張琳，李玥，張玉娟

(山東中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，山東 濟南 250014)

僵蠶，別名天蟲、姜蠶，又名白僵蠶，為蠶蛾科昆蟲家蠶(BombyxmoriL.)4～5齡的幼蟲感染(或人工接種)白僵菌[Beauveriabassiana(Bals.)Vuill ant]而致死的干燥體。僵蠶具熄風(fēng)解痙、化痰散結(jié)、祛風(fēng)止痛、活血通絡(luò)等多種功效,目前多用于治療癲癇、頑固性頭痛等疾病?，F(xiàn)代藥理實驗證實，其水提取液有較強的抗凝、抗血栓、促纖溶等作用，其主要活性成分可能為草酸銨、蛋白質(zhì)(或多肽)或氨基酸等[1-5]。有文獻報道[6-7]，白僵蠶水解后含有 17種氨基酸，甘氨酸Gly最高，其次為丙氨酸Ala、絲氨酸Ser和蘇氨酸Tyr，而精氨酸Arg最低；另有報道稱，僵蠶水解液中共有15種氨基酸殘基，其中谷氨酸Glu殘基最高，其次為精氨酸Arg、丙氨酸Ala和甘氨酸Gly，而蛋氨酸Met含量最低。

20世紀90年代，仿生提取法既已用于天然藥物以及中藥的輔助提取。在已有的動物藥提取工藝研究中，水蛭仿生酶提取法與水提法相比，其提取液的抗凝活性更強；土鱉蟲仿生酶解技術(shù)提取更充分，提取物活性更強；僵蠶粉末仿生胃液中化學(xué)成分的溶出性能優(yōu)于煎液[8-11]。為進一步探究僵蠶的抗凝活性成分，本研究以抗凝活性為指標(biāo)，通過試驗篩選出提取僵蠶的最佳工藝流程，然后采用高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(HPLC-MS/MS)平臺對僵蠶仿生提取液的抗凝成分結(jié)構(gòu)進行初步分析，為僵蠶抗凝活性成分的進一步研究提供基礎(chǔ)。

1 實驗材料

1.1 藥材 僵蠶，市售，經(jīng)山東中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院張學(xué)順教授鑒定為蠶蛾科昆蟲家蠶(BombyxmoriL.)4～5齡的幼蟲感染白僵菌而致死的干燥體。

1.2 儀器 液相質(zhì)譜聯(lián)用系統(tǒng)(美國Thermo Fisher UltiMate 3000液相色譜系統(tǒng)和Thermo Fisher Q Exactive高分辨率質(zhì)譜)；電子天平(01193-YP601N 型，上海精密科學(xué)儀器有限公司)；高速離心機(d-37520，Thermo Electron LED GmbH Osterode)；pH計(PB-10，Sartorius)；磁力加熱攪拌器(78-1型，金壇市杰瑞爾電器有限公司)；水浴恒溫振蕩器(SHZ-82型，北京市永光明醫(yī)療儀器有限公司)；電熱恒溫水浴鍋(北京市永光明醫(yī)療儀器有限公司)。

1.3 試劑 胃蛋白酶(1∶1200，國藥集團化學(xué)試劑有限公司，批號20130913)；甲酸、乙腈為色譜純；其他試劑均為分析純，水為超純水。

2 方法

2.1 僵蠶提取方法 精密稱取僵蠶粉末5 g，胃蛋白酶0.667 g ，加水150 mL(加鹽酸調(diào)節(jié)至pH 2.0)，于(47±1)℃水浴提取2 h，濾過、濃縮至生藥量100 mg·mL-1。濃縮后提取液以3 000 rpm轉(zhuǎn)速離心15 min，取上清液用超純水定容至50 mL，即得僵蠶胃蛋白酶提取液。

2.2 HPLC-MS/MS分析測定

2.2.1 供試品的制備 按照“2.1”項下胃蛋白酶提取法得僵蠶提取液，超濾后得相對分子量為500～1 000的樣品，0.22 μm濾膜、過濾，即得供試品溶液。

2.2.2 色譜條件 色譜柱Halo C18柱(2.1 mm×100 mm,2.7 μm)；流速0.3 mL·min-1；柱溫45 ℃，進樣室：4 ℃；流動相(A：0.05%甲酸-水溶液；B：0.05%甲酸-乙腈溶液)。線性梯度洗脫條件：0～25 min：5%B～20%B；25～40 min：20% B～50% B；40～41 min：50%B～99%B；41～45 min：99%B；45～45.01 min：99%B～5%B；45.01～55 min：5%B。

2.2.3 質(zhì)譜條件 電噴霧離子源(electrosprayionization,ESI)正離子模式全掃描檢測，噴霧電壓：3.0 kV；鞘氣流速：45 arb；輔助氣流速：10 arb；；輔助氣耐熱溫度：30 ℃；離子傳輸管溫度：275 ℃；質(zhì)譜分辨率：70 000 FWHM(m/z 200)；自動增益控制AGC：3e6；最大注入時間IT：200 ms；全掃描質(zhì)量范圍為100～1 200；二級質(zhì)譜碰撞能為30%。

3 僵蠶胃蛋白酶提取液液相色譜質(zhì)譜分析

圖1A和圖1B分別為僵蠶酶解液的總離子流TIC和蛋白多肽圖，由圖可知，僵蠶提取液的酶解多肽類成分主要分布在42～47 min。

現(xiàn)對總離子流圖中42.82 min(Ⅰ)、43.22 min(Ⅱ)、44.34 min(Ⅲ)、46.33 min(Ⅳ)4個色譜峰進行氨基酸序列解析。根據(jù)精確質(zhì)量數(shù)掃描結(jié)果，圖2～5一級質(zhì)譜圖中離子m/z 1 012、m/z 1 155、m/z 969.2、m/z 1 180均為單電荷離子。根據(jù)氮律及氨基酸殘基分子量推斷，多肽Ⅰ為相對分子質(zhì)量為1 011的九肽，多肽Ⅱ為相對分子質(zhì)量為1 154的十肽，多肽Ⅲ為相對分子質(zhì)量為968.2的八肽，多肽Ⅳ為相對分子質(zhì)量為1 179的十肽[6～9]。

根據(jù)多肽Ⅰ的一級質(zhì)譜和二級質(zhì)譜疊加圖(見圖2)中的特異性碎片離子m/z 1 012、m/z 638.6、m/z 466.7、m/z 187.9，推斷Ⅰa離子有5種情況：一分子甘氨酸Gly(75 Da)、一分子丙氨酸Ala(89 Da)、兩分子天冬酰胺Asn(132 Da)；一分子甘氨酸Gly(75 Da)、一分子丙氨酸Ala(89 Da)、一分子纈氨酸Val(117 Da)、一分子谷氨酸Glu(147 Da)；一分子甘氨酸Gly(75 Da)、一分子丙氨酸Ala(89 Da)、一分子亮氨酸Leu(131 Da)或異亮氨酸Ile(131 Da)、一分子天冬氨酸Asp(133 Da)；兩分子甘氨酸Gly(75 Da)、一分子亮氨酸Leu(131 Da)或異亮氨酸Ile(131 Da)、一分子谷氨酸Glu(147 Da)；兩分子甘氨酸Gly(75 Da)、一分子賴氨酸Lys(146 Da)或谷氨酰胺Gln(146 Da)、一分子天冬酰胺Asn(132 Da)。Ⅰb離子為一分子脯氨酸Pro(115 Da)、一分子甘氨酸Gly(75 Da)組成。Ⅰc離子有3種情況：一分子丙氨酸Ala(89 Da)、一分子絲氨酸Ser(105 Da)、一分子半胱氨酸Cys(121 Da)；一分子甘氨酸Gly(75 Da)、一分子蘇氨酸Thr(119 Da)、一分子半胱氨酸Cys(121 Da)；三分子絲氨酸Ser(105 Da)。

綜上所述，采用同樣的方法根據(jù)圖3～5對多肽Ⅱ、多肽Ⅲ、多肽Ⅳ進行肽鏈結(jié)構(gòu)分析，結(jié)果見表1。

4 結(jié)論和討論

4.1 近幾年來，由1～10個氨基酸組成的寡肽已經(jīng)引起了廣泛的研究和重視，寡肽可直接參與組織蛋白的合成，具有免疫、抗氧化、抗病毒、抗腫瘤、誘導(dǎo)細胞凋亡等多種藥理作用，而且人體各臟器也可完整的利用寡肽。通過對僵蠶胃蛋白酶提取液的LC-MS/MS檢測，根據(jù)所得的質(zhì)譜圖，我們對僵蠶酶解多肽的一級結(jié)構(gòu)進行了初步的推斷，認為僵蠶胃蛋白酶提取液中主要的抗凝活性成分為氨基酸數(shù)低于10的寡肽。

表1 酶解多肽的氨基酸序列分析

4.2 本研究在氨基酸序列推斷中發(fā)現(xiàn)，僵蠶胃蛋白酶提取液中可以確定含有的氨基酸有Gly、His、Asn、Ala、Met、Pro、Ile/Leu、Glu、Cys、Asp、Tyr，這與文獻報道的僵蠶水提液氨基酸組成存在一定的差異性[6-7]。課題組已通過體內(nèi)外藥理實驗證實僵蠶仿生酶提取液比水提液具有更高的抗凝活性，其中胃蛋白酶提取法最優(yōu)。因此推測胃蛋白酶提取液與水提液抗凝活性差異不僅是因為溶出增多，同時也因為酶解作用產(chǎn)生了新的活性多肽。

4.3 目前串聯(lián)質(zhì)譜法已成為多肽類藥物氨基酸序列測定的主要工具，但高分辨準(zhǔn)確質(zhì)量的碎片離子峰是測序的關(guān)鍵，多肽樣品的穩(wěn)定是測序的前提。本研究在采用串聯(lián)質(zhì)譜手動分析法進行多肽氨基酸的測序過程中，由于離子信息的不完整，存在無法鑒別的碎片離子峰，同時也可能由于多肽的不穩(wěn)定性，導(dǎo)致多肽樣品氨基酸序列未能最終確定。隨著相關(guān)測序軟件的完善及質(zhì)譜技術(shù)的不斷發(fā)展，串聯(lián)質(zhì)譜法在多肽結(jié)構(gòu)分析中將發(fā)揮更大的作用，我們也將采用新的技術(shù)對活性多肽的結(jié)構(gòu)進行更加深入的分析。