孟颯颯，王勝楠，劉凌云

(河南大學生命科學學院 植物逆境生物學重點實驗室，河南 開封 475004)

0 引言

與傳統(tǒng)方法如反義核酸(antisense DNA/RNA)相比，RNAi技術在特異地沉默目的基因的表達上，更為高效和可靠.在最近發(fā)展的生物技術中，RNAi技術在植物輔助育種中作為遺傳材料創(chuàng)建的精確而有力的工具被廣泛使用[3].科學家們已經將RNAi技術應用于植物營養(yǎng)品質及特定性狀的改良，包括高產、抗病、抗蟲及花形、花色等方面的研究[4，5].

1 材料和方法

1.1 實驗材料

擬南芥(ArabidopsisthalianaL.)野生型(Col-0生態(tài)型).

菌株及質粒載體：E.coli菌株DH5α，農桿菌菌株GV3101，雙元質粒載體pFGC5941由美國Arizona大學The Plant Chromatin Database構建并提供.

主要試劑：利福平、卡那霉素、除草劑Basta購自Sigma公司，限制性內切酶XmaI、XbaI、XhoI、NcoI購自NEB公司，DNA凝膠回收試劑盒、質粒提取試劑盒、DNA連接試劑盒購自TAKARA公司，KOD高保真酶購自TOYOBO公司，其他生化試劑盒藥品使用國產分析純或進口分裝.實驗所用引物由北京金維智公司合成.

1.2 試驗方法

1.2.1 擬南芥的種植

取適量干燥飽滿的擬南芥種子，加入0.1%升汞，表面消毒5 min，用無菌水反復洗滌5～6次，將種子點播于0.6% MS培養(yǎng)基中，4 ℃處理2～3 d，將種子置于培養(yǎng)間培養(yǎng)(光/暗周期為8/16 h，溫度18～22 ℃，光照強度120 μmol/(m2·s)，相對濕度80%)，生長約2周后，移植至土中(營養(yǎng)土∶蛭石=1∶1)進行培養(yǎng)，10～12周即可收獲種子.

1.2.2 擬南芥總RNA的提取及cDNA的合成

擬南芥幼苗總RNA的提取及cDNA的合成參考文獻[8]的方法進行.

1.2.3 PCR產物的檢測和載體的構建

1.2.4 農桿菌介導的擬南芥遺傳轉化及轉基因苗的篩選

采用熱激法將重組質粒pFGC5941-RBS1S及pFGC5941-RBS1C分別導入農桿菌GV3101感受態(tài)細胞，涂板篩選，挑選單菌落搖菌，用菌液PCR檢測目的基因的存在.擬南芥農桿菌轉化采用花序侵染法[10].將農桿菌侵染后收獲的種子通過Basta除草劑抗性篩選獲取轉基因陽性苗.

2 結果與分析

2.1 RBS1蛋白質氨基酸序列保守性分析

為了構建RBS1基因的敲除突變體，首先利用Clustal W軟件對RBS1蛋白的氨基酸序列保守性進行分析.發(fā)現(xiàn)RBS1蛋白具有非常保守的基序GEXXQGFXRXXAXXG(圖1)，同時RBS1與同家族RBS2及RBS3蛋白的同源性比較近，分別達到76.85%和77.75%，而和RBS4的同源關系比較遠，同源性僅為19.18%.根據生物信息學分析的結果，確定RBS1特異序列為一段從59～200的氨基酸的序列，所對應的基因編碼序列長度為367 bp；同時發(fā)現(xiàn)RBS1保守序列為從210～370的氨基酸序列，且該保守序列中包含高度保守的GEXXQGFXRXXAXXG基序，其對應的基因編碼序列長度為411 bp.分析得到的特異序列及保守序列分別作為構建RBS1基因敲除突變體的參考序列.

圖1 RBS1蛋白質氨基酸序列保守性分析

2.2 RBS1基因序列特異區(qū)RNAi載體pFGC5941-RBS1S的構建

為獲得RBS1基因敲除同時又不影響同家族其他基因表達的RNAi轉基因植株，本實驗首先以野生型擬南芥cDNA為模板，以引物SF和SR擴增RBS1特異片段S，PCR產物用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測，在接近367 bp處有明顯亮帶，其大小與預期的RBS1特異區(qū)片段一致(圖2A)，切膠回收.將回收的目的片段和pFGC5941空載體分別用XmaI和XbaI限制性內切酶雙酶切，雙酶切產物跑膠、回收，T4 DNA連接酶16 ℃過夜連接，熱激轉化E.coliDH5α，涂卡那抗生素平板，37 ℃過夜培養(yǎng)，取邊緣整齊透亮的菌落，擴菌落PCR，取陽性菌落搖菌，提取重組質粒，質粒PCR，雙酶切驗證，發(fā)現(xiàn)插入基因片段S與重組質粒PCR擴增片段大小一致(圖2B)，此時S片段反向連入pFGC5941載體，命名為pFGC5941-RBS1.之后再次用SF及SR引物重新擴增RBS1特異片段S，將PCR產物跑膠回收后，和以上構建的重組質粒pFGC5941-RBS1分別用XhoI和NcoI限制性內切酶雙酶切，跑膠，切膠回收，T4 DNA連接酶16℃過夜酶連，涂平板培養(yǎng)，挑選單菌落搖菌提質粒，質粒雙酶切驗證證實S片段正向S片段正向連入載體pFGC5941-RBS1中(圖2C)，此重組載體命名為pFGC5941-RBS1S(由于是第二次酶切，該重組載體本身含有目的片段，質粒PCR檢測不能說明問題，因此僅用雙酶切檢驗).經兩次雙酶切及連接將RBS1特異片段S，正反向重復連進載體pFGC5941.將測序正確的pFGC5941-RBS1S-RNAi重組載體轉化農桿菌，農桿菌菌落PCR(圖2D)，選陽性菌落搖菌按照1.2.2的方法轉化野生型擬南芥植株.

A.RBS1基因特異序列(S)片段的克隆，1代表克隆的S片段；B.pFGC5941-RBS1載體的雙酶切驗證，泳道1代表重組載體的質粒PCR，泳道2代表重組載體的雙酶切；C.pFGC5941-RBS1S載體的雙酶切驗證；D.構建成功RNAi載體轉入農桿菌的鑒定，1代表菌落PCR結果.M代表Marker 2000.下同.

2.3 RBS1氨基酸序列保守區(qū)RNAi載體pFGC5941-RBS1C的構建

圖3 RBS1基因保守序列RNAi載體的構建

雖然前期生物信息學分析結果顯示RBS1與該家族其他基因同源性比較高，且保守區(qū)域可能為RBS1的功能區(qū)，為盡可能獲取RBS1功能缺失突變體，本實驗又構建了以RBS1保守區(qū)為靶序列的RNAi重組載體pFGC5941-RBS1C.構建具體過程與以RBS1特異區(qū)為靶序列的RNAi重組載體pFGC5941-RBS1S的構建過程類似(圖3).同樣將雙酶切驗證及測序均正確、確認RBS1保守區(qū)序列正反向重復插入的pFGC5941-RBS1C-RNAi重組載體轉化農桿菌，農桿菌菌落PCR，選陽性菌落搖菌按照1.2.2的方法轉化野生型擬南芥植株.

2.4 pFGC5941-RBS1-RNAi轉基因植株的篩選

A.pFGC5941-RBS1S-RNAi轉基因植株的篩選；B.篩選出轉基因陽性植株的特寫

將上述農桿菌介導的RNAi轉基因植株T1代種子收獲，干燥后撒播于營養(yǎng)土中，春化3天后，移至培養(yǎng)間培養(yǎng).待幼苗長出兩片子葉后即用35 mg/L的Basta進行噴灑篩選，非抗性苗經Basta噴灑后葉子變黃枯死，而篩選出的轉基因陽性植株依然能夠正常生長(圖4).經過多次篩選初步得到以RBS1保守區(qū)為沉默靶序列的轉基因植株125個株系，以RBS1特異區(qū)為沉默靶序列的轉基因植株90個株系.將陽性轉基因株系移植，單株收種子繁殖，為隨后的RBS1基因功能檢測打下基礎.

3 討論

基因過表達已經被用于分析基因功能，但這種方法不是對所有蛋白質都可行，而且結果難以解釋.T-DNA插入或者EMS誘變導致的基因缺失可以闡釋蛋白質的功能，但這些方法耗時、昂貴，而且可能導致胚胎致死表型，所以相比其他方法，RNAi技術提供了一種非常高效并且能阻止某個特異性基因表達的方法，具有更大的優(yōu)勢與潛力[11，12].

RNAi技術在研究植物基因功能時應用廣泛[13-16].一般在基因沉默實驗中，為了能特異沉默目的基因，往往選擇蛋白特異序列作為沉默的靶序列.但很多時候，蛋白保守序列也往往是蛋白的功能域結構，因此試驗中僅僅沉默基因特異序列未必能達到基因沉默的目的.本實驗中，在擬南芥網站中未能查到RBS1基因的T-DNA插入突變體，生物信息學分析顯示該基因主要在花藥中表達[17]，這些結果暗示，該基因與植物育性有關，并且其功能缺失突變體可能致死，因此構建RNAi轉基因株系以獲取低水平表達突變體就成為研究該基因功能的理想工具.本實驗中分別成功構建了旨在敲除RBS1特異序列和敲除RBS1保守序列的兩個RNAi雙元載體，確保達到敲低RBS1基因的目的.活性氧不僅調節(jié)植物生長和發(fā)育過程，而且也介導生物與非生物脅迫響應過程[18-20].本研究前期篩到rbs1是活性氧敏感突變體，因此，獲得RNAi轉基因植株后的下一步工作是評估所篩選陽性RNAi轉基因植株的沉默效率，選擇基因敲除植株檢測活性氧相關表型，為以后深入研究RBS1的生物學功能和作用機制奠定基礎.