王 新 湯江武 吳逸飛 姚曉紅 孫 宏 沈 琦

(浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)與微生物研究所，浙江 杭州 310021)

細(xì)菌在水生態(tài)系統(tǒng)生物地球化學(xué)循環(huán)過程中具有重要作用[1-3]，不同功能類群細(xì)菌組成的群落決定了生態(tài)功能的特性和強弱，是維持水生態(tài)系統(tǒng)平衡的關(guān)鍵因素[4]193,[5]38。細(xì)菌群落同時也是水生態(tài)系統(tǒng)中最為敏感并極易受環(huán)境影響的生物群落，其演替的過程，既是對物質(zhì)轉(zhuǎn)化和能量傳遞等生態(tài)功能變化的適應(yīng)，也是對環(huán)境因子變化的生態(tài)響應(yīng)。因此，研究細(xì)菌群落的結(jié)構(gòu)和功能對了解水生態(tài)系統(tǒng)維持健康和平衡的機(jī)理非常重要[6]20404。

諸多環(huán)境因子如pH、溫度、營養(yǎng)鹽、有機(jī)質(zhì)成分、污染物等均與水體細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的變化有直接關(guān)系[7-11]。不同生境中的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)是多種環(huán)境因子共同作用的結(jié)果。目前淡水微生物生態(tài)的研究中，已有不少研究開始關(guān)注城市河流，水質(zhì)、環(huán)境等因子與水體細(xì)菌的關(guān)系，人為擾動是影響這類水體細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的重要原因之一[12-14]，[15]118,[16]1176。但由于這類水體的復(fù)雜性和多樣性，仍需更多的研究來深化對城市河道微生物群落與環(huán)境因子關(guān)系的理解。相關(guān)研究的開展，對了解人類活動對水生態(tài)系統(tǒng)的影響，以及城市水生態(tài)系統(tǒng)的恢復(fù)和維護(hù)具有重要作用。

京杭運河杭州段自南向北貫穿杭州核心城區(qū)，匯集市區(qū)諸多城市河道，是杭州排洪防澇的骨干河道，具有重要的人文、景觀和生態(tài)功能[17]1,[18]1581。盡管近年來進(jìn)行了大規(guī)模的綜合整治，但由于雨污分流不徹底，城市面源污染難以有效控制，京杭運河杭州段仍然是典型的易受城市生產(chǎn)、生活污染的河道。對該水體細(xì)菌群落與環(huán)境變化的研究，有助于了解京杭運河杭州段的水環(huán)境污染現(xiàn)狀和水體微生態(tài)過程，為區(qū)域水環(huán)境污染防控和綜合治理提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 采樣位點和采樣方法

分別于2015年1月20日(冬)、4月21日(春)、7月19日(夏)、10月26日(秋)，在京杭運河杭州段干流從上游向下游的顧家橋(30°17′4″N，120°12′19″E)、賣魚橋(30°17′31″N，120°8′56″E)、拱宸橋(30°19′15″N，120°8′5″E)和義橋(30°22′33″N，120°7′27″E)4個位點分季節(jié)采樣4次。采樣位點如圖1。由于京杭運河杭州段河道水體分層不明顯，故僅采集表層樣品進(jìn)行研究。

1.2 樣品的采集和處理

在采樣現(xiàn)場用梅特勒SG98型多參數(shù)分析儀測定采樣點的溫度和溶解氧，用2 L 有機(jī)玻璃采水器采集表層河水(0～30 cm)1.5L，立即帶回實驗室處理?？偩嫈?shù)樣品經(jīng)8 μm孔徑濾膜過濾后取20 mL，用經(jīng)0.22 μm孔徑濾膜過濾的福爾馬林(最終體積分?jǐn)?shù)5%)固定，裝入無菌樣品瓶中，4 ℃保存。隨后取0.3 L水樣用0.22 μm孔徑濾膜過濾收集菌體，濾膜用鋁箔包裹，液氮速凍后裝入凍存管，存于-80 ℃冰箱以備提取基因組DNA。剩余樣品分別用于細(xì)菌胞外酶活性和水質(zhì)參數(shù)的測定。

1.3 總菌計數(shù)和β-葡萄糖苷酶活性的測定

總菌計數(shù)采用熒光染色計數(shù)法[19]。β-葡萄糖苷酶活性的測定采用熒光模擬底物(FMS)法[20]進(jìn)行，以胞外酶水解底物的速率來表示其活性，具體參照文獻(xiàn)[21]、[22]描述的測定方法進(jìn)行。

圖1 采樣位點示意圖Fig.1 Sampling stations

1.4 細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)-變性梯度凝膠電泳(DGGE)分析

1.4.1 DNA提取

將收集了大量菌體的濾膜在無菌工作臺中剪成碎片，采用PowerWater?DNA提取試劑盒提取水樣中的基因組DNA。提取獲得的DNA樣品用超微量分光光度計(NanoDrop-2000)測定濃度后置于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.2 PCR-DGGE分析

以提取的樣品的基因組DNA為模板，PCR擴(kuò)增16S rDNA V3區(qū)片段，引物為連有GC-夾子(5’-CGC CCG CCG CGC GCG GCG GGC GGG GCG GGG GCA CGG GGG G-3’)的Eubac341f (5’-TAC GGG AGG CAG CAG-3’)和Eubac517r (5’-ATT ACC GCG GCT GCT GG-3’)[23]，參考文獻(xiàn)[21]描述的方法進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測后用Bio-Rad公司的D-code System進(jìn)行DGGE分析。聚丙烯酰胺凝膠濃度為8%，變性梯度為40%～60%。60 ℃、40 V條件下電泳1.5 h后升電壓至120 V，電泳5.0 h。聚丙烯酰胺凝膠從電泳儀上取下之后，在EB染液中染色25 min，用TANNON-2500凝膠成像系統(tǒng)采集圖像。

1.5 DGGE條帶的回收、克隆、測序及分析

DGGE凝膠中的主要條帶切下后用dd H2O沖洗，搗碎后用30 μL TE buffer 在4 ℃下浸泡12 h，PCR回收切下條帶中的DNA?；厥諚l帶的PCR產(chǎn)物再次經(jīng)DGGE檢測以確保回收條帶PCR產(chǎn)物的正確。PCR產(chǎn)物用SanPrep柱式DNA膠回收試劑盒純化后連入pMD18-T載體，轉(zhuǎn)入大腸桿菌(Escherichiacoli)DH5感受態(tài)細(xì)胞，采用菌落PCR檢測陽性克隆，每個樣品隨機(jī)挑選3個載有插入片段的陽性克隆送交上海某公司測序。測序結(jié)果在GenBank中比對分析之后用MEGA 4.1軟件以Neighbor-Joining法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，各分支的Bootstrap置信度用1 000次自導(dǎo)復(fù)制來評價。

1.6 細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)與環(huán)境因子關(guān)系分析

獲得的DGGE圖譜用Quantity One-1-D軟件對DGGE條帶進(jìn)行數(shù)字化分析，用條帶灰度大小來代替每個條帶的擴(kuò)增量，將不同泳道的條帶組成一個數(shù)字化矩陣，進(jìn)行均一化處理，以每個條帶灰度占該泳道總灰度的百分比形成新的矩陣，消除各泳道上樣量的差異。采用限制性排序分析細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)與溫度、溶解氧、高錳酸鹽指數(shù)、總氮、氨氮、亞硝酸鹽氮、硝酸鹽氮等環(huán)境因子之間的相互關(guān)系，由于去趨勢對應(yīng)分析(DCA)特征軸最大長度<3，故采用冗余分析(RDA)進(jìn)行分析。

1.7 水質(zhì)參數(shù)測定

高錳酸鹽指數(shù)采用堿性高錳酸鉀氧化法測定。硝酸鹽氮、亞硝酸鹽氮、氨氮和總氮均采用氣相分子吸收光譜法測定。

1.8 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

采用SPSS 13.0軟件進(jìn)行單因素方差分析，采用Tukey氏法多重比較檢驗。以P<0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 水體環(huán)境和水質(zhì)參數(shù)的季節(jié)變化

2.1.1 溫度和溶解氧的季節(jié)變化

京杭運河杭州段冬季、春季、夏季和秋季的平均溫度分別為(9.0±0.5)、(20.0±0.5)、(28.0±0.5)、(13.0±0.5) ℃，從上游的顧家橋到下游的義橋，各個采樣點在相同季節(jié)的水溫差異不顯著。冬季、春季、夏季和秋季的溶解氧平均值分別為(7.76±0.50)、(5.17±0.44)、(1.60±0.43)、(5.44±0.32) mg/L，夏季溶解氧最低；各個采樣點中，上游的顧家橋在4個季節(jié)中均最高。

2.1.2 水質(zhì)的季節(jié)變化

各個季節(jié)高錳酸鹽指數(shù)從上游到下游大體呈遞增趨勢(見圖2)，義橋的高錳酸鹽指數(shù)顯著高于其他幾個采樣點。京杭運河流經(jīng)杭州城區(qū)過程中污染物增加。

圖2 高錳酸鹽指數(shù)的季節(jié)變化Fig.2 The seasonal changes of permanganate index

其他水質(zhì)指標(biāo)的季節(jié)變化見圖3。氨氮和總氮在4個季節(jié)，從上游到下游大體呈遞增趨勢，義橋的氨氮和總氮含量顯著高于其他幾個采樣點。以平均值最高的冬季為例，顧家橋、賣魚橋、拱宸橋、義橋的氨氮分別為1.11、1.34、2.39、3.40 mg/L，總氮分別為2.97、5.00、6.27、7.66 mg/L。各個采樣點水樣氨氮和總氮含量存在季節(jié)變化，但不具明顯規(guī)律。總體上硝酸鹽氮含量上游采樣點高于下游，亞硝酸鹽氮含量則具有和氨氮類似的變化趨勢。上述數(shù)據(jù)表明，杭州城區(qū)污染物的輸入，尤其是高錳酸鹽指數(shù)和氨氮，對京杭運河的水質(zhì)具有重要影響。

2.2 細(xì)菌豐度和胞外酶活性的季節(jié)變化

2.2.1 細(xì)菌豐度的季節(jié)變化特征

細(xì)菌豐度的季節(jié)變化如圖4所示。從上游的顧家橋到下游的義橋，各位點細(xì)菌豐度除顧家橋在夏季偏高外，均呈顯著上升趨勢。以春季為例，顧家橋、賣魚橋、拱宸橋、義橋的細(xì)菌豐度分別為3.62×106、5.88×106、6.39×106、8.53×106個/mL。這與京杭運河經(jīng)過杭州城區(qū)過程中，可能存在外源生物、化學(xué)污染物的輸入有關(guān)。在相同采樣點的不同季節(jié)，細(xì)菌豐度在冬季和春季與夏季和秋季有著顯著的差異。

2.2.2 細(xì)菌胞外酶活性季節(jié)變化特征

在不同季節(jié)，β-葡萄糖苷酶活性具有不同特征(見圖5)。冬季從上游到下游的位點逐步遞增，從顧家橋的0.378 μmol/(L·h)增至義橋的0.637 μmol/(L·h)；春季則逐步遞減，從顧家橋的0.366 μmol/(L·h)減至義橋的0.186 μmol/(L·h)；秋季逐步增加，但各采樣點的差異不顯著；夏季則無明顯變化特征。以平均值比較，β-葡萄糖苷酶活性在冬季顯著高于其他季節(jié)，冬季平均值達(dá)0.511 μmol/(L·h)；而春季、夏季、秋季β-葡萄糖苷酶活性則無顯著差異。

圖3 氨氮、總氮、硝酸鹽氮、亞硝酸鹽氮的季節(jié)變化Fig.3 The seasonal changes of ammonia nitrogen,total nitrogen,nitrate nitrogen and nitrite nitrogen

圖4 細(xì)菌豐度的季節(jié)變化Fig.4 The seasonal changes of bacteria abundance

2.3 細(xì)菌群落的季節(jié)變化

采用PCR-DGGE獲得了16S rDNA V3區(qū)片段指紋圖譜(見圖6)。泳道中的不同條帶表示不同種細(xì)菌操作分類單元(OTU)，條帶數(shù)顯示了水體細(xì)菌的多樣性，盡管不同位點不同季節(jié)的DGGE指紋圖譜在條帶亮度上有差異，但細(xì)菌種類差異不大。

圖5 β-葡萄糖苷酶活性季節(jié)變化Fig.5 The seasonal changes of β-D-glucosidase activity

對DGGE圖譜中的主要條帶進(jìn)行了測序和分析，通過系統(tǒng)發(fā)育樹分析顯示了京杭運河杭州段水體中細(xì)菌的主要種類(見圖7)。主要集中在變形菌門(Proteobacteria)(37.8%)、放線菌門(Actinobacteria)(24.3%)、擬桿菌門(Bacterioidetes)(18.9%)、厚壁菌門(Firmicutes)(10.8%)和藍(lán)藻門(Cyanobacteria)(8.1%)幾個細(xì)菌門中。而DGGE圖譜中，條帶7、15、29、31均屬于黃桿菌(Flavobacterium)，條帶18屬于厚壁菌(Firmicutesbacterium)，條帶30屬于放線菌(Actinobacterium)，它們所代表的細(xì)菌是京杭運河杭州段水體中大多數(shù)時間的優(yōu)勢細(xì)菌。

采用限制性排序分析了細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)與環(huán)境因子之間的關(guān)系。所有位點中，義橋和顧家橋主要分布在第一、第二象限，拱宸橋和賣魚橋主要分布第三、第四象限(見圖8)。整體上來看，從上游的顧家橋到下游的義橋，水體細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)變化明顯。溶解氧、硝酸鹽氮含量與細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)差異性呈正相關(guān)，其他環(huán)境因子與之呈負(fù)相關(guān)。高錳酸鹽指數(shù)和總氮是關(guān)鍵影響因子。

注：圖譜中條帶標(biāo)記數(shù)字為切膠測序分析的條帶編號。圖中泳道標(biāo)記A、B、C、D分別為義橋、拱宸橋、賣魚橋、顧家橋，字母后數(shù)字1、2、3、4分別為冬季、春節(jié)、夏季、秋季，圖8同。

圖6 細(xì)菌16S rDNA V3區(qū)片段DGGE指紋圖譜
Fig.6 DGGE profiles of 16S rDNA V3 fragments
of bacteria

3 討 論

人類活動對水環(huán)境的影響多年來受到廣泛的關(guān)注，城市作為人口的主要聚集區(qū)，生產(chǎn)、生活產(chǎn)生的污染物的輸入，對城市河道乃至區(qū)域水環(huán)境的水質(zhì)和水體生態(tài)都有著重要的影響[24]139,[25]。京杭運河杭州段自錢塘江引水，流經(jīng)市區(qū)的過程中，由于地勢低洼，匯納了市區(qū)河網(wǎng)帶來的各種污染物，更有諸多生活污水直排入河[17]1。萬歡等[18]1586在2004年通過水體細(xì)菌種類的研究推斷市區(qū)有機(jī)和無機(jī)污染物的輸入相當(dāng)嚴(yán)重。ZHANG等[24]141在2008—2013年對杭州地區(qū)河網(wǎng)的長期連續(xù)監(jiān)測中發(fā)現(xiàn)，市區(qū)河道氨氮的濃度是其他區(qū)域河道的3～5倍，是區(qū)域氮污染的重要源頭之一。近年來隨著水污染治理工作的開展，生活污水截污納管，其向河網(wǎng)的輸入量大大減少，京杭運河杭州段水體水質(zhì)明顯好轉(zhuǎn)。然而本研究中，從上游顧家橋到下游義橋，在各個季節(jié)，水體中的高錳酸鹽指數(shù)、氨氮、總氮以及細(xì)菌豐度，大體呈遞增趨勢，充分說明由市區(qū)帶來的污染仍然是京杭運河水體污染的重要原因。

圖7 16S rDNA V3區(qū)片段PCR-DGGE切膠條帶測序結(jié)果的系統(tǒng)發(fā)育樹分析Fig.7 Phylogenetic tree of 16S rDNA gene sequences obtained by PCR-DGGE

圖8 細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)與環(huán)境因子的RDA分析Fig.8 RDA analysis of bacterial community structure and environmental parameters

細(xì)菌是水體中對環(huán)境變化響應(yīng)最為敏感、對污染物的轉(zhuǎn)化和去除最為重要的功能類群，關(guān)系到水體生態(tài)系統(tǒng)的維持、修復(fù)和平衡，因而一直是研究的熱點[5]46,[6]20404。水體中的胞外酶主要由細(xì)菌產(chǎn)生，大多數(shù)大分子有機(jī)物的轉(zhuǎn)化過程必須有細(xì)菌胞外酶的參與才可能完成[26-27]，因此在一定程度上，細(xì)菌胞外酶的活性意味著細(xì)菌的活性[21]。本研究中水體β-葡萄糖苷酶活性冬季顯著高于其他季節(jié)，而以4個位點的平均值計，冬季是細(xì)菌豐度和高錳酸鹽指數(shù)、氨氮、總氮最高的季節(jié)，這也表明細(xì)菌的活性也對水體污染物的變化有明顯的響應(yīng)，水體細(xì)菌具有天然的污染去除和水體修復(fù)功能。

水體細(xì)菌實現(xiàn)其生態(tài)活性和生態(tài)功能的基礎(chǔ)是其功能類群的組成[4]196。近年來，一些城市河道水體微生物群落結(jié)構(gòu)和多樣性的研究促進(jìn)了人們對不同河道水體中細(xì)菌功能類群的認(rèn)識。如南京秦淮河主要細(xì)菌種類是變形菌門、放線菌門和厚壁菌門[28]1165，贛江是變形菌門和放線菌門[29]385，美國南加州的一條城市河道中則是變形菌門、擬桿菌門和酸桿菌門(Acidobacteria)[16]1180。京杭運河杭州段水體主要細(xì)菌類群與多年來人們對淡水生態(tài)系統(tǒng)主要細(xì)菌類群的認(rèn)識是一致的[30-32]。

不同河道水體細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的差異，既是細(xì)菌對水體環(huán)境因子變化的響應(yīng)，也是受到多種環(huán)境因子變化共同驅(qū)動的結(jié)果。CAI等[28]1165認(rèn)為，溫度、總氮、N/P和氨氮是秦淮河水體細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的主要影響因素；WANG等[29]385認(rèn)為，溫度和流速是影響贛江南昌段水體細(xì)菌群落的主要環(huán)境因子；ZHANG等[15]118對上海市內(nèi)3條河道的研究表明，溫度、總?cè)芙庑怨腆w(TDS)、pH和鹽度均與細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)變化有關(guān)，其中溫度是首要的影響因子。本研究對京杭運河杭州段的研究表明，高錳酸鹽指數(shù)和總氮是主要的影響因素，而這兩種污染物主要來源于京杭運河流經(jīng)杭州市區(qū)的被動輸入，這表明城市源對京杭運河杭州段的水體水質(zhì)和生態(tài)系統(tǒng)有著關(guān)鍵的影響，京杭運河杭州段的水體污染治理，依賴于杭州城區(qū)點、面源污染的管理和控制。

4 結(jié) 論

(1) 京杭運河杭州段從上游顧家橋到下游義橋，高錳酸鹽指數(shù)、氨氮和總氮、細(xì)菌豐度大體呈遞增趨勢，冬季水體總體污染水平及細(xì)菌豐度均顯著高于其他季節(jié)。京杭運河流經(jīng)杭州市區(qū)時的污染物被動輸入是水體污染的主要原因。

(2) 京杭運河杭州段水體中細(xì)菌的主要種類集中在變形菌門、放線菌門、擬桿菌門、厚壁菌門和藍(lán)藻門等5個細(xì)菌門中，所占比例分別為37.8%、24.3%、18.9%、10.8%和8.1%，分別屬于黃桿菌、厚壁菌和放線菌的細(xì)菌是京杭運河杭州段水體中大多數(shù)時間的優(yōu)勢細(xì)菌。

(3) 京杭運河杭州段水體細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)從上游到下游變化明顯，高錳酸鹽指數(shù)和總氮是影響細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)差異的關(guān)鍵因子。