制組織培養(yǎng)基和生化試劑，也可用于肝功能檢測(cè)。在食品領(lǐng)域，L-丙氨酸具有甜味和鮮味，能與谷氨酸鈉制成混合調(diào)味品，可調(diào)制并明顯改善食品風(fēng)味，而不破壞食品原有的風(fēng)格[16]。

目前，L-丙氨酸的制備方法主要包括化學(xué)合成法、蛋白質(zhì)水解法、發(fā)酵生產(chǎn)法與酶轉(zhuǎn)化法。酶促反應(yīng)具有催化效率高、反應(yīng)條件溫和、立體選擇性強(qiáng)、綠色環(huán)保節(jié)能減排等優(yōu)點(diǎn)，已經(jīng)被投入到了大規(guī)模的工業(yè)生產(chǎn)當(dāng)中，是如今工業(yè)生產(chǎn)上應(yīng)用最廣泛的合成L-丙氨酸的工藝[17]。2000年，CHEN等[8]首次克隆了AlcaligenesfaecalisCCRC 11585來源的Asd酶，并在大腸桿菌中實(shí)現(xiàn)異源表達(dá)，在45 ℃、pH 5.0條件下該酶具有最高比酶活力215 U/mg。2006年，WANG等[7]克隆并異源表達(dá)了Pseudomonassp.來源的Asd酶，測(cè)得其最適反應(yīng)溫度為45 ℃，40 ℃保溫40 min酶活力剩余為92%，最適反應(yīng)pH值4.5，在pH 4.0～7.0有較好的穩(wěn)定性，比酶活為280 U/mg；2015年，吳四平等[18]對(duì)Alcaligenesfaecalis來源Asd酶在大腸桿菌中進(jìn)行重組表達(dá)，測(cè)得其最適反應(yīng)溫度為45 ℃，在35、40 ℃穩(wěn)定性較好，保溫3 h酶活力幾乎沒有損失；最適反應(yīng)pH值為6.0，同時(shí)在pH 6.0條件下穩(wěn)定性最好。2018年，汪芳[19]將Pseudomonasdacunhae中編碼Asd酶的基因克隆至大腸桿菌中進(jìn)行異源表達(dá)，針對(duì)該酶在低pH條件下酶活力降低的情況進(jìn)行改造，獲得穩(wěn)定性提高的突變體N34D/L484M，比酶活力為116.27 U/mg，比野生型提高76.3%。本文在大腸桿菌中首次重組表達(dá)了不動(dòng)桿菌來源的Asd酶，對(duì)其酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行了研究，擴(kuò)充了Asd酶家族，同時(shí)也為生物轉(zhuǎn)化生產(chǎn)L-丙氨酸的工業(yè)應(yīng)用提供了參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株及質(zhì)粒

菌株E.coliBL21 (DE3)、E.coliJM109與質(zhì)粒pMD 19-T、pET-28a(+)，安徽通用生物系統(tǒng)有限公司；菌株Acinetobacterradioresistens，本實(shí)驗(yàn)室保藏。

1.1.2 試劑及培養(yǎng)基

L-天冬氨酸鈉、L-丙氨酸、異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside，IPTG)、卡那霉素，上海生工生物工程有限公司；PrimeSTAR?Max DNA 聚合酶、限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ、XhoⅠ和T4 DNA連接酶，TaKaRa寶日醫(yī)生物技術(shù)有限公司；細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒、膠回收試劑盒和PCR產(chǎn)物純化試劑盒，Axygen產(chǎn)品；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

E.coli的種子培養(yǎng)基為L(zhǎng)uria-Bertani(LB)培養(yǎng)基，誘導(dǎo)蛋白表達(dá)培養(yǎng)基為Terrific-Broth(TB)培養(yǎng)基。

1.1.3 引物設(shè)計(jì)及合成

根據(jù)GenBank檢索所得的不動(dòng)桿菌(Acinetobacterradioresistens)的L-天冬氨酸-β-脫羧酶基因序列(GeneBank登錄號(hào)為AP019740.1)設(shè)計(jì)引物，分別在引物5′和3′端加入EcoRⅠ、XhoⅠ酶切位點(diǎn)及保護(hù)堿基。引物序列如表1所示。

表1 本研究所用引物序列Table 1 Primers used in this study

注：下劃線部分為限制性內(nèi)切酶酶切位點(diǎn)

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 不動(dòng)桿菌Acinetobacterradioresistens基因組提取

Acinetobacterradioresistens基因組提取方法參考細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒的使用說明。

1.2.2 基因工程菌E.coliBL21/pET28a(+)-ArAsd構(gòu)建

以Acinetobacterradioresistens基因組為模板，以上述引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。將獲得帶有限制性酶切位點(diǎn)的目的基因ArAsd連接載體pMD19T，獲得pMD19T-ArAsd。提取pMD19T-ArAsd用EcoRⅠ、XhoⅠ雙酶切，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳鑒定、回收、純化后，用T4 DNA連接酶連接到同樣經(jīng)過EcoRⅠ、XhoⅠ雙酶切的pET-28a(+)載體上，獲得重組質(zhì)粒pET28a-ArAsd。將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到E.coliBL21 (DE3)感受態(tài)細(xì)胞中，選取含有卡那抗性平板上陽性轉(zhuǎn)化子提取質(zhì)粒酶切驗(yàn)證，得到重組菌E.coliBL21/pET28a(+)-ArAsd，并保存于甘油管中。

1.2.3 重組ArAsd蛋白誘導(dǎo)表達(dá)

將保存于甘油管中的重組菌劃線于帶有卡那抗性的LB平板上，于37 ℃培養(yǎng)12 h；在平板上挑取單菌落接種于5 mL含100 μg/L卡那霉素的LB培養(yǎng)基中，37 ℃、200 r/min培養(yǎng)8 h，以1%接種量轉(zhuǎn)接至含有50 mL TB培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中，培養(yǎng)基中加入終質(zhì)量濃度為100 μg/L的卡那霉素，37 ℃、200 r/min搖床培養(yǎng)至菌體OD600為0.6～0.8，添加終質(zhì)量濃度為0.2 mmol/L的IPTG，30 ℃誘導(dǎo)培養(yǎng)12 h。誘導(dǎo)結(jié)束后，6 000 r/min離心10 min收集菌體，超聲破碎，通過聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE)分析鑒定重組蛋白表達(dá)情況。

1.2.4 重組ArAsd蛋白純化

用結(jié)合緩沖液A(20 mmol/L Na2HPO4、20 mmol/L NaH2PO4、500 mmol/L NaCl、10 mmol/L 咪唑、pH 7.4)懸浮誘導(dǎo)表達(dá)后的菌體，冰浴超聲破碎(功率300 W，破碎3 s，間歇7 s，破碎30 min)，12 000 r/min離心20 min，取上清，用0.22 μm濾膜過濾，即粗酶液。Sepharose His Trap HP用5倍柱體積結(jié)合緩沖液A平衡后，取10 mL上樣，繼續(xù)平衡洗去雜蛋白。使用洗脫緩沖液B(20 mmol/L Na2HPO4、20 mmol/L NaH2PO4、500 mmol/L NaCl、500 mmol/L 咪唑、pH 7.4)梯度洗脫，收集的洗脫液即為純化得到的純酶液，用SDS-PAGE方法分析純化情況，采用Bradford法測(cè)定純化所得蛋白濃度。

1.2.5 Asd酶活力的測(cè)定方法

酶活力定義為在37 ℃，pH 4.5條件下，1 min轉(zhuǎn)化底物生成1 μmolL-丙氨酸所需的酶量為一個(gè)酶活力單位U。

酶活力檢測(cè)反應(yīng)體系：1 mL反應(yīng)體系中，將適量Asd酶液與磷酸緩沖液(50 mmol/L，pH 4.5)混合，并加入終濃度為0.5 mmol/L的PLP、終濃度為1 mmol/L的α-酮戊二酸，混勻后于37 ℃預(yù)熱10 min，后加入終濃度為40 mmol/L的底物L(fēng)-天冬氨酸鈉激活反應(yīng)，于37 ℃水浴反應(yīng)20 min后，煮沸10 min滅活反應(yīng)。

液相檢測(cè)方法[20]：反應(yīng)液于12 000 r/min離心10 min后，取上清通過0.22 μm濾膜過濾，隨后采用異硫腈酸苯酯(phenyl isothiocyanate，PITC)衍生，具體步驟為：取500 μL反應(yīng)液于2 mL離心管中，加入250 μL 1mol/L三乙胺乙腈溶液與250 μL 0.1 mol/L PITC乙腈溶液，充分均勻混合，于室溫避光反應(yīng)衍生45～60 min，加入750 mL正己烷溶液終止反應(yīng)，渦旋振蕩1 min后靜置10 min待溶液分層，吸取下層溶液，經(jīng)0.22 μm有機(jī)濾膜過濾。使用高效液相色譜法檢測(cè)衍生后L-丙氨酸含量。

1.2.6 Asd酶學(xué)性質(zhì)研究

最適反應(yīng)溫度測(cè)定：分別在35、40、45、50、55、60、65、70 ℃條件下測(cè)定Asd的酶活力，將最高酶活力定義為100%，檢測(cè)結(jié)果以Asd相對(duì)酶活力對(duì)溫度作圖呈現(xiàn)。

最適反應(yīng)pH測(cè)定：保持其他反應(yīng)條件不變，反應(yīng)體系中加入相同體積的pH值為3.0、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、7.0、8.0、9.0的緩沖液，于37 ℃條件下反應(yīng)10 min后滅活，檢測(cè)結(jié)果以Asd相對(duì)酶活力對(duì)pH作圖呈現(xiàn)。pH值3.0～8.0采用磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖溶液，pH值7.0～9.0采用Tris緩沖溶液。

熱穩(wěn)定性測(cè)定：取等量純酶液置于0、40、45、50 ℃水浴鍋中溫育，每隔30 min取樣，于冰上冷卻5 min，保持其他反應(yīng)條件不變，按照1.2.4所述方法檢測(cè)酶活力，檢測(cè)結(jié)果以不同溫度下相對(duì)酶活力對(duì)處理時(shí)間作圖呈現(xiàn)。

pH穩(wěn)定性檢測(cè)：取等量純酶液用相同體積的pH值為3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、6.0、7.0、8.0、的緩沖溶液懸浮，于冰上放置12 h，保持其他反應(yīng)條件不變，隨后按照1.2.4所述方法檢測(cè)酶活力，檢測(cè)結(jié)果以不同pH下相對(duì)酶活力對(duì)處理時(shí)間作圖呈現(xiàn)。

動(dòng)力學(xué)常數(shù)測(cè)定：1 mL反應(yīng)體系中，將適量Asd酶液與磷酸緩沖液(50 mmol/L，pH 4.5)混合，并加入終濃度為0.5 mmol/L的PLP、終濃度為1 mmol/L的α-酮戊二酸，混勻后于37 ℃預(yù)熱10 min，后加入終濃度為5、10、15、20、30、40 mmol/L的底物L(fēng)-天冬氨酸鈉，于37 ℃水浴反應(yīng)2 min后，煮沸10 min滅活反應(yīng)。檢測(cè)L-丙氨酸產(chǎn)量，測(cè)定初始反應(yīng)速率。采用GraphPad Prism擬合曲線，測(cè)定酶的Km，kcat，Vmax，kcat/Km。

1.2.7 底物與產(chǎn)物對(duì)重組菌的影響

將重組菌懸浮于50 mmol/L的；磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液(pH 4.5)中，菌體OD600調(diào)至10，加入終濃度為0.3、0.5、1 mol/L的底物或產(chǎn)物，于37 ℃處理1 h后，離心收集菌體并使用去離子水洗滌2遍，然后測(cè)定菌體的剩余酶活力。對(duì)照組底物、產(chǎn)物的濃度為0 mol/L。

2 結(jié)果與分析

2.1 基因工程菌BL21/pET28a-ArAsd的構(gòu)建

以不動(dòng)桿菌(Acinetobacterradioresistens)的基因組為模版，通過PCR擴(kuò)增，獲得大小約為1 602 bp的核酸條帶，與Asd基因理論大小相符，如圖1所示。重組質(zhì)粒pET28a-ArAsd使用EcoRⅠ和XhoⅠ限制性內(nèi)切酶對(duì)重組質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果如圖1泳道3所示，獲得大小約為5 500 bp和1 602 bp的條帶，長(zhǎng)度分別與pET-28a載體和ArAsd基因大小相符，重組質(zhì)粒中的Asd基因以pET28a載體通用引物進(jìn)行測(cè)序，結(jié)果與Acinetobacterradioresistens的Asd基因大小一致。上述結(jié)果表明ArAsd基因已成功連接到pET28a載體質(zhì)粒上。

M-marker；1-目的基因；2-EcoRⅠ酶切載體pET-28a；EcoRⅠ和XhoⅠ雙酶切重組質(zhì)粒
圖1 重組載體pET28a-ArAsd酶切驗(yàn)證
Fig.1 The enzymic digestion of pET28a-ArAsd

2.2 重組Asd酶的誘導(dǎo)表達(dá)與純化

將重組大腸桿菌BL21/pET28a-ArAsd于LB培養(yǎng)基中活化后，以1%的接種量接種于TB液體培養(yǎng)基培養(yǎng)至OD600約為0.8，加入終濃度為0.2 mmol/L的IPTG誘導(dǎo)表達(dá)12 h，收集細(xì)胞進(jìn)行超聲破碎，破碎上清液經(jīng)SDS-PAGE電泳驗(yàn)證(圖2)。電泳圖譜顯示在44.3 kDa與66.4 kDa之間有特異性表達(dá)條帶，與理論相對(duì)分子質(zhì)量60 kDa相符。破碎上清液經(jīng)His Trap HP鎳柱純化，獲得電泳純的目的蛋白(圖2)，可用于進(jìn)一步蛋白性質(zhì)研究。

M-標(biāo)準(zhǔn)蛋白Marker；1-未誘導(dǎo)全細(xì)胞；2-誘導(dǎo)后破碎上清； 3-誘導(dǎo)后破碎沉淀；4-純化后ArAsd
圖2 重組菌BL21/pET28a-ArAsd表達(dá)產(chǎn)物的 SDS-PAGE電泳分析
Fig.2 The SDS-PAGE analysis of expression products in recombinant strain(BL21/PET28a-ArAsd)

2.3 重組Asd酶最適溫度及溫度穩(wěn)定性

酶促反應(yīng)過程中存在酶蛋白熱變性累積效應(yīng)，表現(xiàn)為前期溫度較高時(shí)酶催化效率較高，后期由于蛋白質(zhì)發(fā)生變性，有效酶分子數(shù)量減少，酶促反應(yīng)效率降低。溫度對(duì)ArAsd的酶活力影響如圖3-a所示，其在50 ℃時(shí)達(dá)到最高酶活力。隨著溫度的升高，ArAsd酶活力呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)。從重組Asd酶的熱穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果(圖3-b)可以看出，酶在設(shè)定的溫度下放置3 h，酶活力均有一定程度損失，溫度越高酶活力損失越快。40～45 ℃放置3 h，ArAsd較穩(wěn)定，酶活力剩余70%以上， 50 ℃處理3 h酶活力剩余約為20%。

a-酶活；b-熱穩(wěn)定性
圖3 溫度對(duì)ArAsd酶活力的影響及酶的熱穩(wěn)定性
Fig.3 Effect of reaction temperature on ArAsd activity and thermal stability of the enzyme

2.4 重組Asd酶最適pH及pH穩(wěn)定性

ArAsd的最適pH和pH穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖4所示，隨著pH的增加，其酶活力呈現(xiàn)先增高后降低的趨勢(shì)，且在pH 4.5條件下具有最高酶活力；ArAsd在pH 6.0～7.0有較好的穩(wěn)定性。

a-酶活；b-穩(wěn)定性
圖4 pH對(duì)ArAsd酶活力的影響及酶的pH穩(wěn)定性
Fig.4 Effect of reaction pH on ArAsd activity and pH stability of the enzyme

2.5 動(dòng)力學(xué)常數(shù)

重組純酶ArAsd在常規(guī)測(cè)定條件下(37 ℃，pH 4.5)比酶活力為753 U/mg，較已有報(bào)道Pseudomonassp.[7]來源的Asd比酶活力高1.7倍，較Alcaligenesfaecalis[8]來源的Asd酶高2.5倍。ArAsd酶動(dòng)力學(xué)常數(shù)如表2所示，其Km值較Pseudomonassp.[7]來源Asd酶低8.57 mmol/L，較Alcaligenesfaecalis[8]來源的Asd酶低5.95 mol/L，更易于與底物結(jié)合；同時(shí)，kcat值為Alcaligenesfaecalis[8]來源的Asd酶的2倍，表明其分子活力更高。較高的kcat/Km說明ArAsd具有更高的催化效率。

表2 重組酶ArAsd的動(dòng)力學(xué)參數(shù)Table 2 the kinetic parameters of ArAsd

2.6 底物與產(chǎn)物對(duì)重組菌活性的影響

工業(yè)生產(chǎn)常利用全細(xì)胞作為催化劑進(jìn)行生產(chǎn)，因此，測(cè)定重組菌對(duì)底物與產(chǎn)物濃度的耐受性對(duì)其應(yīng)用的方法選擇有重要影響。其結(jié)果如圖5所示，高濃度底物L(fēng)-天冬氨酸鈉對(duì)全細(xì)胞的酶活力有促進(jìn)作用，產(chǎn)物L(fēng)-丙氨酸濃度高于0.5 mol/L時(shí)會(huì)對(duì)全細(xì)胞催化活性產(chǎn)生抑制作用。

圖5 重組菌對(duì)底物與產(chǎn)物的耐受性
Fig.5 Tolerance of recombinant cell to substrate and product concentrations

3 結(jié)論

Asd酶是工業(yè)上催化L-天冬氨酸生產(chǎn)L-丙氨酸的關(guān)鍵性酶，篩選具有高酶活力、高穩(wěn)定性的Asd酶對(duì)工業(yè)生產(chǎn)L-丙氨酸具有重要意義。本文以pET28a為載體，在大腸桿菌細(xì)胞中重組表達(dá)了不動(dòng)桿菌(Acinetobacterradioresistens)來源的Asd酶，SDS-PAGE電泳圖顯示Asd蛋白成功表達(dá)。對(duì)其進(jìn)行酶學(xué)性質(zhì)測(cè)定，結(jié)果顯示其在50 ℃、pH 4.5時(shí)具有最高比酶活力753 U/mg，50 ℃處理2 h酶活力剩余70%左右，在pH 4.5條件下穩(wěn)定性較差，處理12 h酶活力剩余20%左右。測(cè)定重組全細(xì)胞對(duì)底物與產(chǎn)物濃度的耐受性，結(jié)果顯示高濃度底物L(fēng)-天冬氨酸鈉對(duì)全細(xì)胞催化活性有促進(jìn)作用，產(chǎn)物L(fēng)-丙氨酸濃度高于0.5 mol/L時(shí)會(huì)對(duì)全細(xì)胞催化活性產(chǎn)生抑制作用。