王艷華 池景良 鐘麗娟

（遼寧省微生物科學(xué)研究院，遼寧朝陽122000）

沙棘又名醋柳、酸刺、黑刺，沙棘屬落葉灌木或小喬木。莖、葉、花、果均具珍貴的經(jīng)濟(jì)價(jià)值[1]。由于其含有豐富的維生素、多糖、蛋白質(zhì)、氨基酸、微量元素等營養(yǎng)成分以及黃酮類、甾體類化合物、原花青素、三萜烯類、鞣質(zhì)、5-羥色胺等生物活性物質(zhì),具備藥食同源的特性，在保健品、食品等開發(fā)研究方面得到廣泛重視[2-4]。

隨著沙棘加工產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，沙棘果渣大量產(chǎn)生，極少部分直接進(jìn)行了動(dòng)物飼喂，絕大部分直接丟棄沒有充分利用。

沙棘果渣是沙棘果榨汁后的殘?jiān)?，約占沙棘果鮮重的20%，在動(dòng)物營養(yǎng)、抗氧化和免疫方面有極大的利用價(jià)值[5]。沙棘果渣有兩種，一種是沙棘鮮果榨汁后剔除果核(種子)的果肉果皮殘?jiān)?一種是沙棘種子提取沙棘油后的殘?jiān)?。?jīng)研究表明，沙棘果渣中依舊含有多種必需氨基酸和微量元素，黃酮的含量甚至?xí)哌^沙棘汁和沙棘油中的黃酮[6-7]。黃酮類化合物是一種很有效的活性氧清除劑和脂質(zhì)抗氧化劑，具有較強(qiáng)清除自由基的能力，能有效地清除超氧陰離子和羥自由基，因而有很好的抗衰老功能[8-9]。

沙棘果渣中含有豐富的黃酮、維生素B1、維生素B2、維生素C、維生素E、氨基酸、粗蛋白、粗脂肪、粗纖維、鞣質(zhì)、糖、三萜及甾體類等成分[10-13]。國內(nèi)外大量試驗(yàn)證明，在雞、豬、牛、羊、兔等畜禽的飼料中加入一定數(shù)量的沙棘果渣，可以促進(jìn)生長，降低發(fā)病率，提高肉或蛋的品質(zhì)，又可以降低飼料成本，是優(yōu)質(zhì)而且價(jià)格低廉的飼料[14-17]。沙棘果渣長期飼喂動(dòng)物安全可靠，無蓄積性毒害，對(duì)畜禽的生長、生產(chǎn)性能具有不同程度的促進(jìn)作用，提高飼料利用率和蛋黃胡蘿卜素含量，并有降低膽固醇，促進(jìn)免疫器官生長發(fā)育，提高機(jī)體抗病力的作用，是畜禽極其理想，價(jià)廉質(zhì)優(yōu)的添加飼料。利用沙棘制品殘?jiān)鳛檠a(bǔ)充飼料，既增加了優(yōu)質(zhì)飼料來源，提高了乳、肉、蛋品的數(shù)量和質(zhì)量，又有益于公共衛(wèi)生，具有顯著的生產(chǎn)效益和社會(huì)效益[18]。

本實(shí)驗(yàn)利用固態(tài)生物發(fā)酵技術(shù)，采用地衣芽孢桿菌、產(chǎn)朊假絲酵母、白地霉三株菌株混菌發(fā)酵，對(duì)沙棘果渣進(jìn)行固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)生物飼料的研究，發(fā)揮多菌株間的協(xié)同作用，降解了果渣本身含有的果膠及纖維素等物質(zhì)，提高了菌體蛋白含量，并具有益生特性，使以沙棘果渣為主料的發(fā)酵料兼具微生態(tài)制劑與蛋白飼料雙重功效的綠色生物飼料。

中國農(nóng)業(yè)農(nóng)村部第194 號(hào)文件規(guī)定從2020 年起飼料中全面禁止使用藥物飼料添加劑，飼料端全面禁抗開始，含有活菌制劑的生物飼料必將發(fā)揮更加重要的作用。利用沙棘果渣為主料發(fā)酵生產(chǎn)生物飼料，減少了資源浪費(fèi)和環(huán)境污染問題，拓展了沙棘果渣綜合利用的新途徑，具有積極的經(jīng)濟(jì)及社會(huì)效益。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種

地衣芽孢桿菌、產(chǎn)朊假絲酵母、白地霉，均來自遼寧省微生物科學(xué)研究院菌種保藏中心。

1.1.2 沙棘果渣

遼寧省建平縣沙棘制品廠提供，原料分析結(jié)果見表1。

從表1 看出沙棘皮渣、籽渣成分含量有一定差異，但總體差異并不顯著，一般的生產(chǎn)廠家皮渣、籽渣同時(shí)產(chǎn)生，故本實(shí)驗(yàn)采用上述2種的等量混合皮渣。

表1 沙棘皮渣、籽渣主要成分分析(%)

1.1.3 培養(yǎng)基

1.1.3.1 試管培養(yǎng)基

地衣芽孢桿菌，編號(hào)Y-03。LB 培養(yǎng)基：蛋白胨10 g、酵母膏5 g、NaCl 10 g、蒸餾水1 000 ml、瓊脂粉15 g，pH值為7.0。產(chǎn)朊假絲酵母，編號(hào)B-05。麥芽汁培養(yǎng)基。白地霉，編號(hào)S-01。麥芽汁培養(yǎng)基。

1.1.3.2 液體發(fā)酵培養(yǎng)基

地衣芽孢桿菌LB培養(yǎng)基（g∕l）：蛋白胨10 g、酵母膏5 g、氯化鈉10 g，pH值為7.0。

產(chǎn)朊假絲酵母YPD 培養(yǎng)基（g∕l）：蛋白胨20 g、酵母浸膏10 g、葡萄糖20 g，pH值為6.5。

白地霉YPD 培養(yǎng)基（g∕l）：蛋白胨20 g、酵母浸膏10 g、葡萄糖20 g，pH值為6.5。

1.1.4 主要設(shè)備

SPH-2102 恒溫培養(yǎng)搖床、PHS-3C 型酸度計(jì)、SPX-450 型恒溫培養(yǎng)箱、OLMPUS CX41 顯微鏡、KDN-08A定氮儀。

1.2 方法

1.2.1 菌種培養(yǎng)方法

1.2.1.1 地衣芽孢桿菌

斜面菌種：35 ℃培養(yǎng)24 h。

液體菌種：裝液量為100 ml∕500 ml，35 ℃，160 r∕min搖床培養(yǎng)36 h。

1.2.1.2 產(chǎn)朊假絲酵母

斜面菌種：30 ℃培養(yǎng)48 h。

液體菌種：裝液量為100 ml∕500 ml，30 ℃，160 r∕min搖床培養(yǎng)24 h。

1.2.1.3 白地霉

斜面菌種：30 ℃培養(yǎng)48 h。

液體菌種：裝液量為100 ml∕500 ml，30 ℃，200 r∕min搖床培養(yǎng)48 h。

1.2.2 沙棘皮渣固體發(fā)酵培養(yǎng)方法

將培養(yǎng)好的液體菌種按一定接種量接入配好的固體物料中，加入營養(yǎng)鹽，按一定水分含量拌勻，鋪于層架的屜層上，培養(yǎng)前期可上蓋滅菌的濕紗布，控制環(huán)境濕度80%左右，30 ℃恒溫恒濕固態(tài)培養(yǎng)，每天通風(fēng)換氣2～3次，每次20～30 min。

1.2.3 蛋雞飼喂實(shí)驗(yàn)

1.2.3.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和日糧組成

實(shí)驗(yàn)選擇60周齡海蘭褐蛋雞2 880只，隨機(jī)分為6 組，每組3 個(gè)重復(fù)，1 到5 組在基礎(chǔ)日糧中分別添加1%、2% 、3%、4%、5%沙棘發(fā)酵飼料，對(duì)照組飼喂玉米-豆粕型基礎(chǔ)日糧；預(yù)試期7 d，正式飼喂期35 d，實(shí)驗(yàn)期共42 d?；A(chǔ)日糧參照中華人民共和國蛋雞飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)配制，其組成及營養(yǎng)水平見表2。

表2 基礎(chǔ)飼糧組成及營養(yǎng)水平(風(fēng)干基礎(chǔ))

1.2.3.2 飼養(yǎng)管理

采用3 階梯式籠養(yǎng)，每組又分上中下三層，預(yù)試期7 d，按照蛋雞飼養(yǎng)方法正常管理，自由采食、自由飲水，日投料4次，揀蛋2次。

1.2.3.3 測(cè)定項(xiàng)目

分別統(tǒng)計(jì)日產(chǎn)蛋率、平均蛋重、蛋黃色澤、破損量、軟蛋量、料蛋比、只日采食量等。

1.2.4 測(cè)定方法

粗蛋白質(zhì)測(cè)定采用GB∕T 6432—94《飼料中粗蛋白測(cè)定方法》，粗纖維測(cè)定采用GB∕T 6434—94《飼料中粗纖維含量的測(cè)定方法》，粗灰分測(cè)定采用GB∕T 6438—92《飼料中粗灰分的測(cè)定方法》，粗脂肪測(cè)定采用GB∕T 6433—2006《飼料中粗脂肪的測(cè)定》，細(xì)胞數(shù)檢測(cè)采用生物學(xué)活菌計(jì)數(shù)法，pH值用酸度計(jì)測(cè)定。蛋黃色澤的測(cè)定采用羅氏比色扇比色法（RYCF）。

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析采用SPSS16.0軟件對(duì)各組數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 沙棘果渣占整個(gè)物料配比的確定

設(shè)計(jì)沙棘果渣的不同配比，按照合適的發(fā)酵碳氮比加入其他輔料，加入定量的液體菌種，30 ℃培養(yǎng)，進(jìn)行培養(yǎng)情況觀察、培養(yǎng)物活菌細(xì)胞數(shù)及粗蛋白含量檢測(cè)，結(jié)果見表3。

從表3結(jié)果可以看出，果渣配比超過70%時(shí)物料生長明顯變差，說明過高比例的沙棘果渣不利于菌體生長，配比低于40%時(shí)生長相對(duì)稍差一些，結(jié)合細(xì)胞數(shù)及粗蛋白2 個(gè)項(xiàng)目指標(biāo)，果渣配比占整個(gè)物料的40%～70%時(shí)最適宜，此時(shí)發(fā)酵料細(xì)胞數(shù)及粗蛋白均較高，細(xì)胞數(shù)最高可達(dá)44億個(gè)∕g以上，粗蛋白含量可達(dá)39%以上。

2.2 菌種配比對(duì)發(fā)酵的影響

表3 沙棘果渣占整個(gè)物料配比的確定

設(shè)計(jì)3 個(gè)菌種的不同配比，總接種量按10%加入，進(jìn)行培養(yǎng)情況觀察、培養(yǎng)物活菌細(xì)胞數(shù)及粗蛋白檢測(cè)，結(jié)果見表4。

從表4可以看出，菌種的不同配比及加入量對(duì)發(fā)酵料的細(xì)胞數(shù)及粗蛋白有較大的影響，3 個(gè)菌種同時(shí)加入時(shí)，菌體生長最好，三個(gè)菌種同時(shí)在發(fā)酵料中生長，細(xì)胞數(shù)可達(dá)到最大42.61 億個(gè)∕g，粗蛋白可達(dá)38%以上。產(chǎn)朊假絲酵母和白地霉對(duì)原料無機(jī)氮的轉(zhuǎn)化及菌體蛋白的提高有較大的影響，可以促進(jìn)無機(jī)氮轉(zhuǎn)化為有機(jī)氮，提高菌體蛋白含量。

表4 菌種配比對(duì)發(fā)酵的影響

2.3 培養(yǎng)基水分含量對(duì)發(fā)酵的影響

設(shè)計(jì)培養(yǎng)物不同的水分含量，進(jìn)行培養(yǎng)情況觀察、培養(yǎng)物活菌細(xì)胞數(shù)及粗蛋白檢測(cè)，結(jié)果見表5。

從表5可以看出，培養(yǎng)料水分含量為50%～55%時(shí)菌體生長情況較好，最適水分含量為55%，此時(shí)菌體生長最好，發(fā)酵料細(xì)胞數(shù)及粗蛋白含量均較高。水分含量低于50%時(shí)菌體生長變差；高于60%時(shí)生長變慢，同時(shí)伴隨染雜菌現(xiàn)象。

表5 不同水分含量對(duì)發(fā)酵的影響

2.4 培養(yǎng)料初始pH值的確定

設(shè) 計(jì) 初 始pH 值 實(shí) 驗(yàn) 配 方，用1 mol∕l 的HCl 或1 mol∕l NaOH 調(diào)節(jié)培養(yǎng)料的起始pH 值，對(duì)培養(yǎng)料進(jìn)行生長情況觀察、培養(yǎng)物活菌細(xì)胞數(shù)及粗蛋白檢測(cè)，結(jié)果見表6。

從表6可知，原料起始pH值對(duì)培養(yǎng)的影響較大，最適pH值為4.5～5.0，三個(gè)菌種均能生長較好，菌體生長前期既能較快繁殖達(dá)到一定菌數(shù)，且后期菌體亦生長較好，pH 值為5.0 時(shí)細(xì)胞數(shù)及粗蛋白含量均較高。pH 值較低時(shí)菌體生長較慢，細(xì)胞數(shù)較低，pH 值過高菌體前期生長快，但后期易染雜菌，導(dǎo)致生長變差無法檢測(cè)。

表6 原料起始pH值對(duì)發(fā)酵的影響

2.5 接種量的確定

3 個(gè)菌種按照同樣的比例加入，設(shè)計(jì)不同的接種總量，對(duì)培養(yǎng)料進(jìn)行生長情況觀察及活菌細(xì)胞計(jì)數(shù)，結(jié)果見圖1。

從圖1 可見，隨著接種量的增加，發(fā)酵料菌體生長速度隨之變快，當(dāng)接種量達(dá)到6%時(shí)，達(dá)到最佳生長狀態(tài)，細(xì)胞數(shù)最高可達(dá)45 億個(gè)∕g 以上，隨著接種量的增加，產(chǎn)品細(xì)胞數(shù)不再明顯增加，物料菌體生長達(dá)到穩(wěn)定狀態(tài)，由此可以確定接種量6%為最適接種量。

2.6 無機(jī)氮源轉(zhuǎn)化率實(shí)驗(yàn)

酵母可將培養(yǎng)基中氨態(tài)氮的2∕3 轉(zhuǎn)化為蛋白質(zhì)氮[19]，具有較強(qiáng)的轉(zhuǎn)化無機(jī)氮源的能力，以滿足菌體生長發(fā)育的需要，提高菌體蛋白的含量。本實(shí)驗(yàn)以尿素作為無機(jī)氮源，其添加量及實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表7。

圖1 接種量對(duì)培養(yǎng)菌的影響

從表7中可以看出，當(dāng)尿素添加量為3%時(shí)，轉(zhuǎn)化率最高，達(dá)86.01%，同時(shí)純蛋白較高，達(dá)31.59%，確定尿素添加量為3%時(shí)最適宜。

表7 尿素轉(zhuǎn)化率實(shí)驗(yàn)(%)

2.7 培養(yǎng)周期的確定

從培養(yǎng)開始，每隔4 h取樣一次，測(cè)定培養(yǎng)料不同時(shí)間的活菌細(xì)胞數(shù)，見圖2。

由圖2 可見，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長，產(chǎn)品細(xì)胞數(shù)隨之增加，至44～48 h 左右時(shí)，細(xì)胞數(shù)相對(duì)穩(wěn)定，可達(dá)45 億個(gè)∕g 左右，不再大幅增加，因此培養(yǎng)周期可確定為44～48 h。

圖2 細(xì)胞數(shù)-時(shí)間曲線

2.8 對(duì)蛋雞生長性能的影響

在蛋雞日糧中添加不同比例的發(fā)酵沙棘果渣進(jìn)行飼喂實(shí)驗(yàn)，分別統(tǒng)計(jì)日產(chǎn)蛋率、平均蛋重、蛋黃色澤、破損量、軟蛋量、料蛋比、只日采食量等，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表8。

表8 發(fā)酵飼料對(duì)蛋雞生產(chǎn)性能的影響

從表8可知，配方中加入2%、3%、4%、5%比例發(fā)酵沙棘果渣的Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ組和對(duì)照組相比日產(chǎn)蛋率差異顯著(P＜0.05)，Ⅳ組日產(chǎn)蛋率最高，比對(duì)照組提高6.35%。蛋黃色澤Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ組和對(duì)照組相比差異顯著(P＜0.05)，Ⅳ組蛋黃色澤最高，比對(duì)照組提高32.27%。破損軟蛋率、料蛋比跟對(duì)照組相比隨著發(fā)酵果渣的添加而降低，蛋均重隨著發(fā)酵果渣添加量的增加而有所提高，但各組間無顯著差異(P＞0.05)。只日采食量各組間無顯著差異(P＞0.05)。以上數(shù)據(jù)說明蛋雞日糧中添加發(fā)酵沙棘果渣可以顯著改善蛋雞的生產(chǎn)性能，提高飼料轉(zhuǎn)化率，提高商品蛋的品質(zhì)，蛋黃顏色加深，其中發(fā)酵沙棘果渣添加量為4%時(shí)各項(xiàng)數(shù)據(jù)指標(biāo)最好。

3 討論

地衣芽孢桿菌是芽孢桿菌中較具應(yīng)用潛力的菌種之一。2013 年地衣芽孢桿菌被列入到飼料添加劑菌種目錄中，是目前市售較集中的飼料中微生態(tài)制劑產(chǎn)品之一[20]。地衣芽孢桿菌可促使機(jī)體產(chǎn)生抗菌活性物質(zhì)、殺滅致病菌[21]，達(dá)到調(diào)整菌群、治療目的[22-23]。地衣芽孢桿菌芽孢具有極強(qiáng)的抗逆性，能耐受飼料制粒高溫、擠壓與干燥，以及原料中的無機(jī)鹽、酸化劑及部分抗生素等因素對(duì)其的殺滅作用，故成為飼料與養(yǎng)殖過程中應(yīng)用最廣泛的益生菌之一[24]。

產(chǎn)朊假絲酵母又名產(chǎn)朊圓酵母或食用圓酵母，被美國食品及藥物管理局（FDA）認(rèn)證為可作為食品添加劑的酵母，也是我國衛(wèi)生部規(guī)定的可用于保健食品的真菌菌種[25]。產(chǎn)朊假絲酵母具有較強(qiáng)的轉(zhuǎn)化無機(jī)氮為有機(jī)氮的能力，并且在其發(fā)酵過程中會(huì)產(chǎn)生大量的生物活性物質(zhì)[26]。產(chǎn)朊假絲酵母能夠生成富含蛋白質(zhì)、核苷酸、促生長因子、多種酶類及多族維生素類的菌體蛋白[27]，同時(shí)作為一株益生菌，具有調(diào)節(jié)動(dòng)物腸道微生態(tài)平衡，抑制有害菌生長，促進(jìn)機(jī)體生長的作用。能夠刺激反芻動(dòng)物瘤胃生成大量有益微生物，調(diào)控其胃腸菌群環(huán)境，增強(qiáng)機(jī)體免疫力[28]。

白地霉又叫乳內(nèi)孢霉，是類似于酵母的地霉屬真菌，繁殖力強(qiáng)，對(duì)營養(yǎng)要求粗放，細(xì)胞較大而易于回收，含50%蛋白質(zhì)[19]。細(xì)胞富含蛋白質(zhì)、脂肪、維生素和核酸，可作良好的蛋白質(zhì)飼料[29]。白地霉可以將有機(jī)廢水廢物中的殘?zhí)?、有機(jī)酸、蛋白質(zhì)、脂肪酸等轉(zhuǎn)化為動(dòng)物可以吸收利用的單細(xì)胞蛋白質(zhì)，同時(shí)其他微生物的加入也可以加速白地霉的轉(zhuǎn)化速率、豐富發(fā)酵產(chǎn)品中的營養(yǎng)成分，提升飼料的營養(yǎng)與經(jīng)濟(jì)價(jià)值[30]。白地霉體內(nèi)可以合成纖維素酶，可以降解利用飼料原料中的纖維素。

微生物繁殖過程中可產(chǎn)生有機(jī)酸（如乳酸），降低果渣pH值，增加果渣酸香味；果渣的微生物發(fā)酵過程中，微生物一方面促進(jìn)飼料中無機(jī)氮向有機(jī)氮的轉(zhuǎn)化，另一方面也加強(qiáng)了對(duì)纖維素、脂肪等營養(yǎng)物質(zhì)的利用，轉(zhuǎn)化為自身繁殖所需的蛋白質(zhì)，從而增加果渣中CP 含量[31]。此外沙棘果渣含有較高的黃酮及多酚類抗氧化物質(zhì)[32]，這使其產(chǎn)品在抗氧化和自由基清除及提高機(jī)體免疫力方面能夠發(fā)揮其更加獨(dú)有的作用。

本飼喂實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明發(fā)酵沙棘果渣能夠提高蛋雞的生產(chǎn)性能，特別是雞蛋的品質(zhì)得到了提高，蛋黃顏色明顯增加，分析原因是沙棘果渣含有豐富的胡蘿卜素和類胡蘿卜素，其中蘿卜素為15 mg∕kg，類胡蘿卜素為70 mg∕kg，還含有沙棘油18%～23%[1]，從而提升了雞蛋的品質(zhì)及營養(yǎng)價(jià)值。

4 結(jié)論

以沙棘果加工副產(chǎn)物的果渣為主料，采用地衣芽孢桿菌、產(chǎn)朊假絲酵母、白地霉三株菌株混菌固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)生物飼料。其中沙棘果渣配比40%～70%，菌種配比為1∶1∶1，物料含水量55%，初始pH 值4.5～5.0，接種總量6%，無機(jī)氮源尿素添加量3%，培養(yǎng)周期為44～48 h。培養(yǎng)物細(xì)胞數(shù)可達(dá)45 億個(gè)∕g 以上，粗蛋白質(zhì)可達(dá)39%以上。

蛋雞飼喂實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，蛋雞日糧中添加發(fā)酵沙棘果渣對(duì)蛋雞的生產(chǎn)性能有顯著的影響。添加量為4%時(shí)，日產(chǎn)蛋率最高，比對(duì)照組高6.35%，蛋黃色澤也最高，比對(duì)照組高32.27%，和對(duì)照組相比均差異顯著(P＜0.05)。結(jié)果表明蛋均重隨著發(fā)酵果渣添加量的增加而有所提高，破損軟蛋率、料蛋比跟對(duì)照組相比隨著發(fā)酵果渣的添加而降低，但各組間無顯著差異(P＞0.05)。以上數(shù)據(jù)說明蛋雞日糧中添加發(fā)酵沙棘果渣具有較好的飼喂效果，可以顯著改善蛋雞的生產(chǎn)性能，提高飼料轉(zhuǎn)化率，提高商品蛋的品質(zhì)，其中發(fā)酵沙棘果渣添加量為4%時(shí)各項(xiàng)數(shù)據(jù)指標(biāo)最好。

以沙棘果渣為主料，利用地衣芽孢桿菌、產(chǎn)朊假絲酵母、白地霉三株菌株混菌固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)生物飼料，采用固態(tài)發(fā)酵技術(shù)法生產(chǎn)，工藝簡(jiǎn)單可行，操作性強(qiáng)。產(chǎn)品活菌細(xì)胞數(shù)較高，粗蛋白含量大幅提高。同時(shí)沙棘果渣本身豐富的微量元素及維生素等有益成分，使其具有更加獨(dú)特的飼喂效果，產(chǎn)品兼具微生態(tài)制劑及蛋白飼料的雙重特性，是一種新型的綠色生物飼料。