杜暘 金鼎 高秀秋

牙體牙髓病在人類口腔疾病中比較常見(jiàn)，由于齲病等因素導(dǎo)致牙髓產(chǎn)生炎癥，會(huì)引起患牙的劇烈疼痛并導(dǎo)致功能障礙，給患者帶來(lái)極度的不適，影響生活質(zhì)量[1]。但是，有關(guān)牙髓炎癥損傷修復(fù)的分子機(jī)制目前尚不明確，需進(jìn)一步探索。脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)能夠引起牙髓組織發(fā)生炎癥反應(yīng)，從而抑制牙髓細(xì)胞的增殖、分化等[2]。Toll樣受體 (Toll-likereceptors，TLRs)能識(shí)別LPS，是LPS作用受體之一，促進(jìn)炎癥因子釋放，激活炎癥相關(guān)靶基因的表達(dá)[3]。核轉(zhuǎn)錄因子-κB(Nuclear factor kappa B，NF-κB)以非活性的p65/p50/NF-κB抑制因子α(inhibitor of NF-κB-α，IκB-α)三聚體復(fù)合物形式存在于細(xì)胞質(zhì)中[4]，可以被多種因素激活，包括LPS和理化因素(X射線、氧化劑及化療藥物制劑)等[5]。在炎癥疾病系統(tǒng)中轉(zhuǎn)錄因子NF-κB起著關(guān)鍵的作用[6]，當(dāng)炎癥發(fā)生時(shí)，炎癥細(xì)胞因子大量釋放，如白細(xì)胞介素6(interleukin-6，IL-6)、白細(xì)胞介素1β(interleukin-1β，IL-1β)腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor，TNF-α)等[7]。TLR4/NF-κB信號(hào)通路是否參與了LPS誘導(dǎo)的人牙髓細(xì)胞(human dental pulp cells，HDPCs)細(xì)胞炎癥目前暫無(wú)統(tǒng)一結(jié)論，并且開(kāi)發(fā)能夠拮抗LPS誘導(dǎo)牙髓組織炎癥的天然藥物是迫切解決的問(wèn)題。

紫草素，又名紫草醌，是植物紫草(Lithospermiun erythrorhizon Sieb.et Zucc)中的一種有效成分，具有較強(qiáng)的抗炎作用[8]。研究發(fā)現(xiàn)[9-10]，紫草素能抑制炎性反應(yīng)和促炎因子的釋放，促進(jìn)巨噬細(xì)胞免疫負(fù)調(diào)控抑制因子白細(xì)胞介素-10(IL-10)的表達(dá)。紫草素的抗炎機(jī)制可能與TLR4和NF-κB的p65亞基磷酸化有關(guān)[11-12]，但具體的分子機(jī)制還未發(fā)現(xiàn)。本實(shí)驗(yàn)研究紫草素對(duì)LPS誘導(dǎo)HDPCs細(xì)胞炎癥的影響，初步探討其可能的分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器

紫草素(Enzo Biochem，美國(guó))；DMEM低糖培養(yǎng)基、I型膠原酶、胎牛血清(FBS)、0.25%胰蛋白酶、PBS(Gibco，美國(guó))；脂多糖(LPS)、甲基噻唑基四唑(MTT)(Sigma-Aldrich，美國(guó))；Human IL-1β Platinum Elisa、Human IL-6 Platinum Elisa、Human TNF-alpha Platinum Elisa、Human IL-10 Platinum Elisa(eBioscience，美國(guó))；裂解液、SDS-PAGE配膠試劑盒、BCA蛋白試劑盒(北京康為世紀(jì)生物公司)；TLR4、p-NF-κB、β-actin抗體(Cell Signaling，美國(guó))。

1.2 HDPCs體外培養(yǎng)[13]

經(jīng)患者知情同意后，收集錦州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院口腔科門診就診的患者，由于正畸或者阻生而拔除的完整并且健康的牙齒。在無(wú)菌條件下超凈臺(tái)中，取出牙髓組織，用PBS反復(fù)清洗3 次，剪成小塊，直徑約為0.5 cm，放入含3 mg/ml的I型膠原酶的EP管中，在培養(yǎng)箱中消化30 min，在1 000 r/min條件下，離心5 min，然后棄上清液，加入適量含20% FBS的低糖DMEM原代培養(yǎng)液，然后將組織塊轉(zhuǎn)移在25 cm2培養(yǎng)瓶中，倒置于5% CO2、37 ℃、相對(duì)濕度為100%的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，6～8 h后翻瓶，在顯微鏡下觀察細(xì)胞是否貼壁，細(xì)胞貼壁后，每3 d換液1 次。細(xì)胞長(zhǎng)至80%時(shí)，用0.25%消化胰酶進(jìn)行消化，1∶2比例進(jìn)行傳代培養(yǎng)。

1.3 MTT法檢測(cè)紫草素和LPS對(duì)HDPCs的細(xì)胞毒性

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HDPCs(5×104個(gè)/ml)接種于96 孔板中，每孔200 μl，培養(yǎng)24 h，細(xì)胞長(zhǎng)至70%～80%，吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)基，加入100 μl用DMEM培養(yǎng)基稀釋含不同藥物濃度的培養(yǎng)液(紫草素終濃度為0、12.5、25、50、100、200、400、800 μmol/L；LPS終濃度為0、0.125、0.25、0.5、1、2、4、8 μg/ml)，培養(yǎng)24 h后，每孔加入20 μl 5 mg/ml的MTT溶液，孵育4 h。吸棄孔中液體，每孔加入150 μl DMSO，搖床上晃動(dòng)10 min，用多功能酶標(biāo)儀(Biotek，美國(guó))490 nm測(cè)取吸光度，同時(shí)設(shè)置對(duì)照孔，每組設(shè)6 個(gè)復(fù)孔。

1.4 紫草素對(duì)LPS誘導(dǎo)的HDPCs炎癥模型細(xì)胞存活率的影響

將HDPCs分為4 組，正常對(duì)照組(DMEM培養(yǎng)基)、模型組組(培養(yǎng)基中LPS濃度為1 μg/ml)、紫草素低劑量組(培養(yǎng)基中LPS濃度為1 μg/ml+25 μmol/L紫草素)和紫草素低劑量組(培養(yǎng)基中LPS濃度為1 μg/ml+50 μmol/L紫草素)。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HDPCs(5×104個(gè)/ml)接種于96 孔板中，每孔200 μl，培養(yǎng)24 h，細(xì)胞長(zhǎng)至70%～80%，吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)基，按照上述分組進(jìn)行給藥，培養(yǎng)24 h后，每孔加入20 μl 5 mg/ml的MTT溶液，孵育4 h。吸棄孔中液體，每孔加入150 μl DMSO，搖床上晃動(dòng)10 min，于490 nm處進(jìn)行吸光度檢測(cè)，同時(shí)設(shè)置對(duì)照孔，每組設(shè)6 個(gè)復(fù)孔，測(cè)定紫草素對(duì)HDPCs細(xì)胞存活率的影響。

1.5 ELISA檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)液中IL-1β、IL-6、TNF-α、IL-10含量

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HDPCs(1×106個(gè)/ml)，接種于6 孔板中，按照“1.4”中實(shí)驗(yàn)分組分別加入不同受試物，培養(yǎng)24 h后，收集HDPCs上清液，12 000 r/min離心10 min，吸取上清至EP管中，按照ELISA試劑盒步驟測(cè)定IL-1β、IL-6、TNF-α、IL-10水平。

1.6 Western blot法檢測(cè)蛋白水平

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HDPCs(1×106個(gè)/ml)，接種于6 孔板中，按照“1.4”中實(shí)驗(yàn)分組分別加入不同受試物，在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，吸棄孔中培養(yǎng)基，用PBS輕輕洗滌2 次，每孔中加入60 μl裂解液，放在冰浴裂解20 min，12 000 r/min離心10 min，獲得總蛋白樣品。BCA法測(cè)定蛋白濃度定量后，在蛋白樣品中加入適量SDS-PAGE蛋白緩沖液，金屬浴變性沸騰10 min。上樣量為40 μg，經(jīng)電泳分離后，電轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，用5%脫脂牛奶封閉2 h，加入一抗抗體TLR4、p-NF-κB和β-actin(β-actin作為內(nèi)參蛋白)，4 ℃過(guò)夜，TBS-T洗膜4 次，每次5 min，然后加入對(duì)應(yīng)的熒光二抗，室溫避光孵育2 h，TBS-T洗膜4 次，每次5 min，顯影和掃描使用熒光影像分析儀(LI-COR，USA)。ImageJ 1.41 軟件(Bethesda，美國(guó))進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié) 果

2.1 紫草素和LPS對(duì)HDPCs細(xì)胞毒性的影響

如圖1所示，在不同濃度的紫草素和LPS的處理下，HDPCs被藥物作用24 h，在0～400 μmol/L濃度范圍內(nèi)，紫草素對(duì)HDPCs基本沒(méi)有細(xì)胞毒性，濃度超過(guò)400 μmol/L時(shí)細(xì)胞存活率顯著降低。在不同濃度梯度的LPS處理下，結(jié)果表明，在0～0.25 μg/ml給藥濃度范圍內(nèi)，沒(méi)有產(chǎn)生細(xì)胞毒性，當(dāng)濃度是1 μg/ml時(shí)，細(xì)胞存活率顯著降低(P<0.01)，說(shuō)明此濃度的LPS對(duì)HDPCs產(chǎn)生細(xì)胞損傷，成功建立細(xì)胞炎癥模型。

圖1 紫草素和LPS對(duì)HDPCs細(xì)胞毒性 Fig 1 The cytotoxicity of shikonin and LPS on HDPCs n=6)

2.2 紫草素對(duì)LPS誘導(dǎo)的HDPCs細(xì)胞炎癥模型細(xì)胞存活率的影響

如圖2A所示，與正常組相比，模型組細(xì)胞存活率顯著降低(P<0.01)，說(shuō)明LPS對(duì)HDPCs造成炎癥損傷；與模型組相比，在紫草素的作用下，細(xì)胞存活率顯著升高(P<0.05)，為劑量依賴性，說(shuō)明紫草素可以減少LPS引起的炎癥損傷，提高細(xì)胞存活率。

2.3 紫草素對(duì)LPS誘導(dǎo)的HDPCs中IL-1β水平的影響

如圖2B所示，與正常組相比，模型組IL-1β水平明顯升高(P<0.01)，說(shuō)明LPS能夠刺激IL-1β細(xì)胞炎癥因子的釋放，引發(fā)炎癥反應(yīng)；與模型組相比，給藥組中的IL-1β水平顯著降低(P<0.01)，并且存在劑量依賴性，說(shuō)明紫草素能對(duì)抗LPS引起的細(xì)胞炎癥，抑制促炎因子IL-1β的釋放。

2.4 紫草素對(duì)LPS誘導(dǎo)的HDPCs中IL-6水平的影響

如圖2C所示，與正常組相比，模型組IL-6水平明顯升高(P<0.01)，說(shuō)明LPS能夠刺激IL-6細(xì)胞炎癥因子的釋放，引發(fā)炎癥反應(yīng)；與模型組相比，給藥組中的IL-6水平顯著降低(P<0.05)，并且存在劑量依賴性，說(shuō)明紫草素能對(duì)抗LPS引起的細(xì)胞炎癥，抑制促炎因子IL-6的釋放。

2.5 紫草素對(duì)LPS誘導(dǎo)的HDPCs中TNF-α水平的影響

如圖2D所示，與正常組相比，模型組TNF-α水平明顯升高(P<0.01)，說(shuō)明LPS能夠刺激TNF-α細(xì)胞炎癥因子的釋放，引發(fā)炎癥反應(yīng)；與模型組相比，給藥組中的TNF-α水平顯著降低(P<0.01)，并且存在劑量依賴性，說(shuō)明紫草素能對(duì)抗LPS引起的細(xì)胞炎癥，抑制促炎因子TNF-α的釋放。

2.6 紫草素對(duì)LPS誘導(dǎo)的HDPCs中IL-10水平的影響

如圖2E所示，與正常組相比，模型組IL-10水平顯著降低(P<0.01)，說(shuō)明LPS抑制IL-10的釋放；與模型組相比，給藥組IL-10水平顯著升高(P<0.05)，呈現(xiàn)劑量依賴性，說(shuō)明紫草素能夠提高抑炎因子IL-10的釋放，抑制LPS引起的細(xì)胞炎癥，具有一定的抗炎作用，并且高濃度的紫草素炎癥的緩解作用較低濃度的紫草素強(qiáng)。

2.7 紫草素對(duì)LPS誘導(dǎo)的HDPCs中TLR4蛋白表達(dá)的影響

如圖3所示，蛋白印記結(jié)果表明，與正常組相比，模型組中TLR4蛋白表達(dá)顯著升高(P<0.01)，說(shuō)明LPS能夠使TLR4蛋白表達(dá)升高，發(fā)生炎癥反應(yīng)，引起HDPCs炎癥損傷；與模型組相比，給藥組中TLR4表達(dá)顯著降低(P<0.01)，并且呈劑量依賴性，說(shuō)明紫草素能夠降低LPS引起的細(xì)胞炎癥，降低TLR4蛋白的表達(dá)，具有明顯的抗炎作用，并且高劑量紫草素組的作用效果強(qiáng)于低劑量組紫草素組。

2.8 紫草素對(duì)LPS誘導(dǎo)的HDPCs中p-NF-κB蛋白表達(dá)的影響

如圖3所示，與正常組相比，模型組中p-NF-κB蛋白表達(dá)顯著升高(P<0.01)；與模型組相比，給藥組中p-NF-κB蛋白表達(dá)顯著降低(P<0.01)，并且呈劑量依賴性，說(shuō)明紫草素能夠降低LPS引起的炎癥，降低p-NF-κB蛋白的表達(dá)，具有明顯的抗炎作用。

3 討 論

牙髓是牙髓腔內(nèi)疏松的結(jié)締組織，具有重要的生理功能，如形成牙本質(zhì)、營(yíng)養(yǎng)、感覺(jué)、修復(fù)等，HDPCs則是牙髓組織中重要的細(xì)胞器[14]。LPS作為革蘭陰性菌細(xì)胞壁的成分之一，能夠誘導(dǎo)促炎細(xì)胞因子在牙髓組織中發(fā)生免疫應(yīng)答[15]，引起牙髓病和齲病[16]，LPS誘導(dǎo)疾病機(jī)制可能是通過(guò)激活TLR4分子及其下游的NF-κB和MAPK信號(hào)通路蛋白的表達(dá)[17]，增加炎癥因子IL-1β、IL-6和TNF-α的釋放，抑制IL-10的分泌[18]，然而紫草素具有很強(qiáng)的抗炎作用[19]，能夠抵抗LPS導(dǎo)致的炎癥反應(yīng)[20]。

A：各組細(xì)胞炎癥模型細(xì)胞存活率；B：IL-1β分泌水平；C：IL-6分泌水平;D:TNF-α分泌水平;E:IL-10分泌水平圖2 紫草素對(duì)LPS誘導(dǎo)的HDPCs細(xì)胞存活率，IL-1β，IL-6，TNF-α，IL-10分泌的影響 A：The viability of HDPCs of the groups;B:The release level of IL-1β;C:The release level of IL-6;D:The release level of TNF-α;E:The release level of IL-10Fig 2 The effects of shikonin on LPS-induced HDPCs cell survival and the secretion of IL-1β,IL-6,TNF-α and IL-10 n=6)

A：TLR4蛋白表達(dá)；B：p-NF-κB蛋白表達(dá)圖3 紫草素對(duì)LPS誘導(dǎo)的HDPCs中TLR4及p-NF-κB蛋白表達(dá)的影響 A:TLR4 protein expression;B:p-NF-κB protein expressionFig 3 The effects of shikonin on the expression of TLR4 and p-NF-κB in HDPSs induced by LPS n=3)

本研究結(jié)果表明紫草素能夠升高由LPS誘導(dǎo)的HDPCs細(xì)胞存活率的降低，誘導(dǎo)細(xì)胞毒性，引起細(xì)胞損傷。在LPS的刺激下，IL-1β、IL-6和TNF-α細(xì)胞促炎癥因子的表達(dá)顯著升高，IL-10抑炎因子水平顯著降低；TLR4/NF-κB信號(hào)通路被激活，TLR4和p-NF-κB蛋白表達(dá)顯著升高。在紫草素的治療下，炎癥細(xì)胞因子IL-1β、IL-6和TNF-α水平顯著降低，IL-10抑炎因子水平顯著升高，說(shuō)明紫草素能夠抑制LPS引起的細(xì)胞炎癥，降低促炎因子的釋放，提高抑炎因子的分泌，并且存在劑量依賴性；而且紫草素能夠抑制LPS引起的TLR4/NF-κB信號(hào)通路的激活，降低TLR4和p-NF-κB蛋白的表達(dá)，由此說(shuō)明紫草素具有很強(qiáng)的抗炎作用，其作用機(jī)制可能是通過(guò)調(diào)節(jié)TLR4/NF-κB信號(hào)通路來(lái)抑制LPS引起的炎癥反應(yīng)，這將為牙髓病的治療提供新思路和新靶點(diǎn)，有利于開(kāi)發(fā)治療牙髓病且毒副作用小的天然新藥。