向靜，米盈，田斌，龔雙姣，馬陶武

吉首大學(xué)生物資源與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，吉首 416000

作為水體中各種污染物沉積庫(kù)的沉積物是潛在的二次污染源[1]，而受到持久性有機(jī)污染物污染的沉積物對(duì)水生生物和人類健康具有很大的生態(tài)與健康風(fēng)險(xiǎn)。采用低能耗、高效率和對(duì)環(huán)境干擾小的修復(fù)技術(shù)對(duì)污染沉積物進(jìn)行原位修復(fù)是維持水生態(tài)系統(tǒng)健康的重要手段。通常，對(duì)污染沉積物修復(fù)的主要目標(biāo)是最大程度地降低污染物的生物有效性和生態(tài)毒性。研究證實(shí)，黑炭顆?？梢詮?qiáng)烈地吸附與沉積物結(jié)合的污染物，從而降低污染物的生物有效性、減少生物積累和生態(tài)毒性[2-3]。

生物炭是一種重要的新型碳材料，目前被認(rèn)為是一種重要的綠色環(huán)境吸附劑，在環(huán)境修復(fù)中發(fā)揮重要的作用[4]，因此，將生物炭應(yīng)用于污染沉積物的原位修復(fù)具有很大的潛力[5-9]。關(guān)于生物炭對(duì)水土環(huán)境中污染物阻控的研究主要關(guān)注污染物的生物有效性[10-11]，但在判斷生物炭對(duì)污染沉積物的修復(fù)效力時(shí)僅依據(jù)污染物生物有效性的變化往往是不夠的，必須同時(shí)結(jié)合生物效應(yīng)進(jìn)行綜合評(píng)判，因?yàn)槲廴疚锏纳鷳B(tài)毒性風(fēng)險(xiǎn)只有通過生物效應(yīng)才能得以體現(xiàn)。目前，關(guān)于生物炭對(duì)污染物生態(tài)毒性風(fēng)險(xiǎn)影響的評(píng)價(jià)研究尚較少報(bào)道[12-13]。銅銹環(huán)棱螺(Bellamyaaeruginosa)是屬于腹足綱田螺科的淡水軟體動(dòng)物，在我國(guó)淡水環(huán)境中廣泛分布，是一種典型的沉積物棲居型底棲動(dòng)物，該物種對(duì)一些典型重金屬和持久性有機(jī)污染物表現(xiàn)出較好的敏感性，是進(jìn)行沉積物毒性測(cè)試的理想生物[14-15]。

多溴聯(lián)苯醚(PBDEs)是典型的持久性有機(jī)污染物，PBDEs主要用作阻燃劑，在眾多的PBDEs同系物中，2,2’,4,4’-四溴聯(lián)苯醚(BDE-47)約占PBDEs總量的70%，也是毒性最強(qiáng)的[16]。PBDEs具有高脂溶性，在沉積物中的濃度通常高于水相。例如，我國(guó)珠江沉積物中PBDEs的濃度為12.7～7 361 ng·g-1，水相中濃度為108～5 788 ng·L-1 [17]。

本研究以玉米秸稈制備的生物炭(corn straw biochar, CSB)為研究對(duì)象，以BDE-47為目標(biāo)污染物，以銅銹環(huán)棱螺為測(cè)試生物，采用28 d沉積物生物測(cè)試的方法，研究在BDE-47加標(biāo)沉積物中添加不同比例CSB的情況下，BDE-47在銅銹環(huán)棱螺體內(nèi)的生物積累、對(duì)其肝胰臟細(xì)胞DNA損傷以及螺體內(nèi)氧化脅迫關(guān)鍵生物標(biāo)志物(活性氧(ROS)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶(GST)和丙二醛(MDA)隨時(shí)間的動(dòng)態(tài)變化，考察CSB自身的毒性和CSB對(duì)沉積物中BDE-47生態(tài)毒性控制的效果。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 儀器與試劑

主要儀器：真空氣氛爐(GR.TF 80/11，上海貴爾機(jī)械設(shè)備有限公司)；比表面及孔徑分析儀(美國(guó)麥克三站全功能型多用吸附儀3Flex，美國(guó)麥克儀器公司)；熱場(chǎng)發(fā)射掃描電子顯微鏡(Quanta 400 FEG，美國(guó)FEI公司)；氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(GC/MS-QP2010 plus，日本Shimadzu儀器公司)；熒光顯微鏡(ECLIPSE 80i，日本尼康公司)；多功能酶標(biāo)儀(DTX-880，美國(guó)Beckman Coulter公司)；臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)(TGL-16M，長(zhǎng)沙平凡儀器儀表有限公司)；水平電泳儀(DYY-12型，北京六一儀器廠)；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(KE-2000E，上海亞榮儀器有限公司)；玻璃勻漿器；玻璃層析柱。

主要試劑：2,2’,4,4’-四溴聯(lián)苯醚(BDE-47)，分子式C12H6Br4O，CAS# 5436-43-1，純度98.5%，BDE-47標(biāo)樣(50 μg·mL-1)購(gòu)自AccuStandard公司；定量?jī)?nèi)標(biāo)13C12-PCB138(40 μg·mL-1)購(gòu)自美國(guó)劍橋同位素實(shí)驗(yàn)室；正壬烷、異辛烷購(gòu)自上海阿拉丁生化科技公司，均為GCS級(jí)；蔗糖、Tris、EDTA-2Na、2,4-二硝基苯肼(DNPH)和鹽酸胍為國(guó)產(chǎn)分析純；正己烷、二氯甲烷、丙酮和甲醇為國(guó)產(chǎn)農(nóng)藥殘留級(jí)。

1.2 試驗(yàn)材料

1.2.1 測(cè)試生物

采用實(shí)驗(yàn)室人工培養(yǎng)的銅銹環(huán)棱螺作為測(cè)試生物[13]，選取個(gè)體大小一致的健康成體，殼長(zhǎng)為(18.10±1.14) mm，體重為(1.56±0.15) g，用于沉積物暴露測(cè)試。

1.2.2 沉積物

實(shí)驗(yàn)所用沉積物來(lái)自湖南吉首市德夯自然保護(hù)區(qū)，采集與處理方法見Ma等[14]的報(bào)道。

1.2.3 玉米秸稈生物炭制備與表征

CSB采用高純氬氣保護(hù)炭化法進(jìn)行制備。先將玉米秸稈置于烘箱中烘干，粉碎后裝填在管式真空氣氛爐的石英爐管中。炭化前，先對(duì)爐管抽真空，然后通入高純氬氣，重復(fù)3次后，持續(xù)通入氬氣，待管內(nèi)壓力高于1.5個(gè)標(biāo)準(zhǔn)大氣壓后，打開排氣口，控制出氣量，使管內(nèi)壓力在整個(gè)炭化過程中不低于1個(gè)標(biāo)準(zhǔn)大氣壓。根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果設(shè)定炭化溫度為500 ℃，炭化時(shí)間為8 h。將所制得的生物炭用去離子水反復(fù)淋洗至浸出水呈中性，然后于85 ℃烘干至恒重，取出研磨，過150 μm尼龍篩，保存?zhèn)溆?。?jīng)分析，在生物炭樣品中未檢測(cè)到BDE-47。對(duì)測(cè)試用生物炭樣品采用比表面及孔徑分析儀測(cè)定其比表面積、平均吸附孔徑和外部表面積等表面參數(shù)，同時(shí)采用熱場(chǎng)發(fā)射掃描電子顯微鏡(SEM)進(jìn)行表征。

1.3 沉積物生物測(cè)試

根據(jù)我國(guó)水體沉積物中BDE-47的環(huán)境相關(guān)水平設(shè)定BDE-47的實(shí)驗(yàn)加標(biāo)濃度為500 ng·g-1干重[17]。將生物炭設(shè)置3個(gè)添加水平(w/w)：1%、4%和7%。實(shí)驗(yàn)共設(shè)8個(gè)處理組(表1)，用于測(cè)試CSB自身的毒性(處理1～4)和CSB與BDE-47聯(lián)合暴露的毒性(處理5～8)，每個(gè)處理組設(shè)3個(gè)重復(fù)。

表1 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)Table 1 Experimental set-up

注：CSB表示以玉米秸稈制備的生物炭；-表示無(wú)添加。

Note: CSB stands for corn straw biochar; - means no addition.

參考王萌等[18]的方法對(duì)沉積物進(jìn)行加標(biāo)處理。首先為每個(gè)處理組稱取2 100 g干沉積物(預(yù)先過150 μm尼龍篩)，按上述實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)加入相應(yīng)質(zhì)量的CSB到每個(gè)處理組的沉積物中，然后分別倒入攪拌機(jī)中連續(xù)攪拌至少1 h，轉(zhuǎn)入塑料小桶中。按沉積物和去離子水1∶1的體積比加入去離子水，充分?jǐn)嚢柚粱旌暇鶆?。用二甲基亞?DMSO)配制濃度為5 mg·mL-1的BDE-47儲(chǔ)備液，在需要添加BDE-47的處理組加入相應(yīng)質(zhì)量的BDE-47儲(chǔ)備液。每隔3 h用潔凈小木鏟攪拌一次，一次持續(xù)1 h，24 h后完成攪拌。加標(biāo)沉積物在室溫下靜置14 d，在存貯期間，每隔3 d再充分?jǐn)嚢枰淮危辜訕?biāo)沉積物達(dá)到理化平衡[19]。將每組處理好的沉積物均分到3個(gè)重復(fù)測(cè)試缸(4 L)中，按沉積物與上覆水1∶4的體積比加入去離子水，然后將所有測(cè)試缸置于一個(gè)水浴控溫水槽中，靜置3 d。暴露開始時(shí)，將所選實(shí)驗(yàn)螺隨機(jī)分組，放入每個(gè)測(cè)試缸中，每個(gè)測(cè)試缸15只，每個(gè)處理組共有實(shí)驗(yàn)螺45只，保持光照周期為12 h(白晝)∶12 h(黑暗)，水溫(24±1) ℃，以靜水充氣的方式暴露28 d，對(duì)每個(gè)測(cè)試缸加蓋尼龍網(wǎng)，中間留一個(gè)直徑為5 cm的圓孔，方便喂食。按每只螺每天5 mg的量投喂食料[14]。在整個(gè)暴露期間，每個(gè)測(cè)試缸中實(shí)驗(yàn)螺的存活率都在90%以上，符合沉積物毒性測(cè)試標(biāo)準(zhǔn)要求。在暴露7、14、21和28 d時(shí)取樣，分3批進(jìn)行，首先從每個(gè)處理組中取實(shí)驗(yàn)螺3只，清洗干凈，用鉗子夾破螺尖，取出肝胰臟，立即進(jìn)行DNA損傷測(cè)定；然后再?gòu)拿總€(gè)處理組中取實(shí)驗(yàn)螺3只，分離出肝胰臟置于液氮中速凍保存用于生化測(cè)定；最后從每個(gè)處理組中取實(shí)驗(yàn)螺3只放入裝有去離子水的潔凈玻璃缸中清腸24 h(以消除腸道中存留的BDE-47對(duì)BDE-47生物積累的影響)，然后分離出全部的內(nèi)臟團(tuán)，保存于-20 ℃冰箱中，用于BDE-47的分析。在暴露實(shí)驗(yàn)開始前，對(duì)未經(jīng)暴露的螺進(jìn)行同樣的取樣處理和測(cè)定。此外，在暴露7、14、21和28 d時(shí)，對(duì)每個(gè)測(cè)試缸進(jìn)行沉積物取樣(50 g)，于2 500 r·min-1離心，過濾，用于測(cè)定沉積物間隙水中BDE-47的濃度。

1.4 DNA損傷測(cè)定

采用彗星實(shí)驗(yàn)法(comet assay)[20]檢測(cè)肝胰臟細(xì)胞DNA損傷的程度，按照Ma等[21]建立的操作方法進(jìn)行DNA損傷測(cè)定，用熒光顯微鏡進(jìn)行彗星圖像采集，采用CASP軟件進(jìn)行圖像數(shù)據(jù)分析，獲取Olive尾距(Olive tail moment, OTM)，OTM為彗星頭部重心與尾部重心間距離與彗尾DNA含量的乘積，對(duì)每個(gè)處理組檢測(cè)3個(gè)樣本，每個(gè)樣本觀察1張載玻片，取50個(gè)細(xì)胞數(shù)據(jù)的中位數(shù)作為DNA損傷測(cè)定值。

1.5 生化測(cè)定

1.5.1 ROS的測(cè)定

利用熒光探針DCFH-DA對(duì)新鮮肝胰臟中ROS的含量進(jìn)行測(cè)定。將肝胰臟組織和100 mmol·L-1的磷酸緩沖液(PBS)按質(zhì)量(g)體積(mL)比1∶20的比例加入到玻璃勻漿器中，冰浴下制成勻漿，然后轉(zhuǎn)入0.5 mL離心管，于4 ℃、1 200 r·min-1，離心10 min。先取190 μL上清液加入到黑底酶標(biāo)板中，加入10 μL 1 mmol·L-1的DCFC-DA熒光探針；再取190 μL上清液加入到另一黑底酶標(biāo)板中，加入10 μL PBS，吹打均勻后，于37 ℃孵育30 min，在多功能酶標(biāo)儀上測(cè)定熒光強(qiáng)度(激發(fā)波長(zhǎng)(500±15) nm；發(fā)射波長(zhǎng)(530±20) nm)。最后取部分剩余上清液采用考馬斯亮藍(lán)法在595 nm下測(cè)定蛋白含量，ROS含量以熒光強(qiáng)度值(FI)·mg-1蛋白表示。

1.5.2 SOD、GST和MDA的測(cè)定

按照龍奕等[22]的方法進(jìn)行組織樣品的制備和指標(biāo)的測(cè)定。先將冷凍的肝胰臟組織和0.01 mol·L-1Tris-HCl勻漿介質(zhì)(pH 7.4)按質(zhì)量(g)體積(mL)比1∶9的比例加入到玻璃勻漿器中，冰浴下制成勻漿，然后轉(zhuǎn)入0.5 mL離心管，于4 ℃、2 500 r·min-1，離心10 min。先取上清液20 μL(即10%勻漿上清液)，用勻漿介質(zhì)稀釋到1%，用于測(cè)SOD活性；再取上清液220 μL，用于測(cè)GST活性；剩余的勻漿液在10 000 r·min-1繼續(xù)離心20 min，取上清液，稀釋到1%，用于測(cè)定MDA含量。SOD活性采用氯化硝基四氮唑藍(lán)(NBT)光化還原法測(cè)定，在550 nm下測(cè)吸光度，以50%抑制率的酶量為1個(gè)SOD的活力單位(U·mg-1蛋白)；GST活性采用1-氯-2,4-二硝基苯(CDNB)法測(cè)定，在340 nm下測(cè)吸光度，活力單位以U·mg-1蛋白表示；MDA含量采用硫代苯巴比妥酸(TBA)比色法測(cè)定，在532 nm下測(cè)定吸光值，活力單位以nmol·mg-1蛋白表示；采用考馬斯亮藍(lán)染色法在595 nm下測(cè)定蛋白含量。

1.6 內(nèi)臟團(tuán)中BDE-47的分析測(cè)定

按照劉佳等[23]的方法對(duì)冷凍保存的內(nèi)臟團(tuán)樣品和間隙水樣進(jìn)行前處理。以PCB-209作為回收率指示物標(biāo)樣，以13C12-PCB138作為定量?jī)?nèi)標(biāo)。在GC/MS上采用程序升溫的方法進(jìn)行測(cè)定。色譜柱升溫程序?yàn)槌跏紲囟?10 ℃保持1 min，8 ℃·min-1升溫至180 ℃保持1 min，以2 ℃·min-1升溫至240 ℃保持5 min，以2 ℃·min-1升溫到280 ℃保持6 min。質(zhì)譜條件：采用EI離子源進(jìn)行電離，離子源溫度為230 ℃，電子能量70 eV，燈絲電流0.7 mV，離子掃描模式為SIM模式，接口溫度為300 ℃。全過程采用方法空白、加標(biāo)空白、基質(zhì)加標(biāo)和基質(zhì)加標(biāo)平行樣進(jìn)行質(zhì)量控制。樣品中PCB-209的加標(biāo)回收率為71%～96%，在合理的回收率范圍(60%～120%)內(nèi)，符合分析要求。儀器對(duì)BDE-47的檢測(cè)限為1.08 ng·mL-1。采用內(nèi)標(biāo)法和校正因子對(duì)BDE-47進(jìn)行定量分析計(jì)算。

1.7 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS20.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)先進(jìn)行正態(tài)分布檢驗(yàn)，然后利用單因素方差分析法(ANOVA)和多重比較檢驗(yàn)法(LSD)進(jìn)行組間差異顯著性檢驗(yàn)，差異顯著性水平為0.05。

2 結(jié)果(Results)

2.1 生物炭表征

對(duì)CSB進(jìn)行了表面積和孔徑測(cè)定，結(jié)果顯示，CSB的比表面積和外部表面積分別為81.66和115.17 m2·g-1，平均吸附孔徑為3.874 nm。CSB的掃描電鏡照片顯示，其外部形貌呈片層狀或者柱狀，孔隙度較高(圖1)。

2.2 沉積物間隙水中BDE-47的濃度

暴露實(shí)驗(yàn)前和不同取樣時(shí)間點(diǎn)沉積物間隙水中BDE-47濃度的變化如表2所示。在對(duì)照組和生物炭單獨(dú)處理組中均未檢測(cè)到BDE-47。在BDE-47單獨(dú)處理組和CSB與BDE-47聯(lián)合處理組，暴露21 d后，間隙水中BDE-47的濃度有所下降，但差異不顯著，說明在暴露實(shí)驗(yàn)過程中生物擾動(dòng)對(duì)沉積物化學(xué)特性的影響可以忽略不計(jì)。與BDE-47單獨(dú)處理組相比，CSB與BDE-47聯(lián)合處理組間隙水的BDE-47濃度均顯著下降，比較暴露28 d后的情況可以看出，1%、4%和7% CSB與BDE-47聯(lián)合處理組BDE-47的濃度分別比BDE-47單獨(dú)處理組下降了52%、71%和81%。

圖1 玉米秸稈生物炭(CSB)的掃描電鏡照片F(xiàn)ig. 1 Scanning electron micrograph of corn straw biochar (CSB)

2.3 CSB對(duì)銅銹環(huán)棱螺的毒性

將銅銹環(huán)棱螺暴露于單獨(dú)添加不同比例CSB的沉積物28 d后，結(jié)果表明，與對(duì)照組相比，各處理組銅銹環(huán)棱螺肝胰臟DNA損傷(OTM值)、活性氧(ROS)水平、SOD活性、GST活性和MDA含量均未表現(xiàn)出顯著差異，說明CSB對(duì)銅銹環(huán)棱螺不具有毒性。

2.4 CSB和BDE-47聯(lián)合暴露對(duì)銅銹環(huán)棱螺肝胰臟中BDE-47生物積累的影響

在沉積物中添加不同比例的CSB對(duì)銅銹環(huán)棱螺內(nèi)臟團(tuán)中BDE-47含量的影響如圖2所示。隨暴露時(shí)間的延長(zhǎng)，不同處理組的BDE-47含量總體上呈上升趨勢(shì)，添加不同比例的CSB能明顯降低BDE-47的生物積累。在暴露后期(21和28 d)，4%和7% CSB與BDE-47聯(lián)合處理組的BDE-47含量不再隨暴露時(shí)間的增加而升高。暴露28 d后，1%、4%和7% CSB與BDE-47聯(lián)合處理組的BDE-47含量分別比BDE-47單獨(dú)處理組(969.94 ng·g-1)下降了50%、69%和79%。

2.5 CSB和BDE-47聯(lián)合暴露對(duì)肝胰臟細(xì)胞DNA損傷的影響

在沉積物中添加不同比例的CSB對(duì)銅銹環(huán)棱螺肝胰臟DNA損傷(OTM值)的影響如圖3所示。除暴露初期(7 d)外，CSB與BDE-47聯(lián)合處理組的OTM值均顯著低于BDE-47單獨(dú)處理組，且隨著暴露時(shí)間的延長(zhǎng)和CSB比例的增加，CSB與BDE-47聯(lián)合處理組的OTM值顯著降低。在暴露后期(21和28 d)，7% CSB與BDE-47聯(lián)合處理組的OTM值不再隨暴露時(shí)間的增加而升高。暴露28 d后，1%、4%和7% CSB與BDE-47聯(lián)合處理組的OTM值分別比BDE-47單獨(dú)處理組(20.67)下降了44%、67%和83%。

圖2 CSB和BDE-47單一或復(fù)合加標(biāo)沉積物暴露后銅銹環(huán)棱螺內(nèi)臟團(tuán)中BDE-47含量的變化注：不同字母表示處理組間存在顯著性差異，P < 0.05；下同。Fig. 2 The change of BDE-47 burden in the visceral mass of Bellamya aeruginosa following exposure to sediments amended with BDE-47 and/or CSBNote: Different letters show statistically significant differences between treatment groups, P < 0.05, the same below.

表2 沉積物間隙水中BDE-47的濃度(平均值±SD, n=3)Table 2 The concentration of BDE-47 in the porewaters of the sediments (mean±SD, n=3)

注：同一列數(shù)據(jù)后英文小寫字母不同表示不同處理組之間差異顯著(P<0.05)；ND表示未檢出。

Note: Different lowercase letters in the same column of data represent significant differences between different treatment groups (P<0.05); ND is not detected.

圖3 CSB和BDE-47單一或復(fù)合加標(biāo)沉積物暴露后銅銹環(huán)棱螺肝胰臟DNA損傷的變化Fig. 3 The change of DNA damage in hepatopancreas of Bellamya aeruginosa following exposure to sediments amended with BDE-47 and/or CSB

2.6 CSB和BDE-47聯(lián)合暴露對(duì)肝胰臟細(xì)胞ROS水平的影響

在沉積物中添加不同比例的CSB對(duì)銅銹環(huán)棱螺肝胰臟ROS水平的影響如圖4所示。除暴露初期(7 d)外，CSB與BDE-47聯(lián)合處理組的ROS水平均顯著低于BDE-47單獨(dú)處理組。4%和7% CSB與BDE-47聯(lián)合處理組的ROS水平顯著低于1% CSB與BDE-47聯(lián)合處理組，但4%和7% CSB與BDE-47聯(lián)合處理組之間沒有顯著差異。暴露28 d后，1%、4%和7% CSB與BDE-47聯(lián)合處理組的ROS水平分別比BDE-47單獨(dú)處理組(70.71)下降了29%、40%和41%。

2.7 CSB和BDE-47聯(lián)合暴露對(duì)肝胰臟細(xì)胞SOD活性的影響

在沉積物中添加不同比例的CSB對(duì)銅銹環(huán)棱螺肝胰臟SOD活性的影響如圖5所示。在暴露初期(7 d)，CSB的影響不明顯；暴露14 d后，CSB與BDE-47聯(lián)合處理組的SOD活性顯著低于BDE-47單獨(dú)處理組；在暴露后期(21和28 d)，CSB與BDE-47聯(lián)合處理組的SOD活性總體上顯著高于BDE-47單獨(dú)處理組。在整個(gè)暴露期內(nèi)，4%和7% CSB與BDE-47聯(lián)合處理組之間沒有顯著差異。暴露28 d后，1%、4%和7% CSB與BDE-47聯(lián)合處理組的SOD活性分別比BDE-47單獨(dú)處理組(13.08 U·mg-1蛋白)升高了9%、17%和21%。

圖4 CSB和BDE-47單一或復(fù)合加標(biāo)沉積物暴露后銅銹環(huán)棱螺肝胰臟活性氧(ROS)含量的變化注：FI表示熒光強(qiáng)度。Fig. 4 The change of reactive oxygen species (ROS) levels in hepatopancreas of Bellamya aeruginosa following exposure to sediments amended with BDE-47 and/or CSBNote: FI stands for fluorescence intensity.

圖5 CSB和BDE-47單一或復(fù)合加標(biāo)沉積物暴露后銅銹環(huán)棱螺肝胰臟超氧化物歧化酶(SOD)活性的變化Fig. 5 The change of superoxide dismutase (SOD) activities in hepatopancreas of Bellamya aeruginosa following exposure to sediments amended with BDE-47 and/or CSB

2.8 CSB和BDE-47聯(lián)合暴露對(duì)肝胰臟細(xì)胞GST活性的影響

在沉積物中添加不同比例的CSB對(duì)銅銹環(huán)棱螺肝胰臟GST活性的影響如圖6所示。GST活性隨時(shí)間的變化規(guī)律與SOD活性基本相同。暴露28 d后，1%、4%和7% CSB與BDE-47聯(lián)合處理組的GST活性分別比BDE-47單獨(dú)處理組(31.68 U·mg-1蛋白)升高了89%、80%和83%。

圖6 CSB和BDE-47單一或復(fù)合加標(biāo)沉積物暴露后銅銹環(huán)棱螺肝胰臟谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(GST)活性的變化Fig. 6 The change of glutathione-S-transferase (GST) activities in hepatopancreas of Bellamya aeruginosa following exposure to sediments amended with BDE-47 and/or CSB

2.9 CSB和BDE-47聯(lián)合暴露對(duì)肝胰臟細(xì)胞MDA含量的影響

在沉積物中添加不同比例的CSB對(duì)銅銹環(huán)棱螺肝胰臟MDA含量的影響如圖7所示。除暴露初期(7 d)外，CSB與BDE-47聯(lián)合處理組的MDA含量均顯著低于BDE-47單獨(dú)處理組，但1%、4%和7% CSB與BDE-47聯(lián)合處理組之間沒有顯著差異。暴露28 d后，1%、4%和7% CSB與BDE-47聯(lián)合處理組的MDA含量分別比BDE-47單獨(dú)處理組(2.52 nmol·mg-1蛋白)下降了66%、71%和72%。

圖7 CSB和BDE-47單一或復(fù)合加標(biāo)沉積物暴露后銅銹環(huán)棱螺肝胰臟丙二醛(MDA)含量的變化Fig. 7 The change of malondialdehyde (MDA) levels in hepatopancreas of Bellamya aeruginosa following exposure to sediments amended with BDE-47 and/or CSB

3 討論(Discussion)

3.1 生物炭的潛在生態(tài)毒性風(fēng)險(xiǎn)

目前，關(guān)于生物炭生態(tài)毒性風(fēng)險(xiǎn)的研究已有一些報(bào)道。一些研究指出，生物炭具有較低的毒性[24-25]。另有一些研究表明，生物炭不具有毒性，例如，Busch等[26-27]的研究表明水熱法制備的生物炭對(duì)蚯蚓沒有毒性；韓杰等[28]的研究表明水稻秸稈生物炭對(duì)小鼠不具有毒性。已有研究表明，生物炭的毒性主要與制備工藝和處理方法有關(guān)，相對(duì)較高溫度下(>400 ℃)慢速熱解制備的生物炭通常不具有毒性[29-32]；酸化處理可以降低生物炭的毒性風(fēng)險(xiǎn)[33]。在本研究中CSB都是在較高裂解溫度(500 ℃)下制備的，而且在暴露實(shí)驗(yàn)前都經(jīng)過酸洗處理，因此不具有毒性。此外，生物炭的毒性還與測(cè)試生物種類有關(guān)[34]。

3.2 生物炭對(duì)沉積物或土壤中有機(jī)污染物生物積累的影響

有研究表明，在沉積物或土壤中添加生物炭可以降低有機(jī)污染物的生物積累，而且與生物炭的添加量有關(guān)。Shen等[5]在研究中指出，當(dāng)沉積物中玉米秸稈和馬尾松生物炭的添加量<1.5%時(shí)，搖蚊幼蟲體內(nèi)多環(huán)芳烴的生物積累顯著降低，但當(dāng)生物炭添加量>1.5%時(shí)，對(duì)多環(huán)芳烴的生物積累沒有影響；Xia等[6]發(fā)現(xiàn)玉米秸稈和柳樹生物炭可以顯著降低沉積物中全氟辛烷磺酸在搖蚊幼蟲體內(nèi)的生物積累，并且生物炭用量(0.2%～1.5%)越高，生物積累降低越多。Wang等[35]在研究中指出，松木生物炭(400 ℃)雖然能顯著降低土壤中阿特拉津在2種蚯蚓體內(nèi)的生物積累，但當(dāng)生物炭添加量為0.5%時(shí)，阿特拉津在威廉腔環(huán)蚓(Metaphireguillelmi)體內(nèi)的生物積累低于赤子愛勝蚓(Eiseniafoetida)，而當(dāng)生物炭用量為2%時(shí)，阿特拉津在2種蚯蚓體內(nèi)的生物積累沒有差異。本研究顯示，在沉積物中添加CSB(500 ℃)能顯著降低BDE-47在銅銹環(huán)棱螺體內(nèi)的生物積累，而且在實(shí)驗(yàn)范圍內(nèi)CSB添加比例越高，效果越顯著。因此，生物炭對(duì)沉積物或土壤中有機(jī)污染物生物積累影響的差異與污染物的種類和濃度、生物炭的制備條件、種類和添加水平以及測(cè)試生物的種類有關(guān)[13]。本研究還顯示，隨著CSB添加比例的增加，沉積物間隙水中BDE-47的濃度顯著下降，從而導(dǎo)致BDE-47的生物積累顯著減少，因此，BDE-47的生物積累與沉積物間隙水中BDE-47的濃度成正相關(guān)，這與Xia等[6]的研究結(jié)果基本一致。

3.3 生物炭對(duì)沉積物或土壤中有機(jī)污染物生態(tài)毒性的影響

目前，有關(guān)生物炭與沉積物或土壤中有機(jī)污染物相互作用后對(duì)底棲動(dòng)物或土壤動(dòng)物的潛在生態(tài)毒性風(fēng)險(xiǎn)的評(píng)價(jià)研究?jī)H有少量報(bào)道。Bielská等[36]研究了土壤中芒草生物炭與芘相互作用對(duì)秀麗隱桿線蟲(Caenorhabditiselegans)的影響，結(jié)果顯示生物炭可以顯著降低芘對(duì)秀麗隱桿線蟲的生態(tài)毒性。Bielská等[12]又進(jìn)一步研究了土壤中木屑和稻殼生物炭與芘、多氯聯(lián)苯(PCB-52)和p,p’-滴滴伊(p,p’-DDE)相互作用對(duì)跳蟲(Folsomiacandida)的影響，結(jié)果表明，添加生物炭(1%～5%)可以降低這些有機(jī)污染物對(duì)跳蟲的繁殖毒性。本研究通過考察銅銹環(huán)棱螺的DNA損傷以及氧化脅迫相關(guān)生物標(biāo)志物的變化來(lái)反映沉積物中CSB對(duì)BDE-47生態(tài)毒性的影響。細(xì)胞DNA損傷和氧化脅迫的生物標(biāo)志物通常可以有效指示污染物的生態(tài)毒性[13,22]。當(dāng)生物機(jī)體受到外源性化學(xué)物質(zhì)脅迫時(shí)，作為機(jī)體抗氧化防御系統(tǒng)重要組分的SOD可以降低或消除氧化脅迫以維持ROS的平衡，但過多的ROS則會(huì)激活或抑制SOD活性；MDA水平是衡量機(jī)體脂質(zhì)過氧化程度和細(xì)胞氧化損傷的程度；GST是一種在機(jī)體Ⅱ代謝中參與親電性化合物解毒的關(guān)鍵酶，它同時(shí)也參與細(xì)胞的抗氧化防御，污染脅迫時(shí)GST活性的改變體現(xiàn)了機(jī)體對(duì)污染物的生物轉(zhuǎn)化和抗氧化功能；機(jī)體細(xì)胞DNA在ROS的攻擊下容易發(fā)生氧化損傷。結(jié)果表明，沉積物中不同比例的CSB與BDE-47的聯(lián)合暴露能夠顯著降低銅銹環(huán)棱螺肝胰臟的DNA損傷和ROS水平，顯著減少對(duì)SOD和GST活性的抑制，顯著降低MDA含量，這說明不同添加比例的CSB均可以顯著降低BDE-47對(duì)銅銹環(huán)棱螺的毒性，較高比例(4%和7%)CSB的效果更為顯著。從變化趨勢(shì)來(lái)看，DNA損傷隨著CSB添加比例的升高而顯著降低，但不同添加比例的CSB與BDE-47聯(lián)合處理組之間的ROS水平、SOD活性、GST活性和MDA含量沒有顯著差異，也就是說，BDE-47的氧化脅迫毒性不隨CSB添加比例的升高而下降，這可能是由于不同CSB添加比例引起的聯(lián)合處理組中BDE-47生物積累的差異并不足以引起氧化脅迫生物標(biāo)志物響應(yīng)的改變，這與銅銹環(huán)棱螺對(duì)BDE-47脅迫的響應(yīng)相對(duì)較慢有關(guān)[15]。

綜上所述，在慢性暴露情況下，本研究所制備的CSB對(duì)銅銹環(huán)棱螺不具有毒性。CSB通過顯著降低沉積物間隙水中BDE-47的濃度而降低其在銅銹環(huán)棱螺體內(nèi)的生物積累，在實(shí)驗(yàn)濃度范圍內(nèi)(1%～7%)，CSB添加比例越高，降低BDE-47生物積累的效果越顯著。不同添加比例的CSB均可以顯著降低BDE-47對(duì)銅銹環(huán)棱螺的毒性(DNA損傷)，較高比例(4%和7%)CSB的效果更為顯著，但BDE-47的氧化脅迫毒性不隨CSB添加比例的升高而下降。因此，從降低沉積物中BDE-47生態(tài)毒性風(fēng)險(xiǎn)的角度來(lái)說，沉積物中CSB的合適添加比例為4%。