周 勰，陳楚央，唐云平，陳 艷，楊最素

（浙江海洋大學(xué)食品與藥學(xué)學(xué)院，浙江舟山 316022）

免疫系統(tǒng)是機(jī)體非常重要的生理防御系統(tǒng)，其穩(wěn)定性與機(jī)體是否能夠保持健康有很大的關(guān)系。免疫系統(tǒng)不平衡會(huì)影響機(jī)體的免疫應(yīng)答，從而導(dǎo)致各種疾病的發(fā)生[1]。巨噬細(xì)胞是生物體中非常重要的免疫細(xì)胞，在機(jī)體的生命周期中十分重要，具有抗感染、影響組織炎癥的發(fā)展等作用[2-3]。目前，臨床上已使用許多藥物來調(diào)節(jié)機(jī)體的免疫功能，但是大多數(shù)合成的免疫調(diào)節(jié)藥物都具有副作用，還可能影響免疫系統(tǒng)，從而增加感染的風(fēng)險(xiǎn)[4-5]。因此，尋找天然來源的免疫調(diào)節(jié)劑已引起人們的廣泛關(guān)注。

鱈魚Gadus macrocephalus 屬于鱈形目、鱈科、鱈屬，屬于深海魚類，在我國的黃海和東海北部等地區(qū)產(chǎn)量較為豐富。鱈魚其肉質(zhì)鮮美，富有營養(yǎng)，有著可觀的營養(yǎng)價(jià)值和經(jīng)濟(jì)價(jià)值，我國每年的鱈魚加工量可達(dá)50×104t，在其加工過程中有大量的下腳料產(chǎn)生[6]。下腳料的丟棄不僅僅是資源的浪費(fèi)，還造成了一定的環(huán)境壓力。鱈魚皮作為鱈魚加工的副產(chǎn)物之一，含有豐富的膠原蛋白，但是其分子量比較大，不能很好地被人體直接吸收利用[7]。故將膠原蛋白水解為分子量更小的肽，就能夠更好地被機(jī)體吸收。近年來的研究表明鱈魚皮膠原蛋白肽具有防治骨質(zhì)疏松、抗氧化、護(hù)肝、抗癌等作用[8-9]。從海洋生物中提取促進(jìn)免疫調(diào)節(jié)作用的活性肽是近年來的研究熱點(diǎn)，然而從鱈魚皮中提取促進(jìn)RAW 264.7 細(xì)胞增殖的免疫調(diào)節(jié)肽目前尚未見報(bào)導(dǎo)。本研究以鱈魚皮為實(shí)驗(yàn)原料，通過單因素和正交試驗(yàn)優(yōu)化酶解鱈魚皮制備免疫活性肽，并通過測(cè)定RAW 264.7 細(xì)胞的增殖率探究不同分子量酶解產(chǎn)物的免疫調(diào)節(jié)活性，以期為開發(fā)鱈魚皮的精深加工提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

鱈魚皮購自浙江舟山佳和食品加工有限公司。巨噬細(xì)胞RAW 264.7 細(xì)胞購自中科院上海細(xì)胞所，由本實(shí)驗(yàn)室傳代培養(yǎng)。堿性蛋白酶、胃蛋白酶、胰蛋白酶和木瓜蛋白酶購自北京亞太恒信生物科技有限公司。DMEM 培養(yǎng)基購自Gibco 公司；二甲基亞砜（DMSO）購自德國AppliChem 公司；四甲基偶氮唑藍(lán)（MTT）購自美國Sigma 公司。其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

HWS-24 數(shù)顯恒溫水浴鍋，山東城創(chuàng)新儀器有限公司。Cogent μScale 超濾系統(tǒng)，美國密理博公司。pHS-250 pH 計(jì)，上海理達(dá)儀器廠。CF16RN 高速冷凍離心機(jī)，日立儀器有限公司。Forma 3111 型CO2培養(yǎng)箱，美國Thermo 公司。倒置顯微鏡及CCD 拍攝裝置，日本OLYMPUS 公司。ALPHA 1-4/LD plus 型冷凍干燥機(jī)，德國CHRIST 公司。Spectra Max M2 多功能酶標(biāo)儀，美國Molecular Devices 公司。

1.3 方法

1.3.1 鱈魚皮免疫活性肽制備流程

鱈魚皮→NaOH 去雜蛋白→冰醋酸溶脹→酶解→冷凍干燥→鱈魚皮免疫活性肽。

1.3.2 鱈魚皮的預(yù)處理

鱈魚皮剪成1 cm×1 cm 小塊，洗凈后用0.1 mol·L-1NaOH 浸泡6 h 后，用蒸餾水沖洗至中性。隨后用0.1 mol·L-1冰醋酸溶脹12 h，用蒸餾水沖洗至中性后，放-20 ℃環(huán)境保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3 最優(yōu)酶種的篩選

稱取10 g 經(jīng)預(yù)處理的鱈魚皮，分別在胃蛋白酶、胰蛋白酶、堿性蛋白酶和木瓜蛋白酶各自的最適酶解條件下進(jìn)行酶解[10]。酶解完成后沸水浴滅酶活15 min，12 000 r·min-1離心10 min，取上清液，冷凍干燥后備用。采用MTT 法檢測(cè)RAW 264.7 細(xì)胞的細(xì)胞增殖率[11]，以其作為指標(biāo)，選出最優(yōu)酶種。RAW 264.7 細(xì)胞的培養(yǎng)參照文獻(xiàn)[12]進(jìn)行并適當(dāng)改進(jìn)，并取對(duì)數(shù)生長期的細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。4 種蛋白酶的酶解條件見表1。

表1 4 種蛋白酶的酶解條件Tab.1 Enzymatic hydrolysis conditions for four protease

1.3.4 單因素實(shí)驗(yàn)和正交試驗(yàn)

稱取10 g 經(jīng)預(yù)處理的鱈魚皮，使用1.3.3 篩選出的最優(yōu)酶種，以酶解溫度、加酶量、酶解時(shí)間和pH 為影響因素進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)，以游離氨基氮（ANN）含量為指標(biāo)，來確定酶解的條件范圍。ANN 含量用甲醛電位滴定法測(cè)定[13]。根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選取L9(34)正交試驗(yàn)記錄表，仍以鱈魚皮酶解物的水解度作為評(píng)價(jià)指標(biāo)進(jìn)行正交試驗(yàn)，得到最佳酶解條件。

1.3.5 超濾截留

根據(jù)1.3.4 的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，獲得的鱈魚皮酶解液先經(jīng)過0.45 μm 濾膜抽濾，再用超濾系統(tǒng)進(jìn)行超濾分段，得到4 組不同分子段的提取液，分別為＜1 kD、1～5 kD、5～10 kD、＞10 kD，并將各分子段的超濾液進(jìn)行冷凍干燥。將4 組不同分子段的產(chǎn)物制成2 mg·mL-1樣品藥物濃度，分別作用于RAW 264.7 細(xì)胞，篩選出對(duì)細(xì)胞增殖率影響最大的組分。

1.3.6 鱈魚皮免疫活性肽制備流程

RAW 264.7 細(xì)胞置于含10 %無支原體的胎牛血清和雙抗的DMEM 培養(yǎng)基中，于37 ℃、5 % CO2條件下培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞生長至80%時(shí)進(jìn)行傳代，取對(duì)數(shù)生長期的細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。調(diào)整細(xì)胞密度為1×104個(gè)·mL-1，將細(xì)胞分成5 組，空白對(duì)照組，多肽低濃度組（50 mg·mL-1），多肽中濃度組（100 mg·mL-1）；多肽高濃度組（150 mg·mL-1）和LPS 陽性組(LPS 濃度1 μg·mL-1)。按每孔200 μL 培養(yǎng)液接種于96 孔板上，板邊緣用無菌PBS 填充，37 ℃、5 % CO2培養(yǎng)箱中孵育12 h 后棄去上清；加入不同濃度的鱈魚皮多肽各200 μL，每個(gè)濃度3～6 個(gè)復(fù)孔，并設(shè)置空白對(duì)照組；12～36 h 后吸去上清，每孔加入10 %的MTT（5 mg·mL-1）200 μL，繼續(xù)在培養(yǎng)箱中孵育4 h；棄上清后加入150 μL 的DMSO，振蕩10 min，于490 nm 處測(cè)定吸光度(A)，計(jì)算細(xì)胞相對(duì)增殖率。相對(duì)增殖率按公式（1）計(jì)算：

式中，A1為空白對(duì)照組的吸光度，A2為樣品組的吸光度。

1.3.7 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)均用xˉ±s 表示，使用SPSS 26.0 統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析和處理，以P＜0.05 表示差異具有顯著性。

2 結(jié)果與分析

2.1 最優(yōu)酶種的篩選結(jié)果

由圖1 可知，堿性蛋白酶酶解物對(duì)RAW 264.7 巨噬細(xì)胞增殖率高達(dá)31.17%，遠(yuǎn)超過其它蛋白酶酶解產(chǎn)物。因此本實(shí)驗(yàn)選擇堿性蛋白酶制備鱈魚皮免疫活性肽。

圖1 不同酶種對(duì)RAW 264.7 細(xì)胞增殖率的影響Fig.1 Effects of different enzymes on the proliferation rate of RAW 264.7 cells

2.2 堿性蛋白酶單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 堿性蛋白酶單因素水平

以酶解溫度、加酶量、酶解時(shí)間和pH 為影響因素進(jìn)行單因素試驗(yàn)，以ANN 含量為指標(biāo)，來確定酶解的條件范圍見表2。

表2 單因素水平表Tab.2 Factor and levels

2.2.2 酶解溫度對(duì)鱈魚皮酶解物的ANN 含量的影響

由圖2 可知，隨著酶解溫度的增加，酶解物的ANN 含量持續(xù)上升，當(dāng)溫度超過50 ℃后，ANN 含量下降。由于高溫可使酶失活，當(dāng)溫度超過酶的最適溫度，酶活性會(huì)下降，ANN 含量也相應(yīng)減少[14]。因此，選擇45～50 ℃的酶解溫度進(jìn)行正交試驗(yàn)。

圖2 加酶量對(duì)酶解物的ANN 含量的影響Fig.2 Effect of hydrolysis temperature on ANN content of hydrolysates

2.2.3 加酶量對(duì)鱈魚皮酶解物的ANN 含量的影響

由圖3 可知，隨著加酶量的增加，ANN 含量呈上升的趨勢(shì)。但當(dāng)加酶量超過2 500 U·g-1后，ANN 含量基本持平或者少量提高。當(dāng)加酶量適量或較少時(shí)，底物與酶會(huì)充分結(jié)合，ANN 含量會(huì)隨著加酶量的增加而增加。但是超過一定量后，底物基本被飽和，此時(shí)再增加酶含量，ANN 含量不會(huì)再發(fā)生大的變化[15]。因此，選擇1 500～2 500 U·g-1的加酶量進(jìn)行正交試驗(yàn)。

圖3 加酶量對(duì)酶解物的ANN 含量的影響Fig.3 Effect of enzyme volume on ANN content of hydrolysates

2.2.4 pH 對(duì)鱈魚皮酶解物的ANN 含量的影響

由圖4 可知，在pH 在6～10 之間，隨著pH 的增大，ANN 含量先增加后減少。當(dāng)pH 為8 時(shí)，ANN 含量最高。這可能是因?yàn)閴A性蛋白酶的pH 過高或過低都會(huì)導(dǎo)致酶活性的降低，從而影響底物的水解[16]。綜合考慮后，選擇pH 7～9 的進(jìn)行正交試驗(yàn)。

圖4 pH 對(duì)酶解物的ANN 含量的影響Fig.4 Effect of pH on ANN content of hydrolysates

2.2.5 酶解時(shí)間對(duì)鱈魚皮酶解物的ANN 含量的影響

由圖5 可知，在1～7 h 之間，隨著酶解時(shí)間的增加，酶解物的ANN 含量明顯升高。但在7～9 h 之間，隨著酶解時(shí)間的增加，酶解物的ANN 含量基本保持不變。可能是因?yàn)榈孜镆驯幻附馔?，隨著時(shí)間的增加，ANN 含量不會(huì)有太大的改變[17]。綜合考慮后，選擇酶解時(shí)間為5～7 h 進(jìn)行正交試驗(yàn)。

圖5 酶解時(shí)間對(duì)酶解物的ANN 含量的影響Fig.5 Effect of hydrolysis time on ANN content of hydrolysates

2.3 正交試驗(yàn)結(jié)果

堿性蛋白酶酶解鱈魚皮的正交試驗(yàn)是在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，從中選擇出合適的梯度進(jìn)行，以得到大批量酶解的最優(yōu)條件，結(jié)果見表3。各因素對(duì)堿性蛋白酶酶解產(chǎn)物水解度影響的順序?yàn)槊附鈺r(shí)間＞酶解溫度＞加酶量＞pH。由正交試驗(yàn)的結(jié)果可以得出，最優(yōu)的酶解條件為：酶解時(shí)間7 h、酶活力為2 500 U·g-1、pH 8、酶解溫度為50 ℃。

表3 L9(34)正交試驗(yàn)結(jié)果Tab.3 Results of L9(34) orthogonal test

2.4 超濾截留結(jié)果

將大量酶解得到的酶解液超濾后分為4 組不同的分子段，分別為＞10 kD、5～10 kD、1～5 kD 以及＜1 kD，以2 mg·mL-1作用于RAW 264.7 細(xì)胞，利用MTT 法觀察其對(duì)RAW 264.7 細(xì)胞增殖情況的作用。結(jié)果見圖6，＜1 kD 的酶解物對(duì)RAW 264.7 細(xì)胞的增殖率影響最大，細(xì)胞增值率高達(dá)16.40%，與其它各組相比P＜0.05，表示差異具有顯著性。

圖6 不同分子量對(duì)RAW 264.7 細(xì)胞增殖率的影響Fig.6 Effects of different molecular weights on the proliferation rate of RAW 264.7 cells

2.5 倒置顯微鏡觀察RAW 264.7 細(xì)胞結(jié)果

如圖7 所示，空白對(duì)照組細(xì)胞數(shù)較少，細(xì)胞形態(tài)良好且排列緊密；陽性對(duì)照組RAW 264.7 細(xì)胞數(shù)量明顯增多，出現(xiàn)顯著的棱角和凸起。多肽的低濃度、中濃度、高濃度3 組細(xì)胞隨濃度增加，細(xì)胞數(shù)量明顯增多，細(xì)胞出現(xiàn)分化和偽足的數(shù)量也明顯增多。說明從鱈魚皮中提取的肽在一定濃度內(nèi)具有免疫調(diào)節(jié)作用，能促進(jìn)巨噬細(xì)胞的增殖能力。

圖7 RAW 264.7 細(xì)胞形態(tài)（×200）Fig.7 The morphology of RAW 264.7 cells

3 結(jié)果與分析

免疫細(xì)胞增殖是其在免疫調(diào)節(jié)中發(fā)揮相應(yīng)作用的前提和基礎(chǔ)。據(jù)報(bào)道，諸多的免疫活性肽具有增強(qiáng)巨噬細(xì)胞的吞噬能力和增殖活性的作用，能調(diào)節(jié)機(jī)體的免疫能力，提高機(jī)體抵御外界異物侵害的能力[2,18-19]。巨噬細(xì)胞系RAW 264.7 細(xì)胞容易獲得，便于培養(yǎng)，常作為模型用來評(píng)價(jià)活性物質(zhì)在分子水平的免疫調(diào)節(jié)作用[20]。故本實(shí)驗(yàn)選用RAW 264.7 巨噬細(xì)胞，以檢測(cè)其細(xì)胞增殖率確定酶解條件和免疫活性肽制備的指標(biāo)。本研究篩選出提取鱈魚皮免疫活性肽的最優(yōu)酶種為堿性蛋白酶。堿性蛋白酶制備免疫活性肽的最優(yōu)條件是：酶解時(shí)間為7 h、酶活力為2 500 U·g-1、pH 為8、酶解溫度為50 ℃。酶解液通過超濾得到4 組不同分子段，分別為＜1 kD、1～5 kD、5～10 kD、＞10 kD。通過檢測(cè)其對(duì)RAW 264.7 細(xì)胞的增殖率的影響，發(fā)現(xiàn)＜1 kD分子段酶解液具有最高的細(xì)胞增殖率。在倒置顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)＜1 kD 的膠原蛋白肽可以促進(jìn)RAW 264.7 巨噬細(xì)胞的增殖，并隨給藥濃度的增加，大部分細(xì)胞產(chǎn)生偽足，更有利于增強(qiáng)巨噬細(xì)胞的吞噬活性。表明鱈魚皮膠原蛋白肽具有增強(qiáng)RAW 264.7 細(xì)胞的免疫活性，同時(shí)為今后鱈魚皮的研究提供了一定的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。