宋陽，王秋菊，楊旭，楊財容，張碩，王芳，劉松青

（成都師范學(xué)院 化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，四川成都 611130）

鹽堿地是指表層含有鹽堿成分且只生長有天然耐鹽植物的土地。我國的鹽堿地面積為9 913萬公頃，約為全世界的10%，主要分布在淮河以北、西北及新疆、青藏高原等內(nèi)陸干旱、半干旱地區(qū)[1]。鹽堿地的形成雖然嚴(yán)重制約了農(nóng)業(yè)發(fā)展，但同時也是很珍貴的土地資源，許多耐鹽堿植物以及大量的微生物繁衍生息在這一特殊的生態(tài)環(huán)境中。鹽堿危害造成大量中、低產(chǎn)田和農(nóng)民貧困，使大面積土壤資源難以被利用，農(nóng)業(yè)的綜合生產(chǎn)能力下降，嚴(yán)重影響了農(nóng)業(yè)生產(chǎn)發(fā)展和農(nóng)民生活水平的提高。鹽堿土壤的修復(fù)是生態(tài)環(huán)境修復(fù)的一個重要方面，但是如今各種改良方法都存在著不足，主要是因為鹽堿土環(huán)境的特殊性，造成某些產(chǎn)酸菌很難在其中生長，并且由于鹽堿土屬于極端環(huán)境，目前的分離方法還不能分離出足夠多的有效菌株，所以能夠應(yīng)用于鹽堿土的微生物菌劑也較少。而研究出來的少數(shù)菌劑由于鹽堿土本身存在的差異，只能在極小的范圍內(nèi)應(yīng)用[2]。

放線菌是一類極其重要的微生物資源[3]。在放線菌的研究進(jìn)程中，一個重要趨勢就是研究極端環(huán)境（包括極端高、低溫，極端高酸、高堿、高鹽、高滲透壓、高輻射等）中的放線菌[4]。放線菌可以合成維生素、纖維素酶、淀粉酶、氨基酸等多種有用的代謝產(chǎn)物，其中很多都已經(jīng)產(chǎn)生巨大的經(jīng)濟(jì)效益[5]。目前，美國、日本以及歐洲的許多國家都相繼啟動了極端微生物的研究。1941年，Darling等[6]調(diào)查南極的微生物區(qū)系時，就分離出了能在-60～0℃生長的鏈霉菌及諾卡氏菌，而極端環(huán)境中放線菌的研究真正始于20世紀(jì)70年代。1982年，歐洲無細(xì)胞壁極端微生物實驗室（European Laboratory Without Walls on Extremophiles）對極端環(huán)境中的微生物進(jìn)行了廣泛的研究[7]。1993年，德國召開了第一次極端環(huán)境微生物大會[8]。與此同時，一個關(guān)于極端環(huán)境微生物的研究計劃（Aguilar 1996）又在歐盟各國開始實施，使國際上對極端環(huán)境微生物的研究工作得到了極大的加強(qiáng)[9]。1999年，云南大學(xué)省微生物所召開的第一屆國際極端環(huán)境放線菌生物學(xué)討論會，極大地推動了極端環(huán)境放線菌領(lǐng)域的研究[10]。最近20年來，極端環(huán)境微生物的研究受到了更廣泛的重視。本實驗采用同時提高鹽堿度的方法來對放線菌進(jìn)行篩選，以篩選出同時具備抗鹽和抗堿雙重特性的菌種，并將篩選到的高效率抗鹽堿菌進(jìn)行相關(guān)鑒定。期望通過研究新疆鹽堿地區(qū)的放線菌，為極端環(huán)境微生物的研究和微生物菌劑的制備打下基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 土壤樣品

鹽堿土壤樣品共9份，均采自新疆鹽堿地，采集土樣均為0～12cm的表層土，無菌袋分裝帶回放于實驗室4℃冰箱中保存，分別編號1～9，土壤樣品的詳細(xì)信息如表1所示。

1.1.2 培養(yǎng)基

改良高氏一號培養(yǎng)基、高氏一號瓊脂培養(yǎng)基、淀粉水解瓊脂、柴斯納培養(yǎng)基、黑色素產(chǎn)生培養(yǎng)基、纖維素培養(yǎng)基、硝酸鹽還原培養(yǎng)基、明膠液化培養(yǎng)基、碳源利用試驗培養(yǎng)基、氮源利用基礎(chǔ)培養(yǎng)基、牛奶凝固與胨化培養(yǎng)基[11-12]等按文獻(xiàn)配制。

1.2 試驗方法

1.2.1 分離方法

采用土壤懸液稀釋涂布平板法分離菌種：從混勻了的各備用土樣中隨機(jī)取土樣5 g，加入烘箱中進(jìn)行120℃烘干處理1h[11]。從中稱取2g，加入盛有18 mL無菌水的 100 mL 錐形瓶中，置 28 ℃、150 r/min 搖床上培養(yǎng)1 h。取搖勻的土樣懸液0.2 mL涂布于分離平板上，28 ℃培養(yǎng)2周。

1.2.2 菌種純化與保藏

在28 ℃條件下，自培養(yǎng)了2周的平板上挑取單菌落，接種于改良高氏一號培養(yǎng)基平板上，用劃線法純化菌株，并挑取純化菌株的單菌落接種于改良高氏一號培養(yǎng)基相同的斜面上作為菌種的初步保藏。將純化后的菌株用高氏一號液體培養(yǎng)基在28 ℃、150 r/min搖床中培養(yǎng)3～5 d，配制濃度50%的甘油，將甘油與菌液按體積比1∶1混合，保藏于-80℃冰箱中。

1.2.3 NaCl耐受實驗

采用含有5%、10%、12%、14%、16%、18%及20% NaCl梯度的改良高氏一號培養(yǎng)基，28 ℃培養(yǎng)5～10 d后，觀察各放線菌菌株的生長狀況。

1.2.4 耐堿實驗

保持改良高氏一號培養(yǎng)基NaCl濃度（5%）不變，分別調(diào) pH 至 9、10、11、12，28 ℃培養(yǎng) 5～10d，觀察各菌株的生長狀況。

表1 不同鹽堿代表區(qū)的土壤樣品

1.2.5 耐鹽堿實驗

以改良高氏一號培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，同時提高NaCl和pH值，即培養(yǎng)基鹽濃度提高為5%、10%、15%、20%，pH分別對應(yīng)為9、10、11、12，28 ℃培養(yǎng)5～10d，觀察各菌株的生長狀況。

1.3 耐鹽堿放線菌的初步鑒定和劃分

1.3.1 形態(tài)及培養(yǎng)特征觀察

利用插片法[12-13]把滅菌蓋玻片插于有放線菌的改良高氏一號平板，每個平板插3片，培養(yǎng)7～10d后，在電子顯微鏡下觀察，記錄好菌株的培養(yǎng)特征。

1.3.2 生理生化鑒定

淀粉水解試驗、硫化氫產(chǎn)生試驗、黑色素產(chǎn)生試驗、纖維素分解試驗、硝酸鹽還原試驗、明膠液化試驗、唯一碳源和氮源的利用試驗、生態(tài)條件試驗等參照文獻(xiàn)[14]。

2 結(jié)果與分析

2.1 樣品粗篩結(jié)果

從新疆9個鹽堿區(qū)帶回的土壤中，通過高氏一號培養(yǎng)基進(jìn)行富集培養(yǎng)，并用改良高氏一號培養(yǎng)基進(jìn)行菌株的篩選，純化2～3次。每個土壤設(shè)置3個梯度，3個重復(fù)。最后從9個土壤樣品中初步篩選出了19株耐鹽堿菌，斜面保種備用，并以地區(qū)編號依次命名。

由表2可以看出，從鞏留縣伊利沙土、鞏留縣伊利沙地、輪臺果樹資源鋪這3個地區(qū)篩選出的耐鹽堿菌最少，均只有一株；而輪臺沙地、輪臺棉花地、呼圖壁縣邊棉花地和博樂叉口4地均篩出了3株菌。

表2 不同地區(qū)初篩耐鹽堿菌株結(jié)果

2.2 復(fù)篩純化及鹽堿耐受度分析

為探究19株菌對鹽堿的耐受度，對初篩菌株進(jìn)行鹽與堿的耐受度試驗。根據(jù)在同等實驗條件下，菌株的生長狀況、生長大小等標(biāo)準(zhǔn)對菌株耐鹽、耐堿結(jié)果進(jìn)行判斷并記錄，記錄結(jié)果如表3所示。

由表3可以看出，耐鹽實驗中，菌株1-1、1-2、3-1、6-1、6-2、6-3、7-1、8-1、8-2、8-3、9-2在不同鹽度耐受度實驗中都能生長良好；菌株4-1、5-3、7-2、9-3對高鹽環(huán)境的適應(yīng)性差，隨著鹽度的提高，逐步表現(xiàn)為不能生長。耐堿實驗中，菌株2-1、3-1、4-1、6-2、6-3、7-1、8-2、9-1、9-2 等在不同濃度的堿環(huán)境中均能正常生長，而菌株5-2、8-1隨著堿濃度的提高，逐步表現(xiàn)為不能生長。

表3 不同菌株對鹽或堿耐受度的實驗結(jié)果

2.3 耐鹽堿實驗結(jié)果及分析

為篩選出同時具備耐鹽及耐堿作用的菌株，對菌株進(jìn)行耐鹽堿實驗。菌株4-1、5-2、7-2、9-3在單一耐鹽實驗中隨著鹽度的提高，表現(xiàn)為不能生長。對除去這4株菌以外的菌株進(jìn)行鹽堿耐受試驗。在同等試驗條件下，根據(jù)菌株的生長狀況、生長大小等標(biāo)準(zhǔn)對菌株耐鹽堿結(jié)果進(jìn)行判斷及記錄，記錄結(jié)果如表4所示。

表4與表3相比，菌株在鹽堿的雙重作用下，只有菌株1-1、5-1、5-2、6-1、8-1、8-3、9-2能夠正常生長，表現(xiàn)為既耐堿又耐鹽，可能是由于高鹽堿環(huán)境使得菌株體內(nèi)的耐鹽堿機(jī)制發(fā)生了變化。其中菌株8-3對鹽堿的耐受度表現(xiàn)最佳，在鹽濃度為20%、pH值為12的培養(yǎng)基中也能生長。其中，菌株7-1在不同鹽堿度的培養(yǎng)基中生長狀況均表現(xiàn)為最差。

表4 各菌株在不同濃度的鹽堿環(huán)境中的生長狀況

2.4 菌種生理生化鑒定結(jié)果

根據(jù)耐鹽堿實驗的結(jié)果，挑選了6株菌進(jìn)行生理生化鑒定。

2.4.1 形態(tài)觀察及培養(yǎng)特征

利用高氏一號培養(yǎng)基培養(yǎng)菌株，進(jìn)行初步的形態(tài)特征及培養(yǎng)特征的觀察。觀察結(jié)果如表5所示。各菌株在高氏一號培養(yǎng)基上的生長狀況和培養(yǎng)特征具有很大的差異，因此為了進(jìn)一步對各菌株進(jìn)行鑒定。對各菌株進(jìn)行了生理生化鑒定實驗。

2.4.2 生理生化鑒定結(jié)果

對挑選出的各菌株進(jìn)行生理生化鑒定，其試驗的結(jié)果如表6所示。所有的菌株均能使明膠液化，除8-1以外各菌株均能利用不同的碳源，除菌株5-1以外所有的菌株均不能產(chǎn)黑色素，不同的菌株在生理生化鑒定中表現(xiàn)出不同的理化反應(yīng)，可以判斷以上菌株屬于不同的屬或種。

表5 各菌株形態(tài)特征及培養(yǎng)結(jié)果

表6 各菌株生理生化鑒定結(jié)果

由表7可以看出，菌株5-2能利用所有的氮源，而菌株8-1對各氮源的利用表現(xiàn)為最少。其余菌株均能對不同的氮源進(jìn)行利用。

由表8可以看出，菌株1-1、5-1隨著溫度的升高，生長受到抑制；菌株5-2能夠在不同的溫度下正常生長，不受溫度的限制；菌株6-1在25 ℃時表現(xiàn)為不能生長，隨著溫度的升高表現(xiàn)為正常生長；菌株8-3在25～45 ℃下能夠正常生長，當(dāng)溫度高于45 ℃時，生長受到抑制。

根據(jù)閻遜初1992年出版的《放線菌的分類與鑒定》以及《鏈霉菌鑒定手冊》[15]對上述6株菌進(jìn)行初步分類和鑒定，結(jié)合菌株形態(tài)及生理生化反應(yīng)結(jié)果進(jìn)行分析。經(jīng)過初步鑒定，6株菌的初步鑒定結(jié)果為1-1、5-1、8-1屬于擬諾卡氏菌屬（Nocardiopsis），5-2、6-1屬于鏈霉菌屬（Streptomyces），8-3屬于諾卡氏菌屬（Nocardia）。

表7 各菌株的唯一氮源利用試驗結(jié)果

表8 各菌株在不同溫度下的生長狀況

3 結(jié)論與展望

從新疆鹽堿地區(qū)帶回9份供試土壤，對其進(jìn)行放線菌的篩選、分離和鑒定，以期從中篩選出能夠耐高鹽堿的放線菌。通過高氏一號培養(yǎng)基從9份土壤中分離純化得到了19株放線菌，通過鹽濃度耐受試驗、堿濃度耐受試驗以及鹽堿耐受試驗，最終從中挑選出了6株效果最好的菌。通過對6株放線菌的形態(tài)特征觀察、培養(yǎng)特征觀察以及生理生化鑒定，最終初步鑒定出這6株菌有擬諾卡氏菌屬3株，鏈霉菌屬2株，諾卡氏菌屬1株。

由于實驗室的條件限制以及鹽堿土壤保存時間過長的原因，只從9份供試土壤中挑選出了6株耐鹽堿放線菌。對于這6株菌的鑒定也只完成了生化反應(yīng)的部分，目前只得到了各菌株的屬，想要知道他們真正屬于哪個種，則還需要對菌株進(jìn)行分子方面的研究。因此，菌株鑒定方面還存在一定的缺陷。且由于供試土壤長期存放在冰箱中，一些菌株不能通過稀釋平板法分離出來，可能土壤中還存在很多耐鹽堿效果更好的菌株。從鹽堿土壤微生物資源中分離篩選、開發(fā)出功能微生物，將會為改良鹽堿土壤、藥物研究、發(fā)酵工業(yè)等領(lǐng)域提供新的資源，為農(nóng)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展、生態(tài)環(huán)境的保護(hù)等方面提供重要依據(jù)。