李 菡 畢江濤

(1.寧夏大學(xué)農(nóng)學(xué)院，寧夏 銀川 750021； 2.寧夏大學(xué)環(huán)境工程研究院，寧夏 銀川750021)

隨著我國漁業(yè)向集約化、高密度養(yǎng)殖模式發(fā)展，養(yǎng)殖水域氮污染加劇。近年，我國江河重要漁業(yè)水域主要污染指標(biāo)為總氮，湖泊和水庫重要漁業(yè)水域主要污染指標(biāo)為總氮、總磷和高錳酸鹽指數(shù)[1]。水體氮污染會(huì)造成溶解氧下降并形成亞硝胺等致癌物質(zhì)[2]，對(duì)生態(tài)環(huán)境和人體健康造成嚴(yán)重影響。生物脫氮技術(shù)以無二次污染、安全高效等優(yōu)點(diǎn)被認(rèn)為是水體除氮的有效方法[3]。微生物可利用氮污染物為自身提供營養(yǎng)，并將其轉(zhuǎn)化為N2等無害物質(zhì)，從而達(dá)到去除氮污染的目的[4]32。部分研究發(fā)現(xiàn)[5-7]，針對(duì)不同類型的氮，不同菌株的脫氮能力各不相同。相關(guān)研究顯示，利用單一菌株處理污染水體，存在菌株存活率較低、凈化不完全等缺陷，將功能不同且無拮抗作用的菌株進(jìn)行復(fù)合，形成復(fù)合菌群，通過復(fù)合菌群菌株間的功能互補(bǔ)形成一個(gè)較穩(wěn)定的微生態(tài)系統(tǒng)，從而對(duì)水體中各種形式的氮都具有良好的去除效果，使得水處理效率和持久性明顯提高[8-10]。趙思琪等[11]利用3株高效異養(yǎng)硝化菌構(gòu)建出復(fù)合菌群YM，研究發(fā)現(xiàn)YM的脫氮效果明顯好于單株菌。此外，復(fù)合菌群與單一菌株相比，適應(yīng)性更強(qiáng)[12-13]，負(fù)荷能力更高[14]，對(duì)于強(qiáng)化生物脫氮和實(shí)際處理含氮廢水具有更強(qiáng)的優(yōu)勢。本研究以脫氮能力為指標(biāo)，對(duì)分離自魚池養(yǎng)殖廢水的3株脫氮菌進(jìn)行復(fù)配和優(yōu)化，并分析不同碳源對(duì)復(fù)合菌群生長和脫氮性能的影響，以期為養(yǎng)殖水體氮污染治理提供數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 菌 株

目標(biāo)菌株分離自魚池養(yǎng)殖廢水，經(jīng)脫氮能力分析，篩選出3株脫氮性能較好的菌株，菌株編號(hào)分別為LAB004、AD012和NSP101。

1.1.2 培養(yǎng)基

芽孢桿菌(NA)培養(yǎng)基：蛋白胨10.00 g/L，氯化鈉5.00 g/L，牛肉浸膏5.00 g/L，瓊脂15.00 g/L，pH為7.2～7.4[15]。

溴百里酚藍(lán)(BTB)培養(yǎng)基：硝酸鉀1.00 g/L，L-天冬酰胺1.00 g/L，磷酸二氫鉀1.00 g/L，氯化亞鐵0.05 g/L，氯化鈣0.20 g/L，硫酸鎂1.00 g/L，BTB溶液1 mL(10 g/L酒精溶液)，瓊脂20.00 g/L，pH為7.3[16]。

氨氧化菌培養(yǎng)基：硫酸銨2.00 g/L，磷酸氫二鉀0.75 g/L，磷酸二氫鈉0.25 g/L，硫酸鎂0.01 g/L，硫酸錳0.03 g/L，碳酸鈉0.12 g/L，瓊脂20.00 g/L,pH為8.2[17]。

LB液體培養(yǎng)基：酵母粉5.00 g/L，蛋白胨10.00 g/L，氯化鈉10.00 g/L，pH為7.4[18]。

以上培養(yǎng)基的滅菌條件為：121 ℃濕熱滅菌30 min。

1.2 方 法

1.2.1 人工廢水配制

參照文獻(xiàn)[19]配制人工廢水：硫酸銨0.05 g/L，檸檬酸鈉0.10 g/L，磷酸氫二鉀0.02 g/L，亞硝酸鈉0.02 g/L，葡萄糖1.00 g/L，pH為7.0～7.2。

1.2.2 菌株的鑒定

將菌株保存于相應(yīng)的斜面培養(yǎng)基上，送至上海某生物工程有限公司測序，將獲得的基因序列進(jìn)行 BLAST同源性檢索并提交至GenBank獲取登錄號(hào)。

1.2.3 復(fù)合菌群的構(gòu)建

將3株菌分別接種于LB液體培養(yǎng)基中，于30 ℃、150 r/min條件下培養(yǎng)72 h后，離心(5 000 r/min，7 min)獲得濕菌體，用0.9%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))生理鹽水洗滌2次，加無菌水調(diào)制成在600 nm處的吸光度(OD600)為1.00的菌懸液。以各菌株的菌懸液在復(fù)合菌懸液中所占的體積分?jǐn)?shù)為因素，每個(gè)因素設(shè)4個(gè)水平進(jìn)行正交試驗(yàn)，按照L16(43)正交試驗(yàn)表進(jìn)行試驗(yàn)設(shè)計(jì)，將不同比例混合的復(fù)合菌群懸液各取10 mL加入200 mL人工廢水中，在30 ℃、150 r/min條件下處理72 h后，測定廢水中氨氮、亞硝酸鹽氮和硝酸鹽氮的濃度，正交試驗(yàn)因素水平表見表1。

表1 因素水平表

1.2.4 復(fù)合菌群的生長條件優(yōu)化

試驗(yàn)采用3因素3水平正交設(shè)計(jì)，共有9個(gè)處理組，以接種量(體積分?jǐn)?shù))(記為A)、C/N(質(zhì)量比，記為B)、pH(記為C)3個(gè)環(huán)境變量參數(shù)為因素，每個(gè)環(huán)境變量參數(shù)有3個(gè)水平。按照正交試驗(yàn)設(shè)置，將構(gòu)建的復(fù)合菌群的菌懸液，加入200 mL人工廢水中，在不同環(huán)境因素下，考察72 h時(shí)廢水中氨氮、亞硝酸鹽氮和硝酸鹽氮的濃度，以篩選出最佳的環(huán)境參數(shù)組合。試驗(yàn)因素水平表見表2。

表2 生長條件優(yōu)化的正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.2.5 不同碳源對(duì)復(fù)合菌群生長和脫氮的影響試驗(yàn)

分別以乙酸鈉、麥芽糖、蔗糖和葡萄糖為唯一碳源，按照環(huán)境條件優(yōu)化試驗(yàn)篩選出的最佳C/N和pH配置人工廢水各200 mL，以最佳接種量將復(fù)合菌懸液加入人工廢水中，每個(gè)處理3個(gè)重復(fù)，在30 ℃，150 r/min 條件下培養(yǎng)72 h，取樣測定OD600和氨氮、亞硝酸鹽氮及硝酸鹽氮的濃度。

1.2.6 水質(zhì)指標(biāo)檢測

參照文獻(xiàn)[20]，水體中氨氮、亞硝酸鹽氮和硝酸鹽氮分別采用納氏試劑光度法、 N- (1-萘基) -乙二胺光度法和酚二磺酸光度法測定。

2 結(jié)果與討論

2.1 菌株鑒定

對(duì)菌株LAB004、AD012、NSP101進(jìn)行16S rDNA基因序列測定，將獲得的基因序列提交至GenBank，得到菌株登錄號(hào)分別為MK058700、MK024661 和MK058687，并將序列在美國國家生物技術(shù)信息中心(NCBI)數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行BLAST同源性檢索，初步鑒定菌株LAB004為枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)、菌株AD012為耳炎假單胞菌(Pseudomonasotitidis)、菌株NSP101為硝基還原假單胞菌(Pseudomonasnitroreducens)。

表3 不同復(fù)配比復(fù)合菌群處理廢水后氮質(zhì)量濃度1)

注：同一列小寫字母不同表示差異顯著(P<0.05)，表4同。

2.2 復(fù)合菌群構(gòu)建

根據(jù)復(fù)合菌群正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)L16(43)，共有16組處理，每個(gè)處理設(shè)3個(gè)重復(fù)，不同比例下菌群的脫氮效果見表3。

分析不同復(fù)配比的復(fù)合菌群處理組脫氮效果，處理7和處理3的氨氮濃度都較低，與CK比較差異顯著；處理12的氨氮含量最高，與CK比較差異不顯著；處理7和處理8的亞硝酸鹽氮含量較低，與CK比較差異顯著；處理9的亞硝酸鹽氮含量較高，與CK比較差異不顯著；處理3和處理7的硝酸鹽氮質(zhì)量濃度較低，僅0.03 mg/L，與CK比較差異顯著。以上綜合數(shù)據(jù)表明，處理7的脫氮效果最好，當(dāng)復(fù)配比LAB004∶AD012∶NSP101=3∶2∶4(菌體體積比) 時(shí)，氨氮、亞硝酸鹽氮和硝酸鹽氮的濃度都較低，去除率分別達(dá)到93.40%、99.40%和99.63%，梁前才等[4]36用擬合方程分析混合菌的最佳復(fù)配比，得到沼澤紅假單胞菌(Rhodopseudomonaspalustris)、枯草芽孢桿菌和地衣芽孢桿菌(Bacilluslicheniformis)的投加量(體積分?jǐn)?shù))為66.60%、16.70%和16.70%時(shí)，混合菌對(duì)亞硝酸鹽的去除率最高，達(dá)到了99.74%，和本試驗(yàn)的去除效果相近。

本試驗(yàn)中，處理7對(duì)生物反應(yīng)器脫氮的強(qiáng)化和實(shí)際處理含氮污水具有重要意義，并且從結(jié)果可以看出，氨氮、亞硝酸鹽氮、硝酸鹽氮含量總體上隨著菌株AD012接種水平的增加呈現(xiàn)出上升的趨勢，說明菌株AD012的比例過大會(huì)降低脫氮效率。

2.3 復(fù)合菌群的生長條件優(yōu)化

復(fù)合菌群生長條件優(yōu)化正交試驗(yàn)共有9組處理，每個(gè)處理3個(gè)重復(fù)，以優(yōu)選出最佳的環(huán)境參數(shù)組合。試驗(yàn)不同處理氨氮、亞硝酸鹽氮和硝酸鹽氮的測定結(jié)果見表4，通過極差分析法[21-22]對(duì)表4中的數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，分析結(jié)果見表5。

通過表4得到該復(fù)合菌群脫氮的最佳條件為接種量=8%、C/N=15、pH=7.0，在該條件下復(fù)合菌群的脫氮效果較好，氨氮、亞硝酸鹽氮和硝酸鹽氮的質(zhì)量濃度都較低。由極差分析結(jié)果可知，在各因素對(duì)氨氮含量的影響中，C/N>pH>接種量，最佳處理組合為：接種量=6%、C/N=15、pH=7.0；各因素對(duì)亞硝酸鹽氮含量的影響表現(xiàn)為pH>接種量>C/N，最佳處理組合為:接種量=8%、C/N=10、pH=7.0；各因素對(duì)硝酸鹽氮含量的影響表現(xiàn)為C/N>pH>接種量，最佳處理組合為：接種量=8%、C/N=10、pH=7.0，在實(shí)際應(yīng)用中可根據(jù)氮化合物的種類選擇具體的環(huán)境條件。

2.4 不同碳源對(duì)復(fù)合菌群生長和脫氮效果的影響

把按照菌體體積比為LAB004∶AD012∶NSP101=3∶2∶4混合組成的復(fù)合菌群菌懸液，各取16 mL分別加入不同碳源的廢水中，測定72 h內(nèi)菌群生長OD600和氨氮、亞硝酸鹽氮和硝酸鹽氮的濃度。

表4 復(fù)合菌群生長條件優(yōu)化正交試驗(yàn)結(jié)果

表5 極差分析結(jié)果

2.4.1 菌群生長情況

不同碳源下菌群的生長量和生長對(duì)數(shù)期不同(見圖1)，各種碳源下復(fù)合菌群在0～12 h生長速度最快，60 h后菌群生長基本穩(wěn)定，變化幅度較小，乙酸鈉為碳源時(shí)菌群生長對(duì)數(shù)期為0～18 h，麥芽糖為碳源時(shí)菌群生長對(duì)數(shù)期在0～24 h，蔗糖和葡萄糖為碳源時(shí)菌群生長對(duì)數(shù)期在0～48 h。菌群在生長對(duì)數(shù)期具有繁殖能力強(qiáng)、酶活性高和抵抗外界不利因素的能力較強(qiáng)等特點(diǎn)，因此將處于對(duì)數(shù)期的復(fù)合菌群用于污水處理，可以減少菌群的環(huán)境適應(yīng)時(shí)間，從而縮短脫氮時(shí)間，提高脫氮效率[23]。

圖1 碳源對(duì)復(fù)合菌群生長的影響Fig.1 Effects of carbon sources on the growth of compound bacteria

2.4.2 氨 氮

不同碳源下復(fù)合菌群在脫除氨氮的過程中，除葡萄糖外，其他碳源12 h之后氨氮濃度都有一定的上升(見圖2)，但不同碳源的氨氮濃度上升幅度不同，蔗糖碳源下氨氮濃度上升幅度最大，乙酸鈉碳源下氨氮濃度只有小幅度上升，但其濃度始終在其他碳源之下。72 h時(shí)，不同碳源下的氨氮去除率明顯不同，在菌群去除氨氮的過程中碳源影響較大。

圖2 碳源對(duì)氨氮的影響Fig.2 Effects of carbon sources on ammonia nitrogen

2.4.3 亞硝酸鹽氮

本試驗(yàn)中與其他3種碳源相比，乙酸鈉為碳源時(shí)，亞硝酸鹽氮濃度一直較低且下降速率最快，在0～12 h其亞硝酸鹽氮明顯下降，而其他碳源在24 h后才開始出現(xiàn)明顯下降(見圖3)。所有碳源在24～48 h濃度下降幅度最大，48 h后趨于平穩(wěn)，72 h時(shí)各種碳源下亞硝酸鹽氮去除率均達(dá)到90%以上，其中乙酸鈉碳源下復(fù)合菌群的亞硝酸鹽氮去除率最高，為97.96%，亞硝酸鹽氮具有致癌性，所以在生物脫氮過程中亞硝酸鹽氮的去除具有重要的意義。

圖3 碳源對(duì)亞硝酸鹽氮的影響Fig.3 Effects of carbon sources on nitrite nitrogen

2.4.4 硝酸鹽氮

乙酸鈉為碳源時(shí)，硝酸鹽氮濃度在0～48 h一直處于下降趨勢，而在其他碳源下都呈現(xiàn)出先增后減的趨勢，并且在該時(shí)間段乙酸鈉碳源下的硝酸鹽氮濃度與其他碳源相比一直較低(見圖4)，72 h時(shí)以麥芽糖為碳源的硝酸鹽氮去除率較差，為86.66%，乙酸鈉為碳源時(shí)去除率最高達(dá)到了99.89%，以葡萄糖和蔗糖為碳源時(shí)硝酸鹽氮去除率也都達(dá)到90%以上。不同碳源下，除麥芽糖為碳源時(shí)的硝酸鹽氮去除率較低外，其他碳源下硝酸鹽氮去除率都處于較高水平，本試驗(yàn)研究的復(fù)合菌群脫氮時(shí)外加碳源不宜選擇麥芽糖。

圖4 碳源對(duì)硝酸鹽氮的影響Fig.4 Effects of carbon sources on nitrate nitrogen

結(jié)合圖1至圖4可以得出，相較其他3種碳源(麥芽糖、蔗糖和葡萄糖)，以乙酸鈉為碳源時(shí)復(fù)合菌群的最大生長量雖不是最高，但其脫氮率較高，72 h 時(shí)氨氮、亞硝酸鹽氮和硝酸鹽氮去除率分別達(dá)到96.80%、97.96%和99.89%。GMEZ等[24]在地下水污染處理中，研究了不同碳源對(duì)處理效果的影響，結(jié)果表明以甲醇和乙醇為碳源時(shí)，硝酸鹽氮的去除率達(dá)到了90%以上，但以蔗糖為碳源時(shí)，亞硝酸鹽氮的去除率較差，以非糖類物質(zhì)為碳源時(shí)的脫氮效果明顯好于糖類物質(zhì)，這是由于乙酸鈉和醇類物質(zhì)的分子量較小且結(jié)構(gòu)簡單易被菌體分解利用，細(xì)菌生長速率較快[25-26]，脫氮效率較高，同時(shí)，糖類物質(zhì)含碳量高，微生物生長量相對(duì)非糖類物質(zhì)(如乙酸鈉、醇類等)更高，當(dāng)細(xì)菌生長量過大時(shí)會(huì)在某種程度上影響脫氮效果[27]。另外，不同碳源下復(fù)合菌群對(duì)氨氮去除的高效時(shí)間段都集中在0～12 h，而對(duì)亞硝酸鹽氮和硝酸鹽氮去除的高效時(shí)間段集中在24～48 h，這與菌群的生長情況和脫氮特性有關(guān)。

3 結(jié) 論

(1) 由3株脫氮菌構(gòu)建的復(fù)合菌群的最佳復(fù)配比為LAB004∶AD012∶NSP101=3∶2∶4。

(2) 對(duì)復(fù)合菌群進(jìn)行生長條件優(yōu)化，當(dāng)接種量為8%、C/N為15、pH為7.0時(shí)，復(fù)合菌群的脫氮效果最佳。

(3) 不同碳源下復(fù)合菌群的脫氮效果和生長情況不同，乙酸鈉為碳源時(shí)復(fù)合菌群最大生長量較低但脫氮效果好，脫氮過程中其氨氮、亞硝酸鹽氮和硝酸鹽氮濃度一直保持在較低水平，去除率均達(dá)到90%以上。