鈕春子 王鑫 程浩德 李德華

近年來(lái)種植修復(fù)已經(jīng)成為越來(lái)越多的缺牙患者的主要修復(fù)方式，而臨床上可見各種原因?qū)е碌姆N植區(qū)骨量不足[1]。引導(dǎo)骨再生技術(shù)是臨床上用于增加缺牙區(qū)骨量的重要技術(shù)，其關(guān)鍵在于利用屏障膜保護(hù)缺損區(qū)的血凝塊，阻隔結(jié)締組織，為成骨細(xì)胞的遷移和增殖提供一個(gè)相對(duì)穩(wěn)定的空間[2]。膠原因其良好的生物相容性、可生物降解，并可促進(jìn)止血和傷口愈合等優(yōu)異性能，成為制備屏障膜的理想材料[3-7]。Bio-Gide膜是目前臨床上應(yīng)用廣泛的非交聯(lián)膠原膜，大量研究證實(shí)了其在引導(dǎo)骨再生中促進(jìn)缺損區(qū)成骨的可靠性和有效性，但其價(jià)格昂貴且降解速率偏快，有專家建議覆蓋雙層膜以增加其屏障時(shí)間。本課題組以小牛皮來(lái)源的I型膠原纖維為原料，采用自然成膜的方法制備出一種自主研發(fā)的新型膠原膜。通過前期實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)，新型膠原膜具有良好的細(xì)胞生物相容性，在體外降解速率緩慢[8]。本實(shí)驗(yàn)擬利用大鼠顱骨極限骨缺損模型[9]，進(jìn)一步研究這一新型膠原膜的引導(dǎo)骨再生作用，為后期的臨床研究提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)材料和儀器 I型膠原纖維(常州藥物研究所提供)；Bio-Gide膜(Geistlich，瑞士)；環(huán)狀取骨鉆(Stoma，德國(guó))；Micro-CT系統(tǒng)(Inveon,Siemens，德國(guó))；蘇木精-伊紅染液(南昌雨露實(shí)驗(yàn)器材有限公司)。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 選取無(wú)特定病原體級(jí)別的SD大鼠(第四軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心)，雄性，7～8 周齡，體重300～320 g。

1.2 方法

1.2.1 新型膠原膜的制備 采用溶劑揮發(fā)法制備膠原膜，具體方法簡(jiǎn)述為：以國(guó)產(chǎn)小牛皮(常州藥物研究所)為原料，在提取過程中篩選分子量，去除小分子膠原蛋白，保留長(zhǎng)鏈膠原纖維。通過高速打勻的物理方法將不可溶性的膠原原料于弱酸中形成膠原混懸液，離心除去混懸液中的小分子和氣泡。將膠原勻漿置于真空干燥箱中梯度真空干燥，嚴(yán)格控制溫度不超過37 ℃以防止膠原變性，形成一種結(jié)構(gòu)致密的新型膠原膜。包裝后環(huán)氧乙烷滅菌，常溫干燥環(huán)境下儲(chǔ)存?zhèn)溆肹8]。新型膠原膜表面較平坦，呈半透明的乳白色。SEM示其結(jié)構(gòu)致密，可見膠原纖維典型的串珠樣結(jié)構(gòu)(圖1)。

1.2.2 建立大鼠顱骨極限骨缺損模型及實(shí)驗(yàn)分組 12 只SD大鼠由1%戊巴比妥鈉(0.4 ml/100 g)經(jīng)腹腔注射麻醉，以矢狀縫為中線，在大鼠頂骨左右兩側(cè)各制備直徑5 mm的圓形缺損，缺損區(qū)避開所有骨縫。

實(shí)驗(yàn)分為3 組，實(shí)驗(yàn)組、對(duì)照組和空白對(duì)照組，每組4 個(gè)樣本量。實(shí)驗(yàn)組：覆蓋新型膠原膜；對(duì)照組：覆蓋Bio-Gide膜；空白對(duì)照組：不覆蓋屏障膜。膜的大小為9 mm×7 mm(前后方向超過缺損邊緣2 mm)。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及顱骨缺損左右側(cè)別采用隨機(jī)分配的方式進(jìn)行分組。

分別于術(shù)后4、8 周處死大鼠，每組各2 只，取顱骨及其周圍軟組織進(jìn)行檢測(cè)。

1.2.3 Micro-CT檢查及分析 4%多聚甲醛固定樣本，設(shè)定大鼠CSD區(qū)為感興趣區(qū)域，采用高分辨率的Siemens Inveon CT進(jìn)行掃描。掃描分辨率：19.64 μm。將圖像進(jìn)行三維重建，設(shè)置直徑5 mm、厚度1 mm的重建區(qū)，對(duì)CSD區(qū)新生骨組織進(jìn)行計(jì)量學(xué)分析，具體參數(shù)為：骨體積分?jǐn)?shù)(BV/TV)、骨小梁數(shù)量(Tb.N)、骨小梁厚度(Tb.Th)、骨小梁間隙(Tb.Sp)、骨小梁模式因子(Tb.Pf)。

1.2.4 組織學(xué)HE染色觀察 樣本經(jīng)4%多聚甲醛固定、10%EDTA脫鈣液脫鈣變軟后制作石蠟切片，蘇木精-伊紅染色。為保證各組切片片位相同，切片制取部位為缺損區(qū)正中區(qū)域同一長(zhǎng)軸方向。光學(xué)顯微鏡觀察缺損區(qū)新骨形成和膜的降解情況。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié) 果

12只實(shí)驗(yàn)大鼠術(shù)后傷口愈合良好。

2.1 SD大鼠顱骨CSD區(qū)三維重建結(jié)果

術(shù)后4周的缺損區(qū)三維重建圖見圖2。實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組CSD區(qū)的邊緣和中心區(qū)域均可見新骨形成，新生骨組織較薄。而空白對(duì)照組的新生骨主要集中于邊緣區(qū)域。

術(shù)后8 周的三維重建圖見圖2。實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的缺損區(qū)有明顯的新骨形成，新骨的厚度較高、連續(xù)性較好、骨橋的結(jié)構(gòu)較完整?？瞻讓?duì)照組的新骨形成亦有所增加，但中央?yún)^(qū)域仍未見明顯新骨形成。

2.2 SD大鼠CSD區(qū)各骨參數(shù)分析

術(shù)后在取材修剪樣本時(shí)不慎將8周的一個(gè)樣本(實(shí)驗(yàn)/空白)毀壞，故8 周的實(shí)驗(yàn)組和空白對(duì)照組只有3 組數(shù)據(jù)，其余均為4 組數(shù)據(jù)。骨參數(shù)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)結(jié)果見圖3。

4 周時(shí)，實(shí)驗(yàn)組的各骨參數(shù)與對(duì)照組之間無(wú)顯著差異(P>0.05)。

8 周時(shí)，對(duì)照組的BV/TV、Tb.N顯著地高于空白對(duì)照組，Tb.Sp、Tb.Pf顯著地低于空白對(duì)照組(P<0.05)。實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組之間無(wú)顯著差異(P>0.05)。

圖2 SD大鼠CSD區(qū)術(shù)后三維重建圖Fig 2 Three dimensional reconstruction of the CSD after operation

圖3 大鼠顱骨CSD區(qū)術(shù)后4、8 周的新生骨組織各骨參數(shù)統(tǒng)計(jì)圖Fig 3 Statistical analysis of bone parameters in CSD 4 and 8 weeks after operation

2.3 SD大鼠顱骨CSD區(qū)組織學(xué)觀察

術(shù)后4周，實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的邊緣和中央?yún)^(qū)域均可見新骨形成(圖4)。新型膠原膜結(jié)構(gòu)較完整，周圍可見少量淋巴細(xì)胞(圖5A)。Bio-Gide膜結(jié)構(gòu)不清晰，降解顯著，周圍淋巴細(xì)胞和多核巨細(xì)胞浸潤(rùn)明顯(圖5B)?？瞻讓?duì)照組新生骨集中在邊緣區(qū)域，中央部位由結(jié)締組織充填(圖4)。

術(shù)后8 周，實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的缺損區(qū)均形成較完整的新生骨組織(圖4)。新型膠原膜的結(jié)構(gòu)仍較清晰，膜內(nèi)可見成纖維細(xì)胞和血管生成，淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)較4 周時(shí)增多，可見多核巨細(xì)胞(圖5D)。Bio-Gide膜進(jìn)一步降解，結(jié)構(gòu)不可辨認(rèn)，膜內(nèi)出現(xiàn)大量血管生成和脂肪組織，可見少量淋巴細(xì)胞(圖5E)?？瞻讓?duì)照組缺損區(qū)新生骨組織向中央部位生長(zhǎng)，但缺損區(qū)仍未獲得完全的骨修復(fù)(圖4)。

3 討 論

骨再生過程包括血管生成和成骨細(xì)胞從缺損區(qū)邊緣向中心的遷移，以建立一個(gè)具有良好血管化的肉芽組織區(qū)域，為編織骨的生成和骨質(zhì)的沉積提供支架作用[10]。缺損區(qū)成骨細(xì)胞的增殖速率低于成纖維細(xì)胞，因此需要利用屏障膜在一定時(shí)間內(nèi)維持缺損區(qū)的空間，為成骨細(xì)胞提供穩(wěn)定的再生環(huán)境。膠原原料的種類、提取和加工過程、是否使用人工交聯(lián)等均會(huì)影響膜的降解速率[11-13]。本實(shí)驗(yàn)以小牛皮的I型膠原為原料，采用自然成膜的方法制備出結(jié)構(gòu)致密的新型膠原膜，將膜植入大鼠缺損區(qū)后，膜結(jié)構(gòu)完整性維持的時(shí)間、膜內(nèi)纖維細(xì)胞和血管的長(zhǎng)入均顯著地慢于Bio-Gide膜，提示新型膠原膜的降解速率慢于Bio-Gide膜，這與前期體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果相符[8]。4 周時(shí)Bio-Gide膜內(nèi)可見較多的淋巴細(xì)胞和多核巨細(xì)胞等炎性細(xì)胞，8周時(shí)隨著膜的降解炎性細(xì)胞明顯減少；而新型膠原膜則由4 周時(shí)的少量淋巴細(xì)胞到8周時(shí)增多的淋巴細(xì)胞和多核巨細(xì)胞。外源性的膠原在體內(nèi)由中性粒細(xì)胞、單核/巨噬細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞和成纖維細(xì)胞等分泌的基質(zhì)金屬蛋白酶降解[3,14]。在膠原膜的降解過程中伴隨著炎性細(xì)胞(淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、多核巨細(xì)胞等)的變化，隨著膠原膜的降解，炎性細(xì)胞由多變少至逐漸消失[5,15]。本實(shí)驗(yàn)中兩種膠原膜在降解過程中炎細(xì)胞的不同變化趨勢(shì)亦進(jìn)一步證實(shí)新型膠原膜的降解速率緩慢。

NB：新生骨組織；BT：缺損區(qū)邊界的舊骨；FC：纖維結(jié)締組織；BM：屏障膜圖4 大鼠CSD區(qū)HE染色圖(×40)NB:New bone tissue;BT:Bone tissue by the defect;FC:Fibro-conective tissue;BM:Barrier membraneFig 4 HE staining of CSD(×40)

M：多核巨細(xì)胞；L：淋巴細(xì)胞；MB：新生骨組織；BM：屏障膜圖5 屏障膜周圍炎性細(xì)胞HE染色圖(×200)M:Multinuclear giant cell;L:Lymphocyte;NB:New bone tissue;BM:Barrier membraneFig 5 HE staining of inflammatory cells around the barrier membrane(×200)

機(jī)體的絕大多數(shù)組織在適宜的條件下可以不需要外力完成自我再生，當(dāng)缺損過大而不能產(chǎn)生生物力學(xué)穩(wěn)定的中央支架時(shí)，骨形成局限于缺損的邊緣穩(wěn)定區(qū)域，而中央?yún)^(qū)域由松散的疏松結(jié)締組織占據(jù)[2]。本實(shí)驗(yàn)成功建立大鼠顱骨雙側(cè)CSD模型，將新型膠原膜覆蓋缺損區(qū)，術(shù)后的三維重建影像和組織學(xué)分析顯示缺損的邊緣和中心區(qū)域均有新骨形成、新生骨連續(xù)性好，且8 周時(shí)形成較完整的骨缺損修復(fù)；對(duì)比空白對(duì)照組，骨再生效果顯著。愈合的早期(4 周)，在屏障膜的作用下，缺損區(qū)內(nèi)形成穩(wěn)定的血凝塊，成骨細(xì)胞可以快速遷移和增殖，在整個(gè)缺損區(qū)內(nèi)形成新骨基質(zhì)。隨著時(shí)間的進(jìn)行，骨基質(zhì)進(jìn)一步沉積，形成更加完整和連續(xù)的新骨；而無(wú)膜覆蓋的缺損區(qū)內(nèi)，快速增殖的纖維組織占據(jù)大部分區(qū)域，新骨形成局限于邊緣區(qū)。因此，無(wú)論是新型膠原膜還是Bio-Gide膠原膜，均成功阻攔成纖維細(xì)胞的競(jìng)爭(zhēng)性增殖，促進(jìn)缺損區(qū)的新骨形成。

本實(shí)驗(yàn)以小牛皮為原料，通過自然成膜的方法成功制備出一種新型膠原膜，膜在大鼠體內(nèi)與周圍組織整合良好，降解過程中未引起急性炎癥反應(yīng)。在觀察的8 周內(nèi)膜在大鼠體內(nèi)發(fā)揮良好的屏障作用，顯著地促進(jìn)缺損區(qū)骨再生。新型膠原膜在大動(dòng)物體內(nèi)的遠(yuǎn)期屏障作用有待后續(xù)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步研究。

4 結(jié) 論

覆蓋新型膠原膜可以促進(jìn)大鼠顱骨CSD區(qū)新骨形成，新型膠原膜在大鼠體內(nèi)的降解速率顯著地慢于Bio-Gide膜，可能發(fā)揮更持久更完整的屏障作用。