章 麗 龔一富 朱帥旗 劉 浩 李申睿 謝志浩 王何瑜

(寧波大學(xué)海洋學(xué)院,浙江 寧波 315800)

巖藻黃質(zhì)(fucoxanthin)是一類主要存在于褐藻、硅藻中的脂溶性天然類胡蘿卜素,占類胡蘿卜素總量的10%以上[1]。該色素與幾種蛋白質(zhì)以及葉綠素a結(jié)合,在類囊體中形成巖藻黃質(zhì)-葉綠素a/c-蛋白復(fù)合體(fucoxanthin chlorophyll a/c protein,FCP),可通過(guò)葉綠素a 將激發(fā)能傳遞到光合電子傳遞鏈,具有光捕獲和光保護(hù)能力[2]。巖藻黃質(zhì)具有一個(gè)丙二烯鍵、一個(gè)共軛羰基以及一個(gè)5,6-環(huán)氧化物特殊結(jié)構(gòu)[3],這些結(jié)構(gòu)賦予巖藻黃質(zhì)多種生物活性,包括抗肥胖、抗糖尿病[4]和抗腫瘤活性[5-9]。其中巖藻黃質(zhì)的多烯發(fā)色團(tuán)的類胡蘿卜素端是抗肥胖作用的關(guān)鍵結(jié)構(gòu),它含有一個(gè)烯鍵和兩個(gè)羥基,能夠調(diào)節(jié)腹腔白色脂肪組織(white adipose tissue,WAT)線粒體產(chǎn)生解偶聯(lián)蛋白1(uncoupling protein 1,UCP1),促進(jìn)脂肪酸的氧化以及WAT 的產(chǎn)熱；巖藻黃質(zhì)還能通過(guò)調(diào)節(jié)WAT 分泌的細(xì)胞因子來(lái)改善胰島素抵抗以及降低血糖水平[10]。在抗腫瘤方面,巖藻黃質(zhì)在膠質(zhì)瘤[5]、乳腺癌[6]、肺癌[7]、結(jié)腸癌[8]和大腸癌[9]等多種癌癥中具有抗增殖作用。Yu 等[11]發(fā)現(xiàn)巖藻黃質(zhì)能夠調(diào)控胃癌細(xì)胞(MGC-803細(xì)胞)周期停滯在G2/M 期,同時(shí)通過(guò)降低酪氨酸激酶/轉(zhuǎn)錄激活因子(JAK/STAT)通路中CyclinB1 基因的表達(dá),抑制MGC-803 細(xì)胞的增殖。此外,研究表明巖藻黃質(zhì)可誘導(dǎo)Hela 細(xì)胞凋亡,并能通過(guò)提高人宮頸SIHA 細(xì)胞對(duì)腫瘤壞死因子(TNF)相關(guān)的凋亡誘導(dǎo)配體(TNFrelated apoptosis-inducing ligand,TRAIL)敏感性,選擇性誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡[12-13],因此巖藻黃質(zhì)與TRAIL 聯(lián)合預(yù)防或治療宮頸癌具有很大潛力。

巖藻黃質(zhì)具有潛在保健、抗癌功能,且可進(jìn)行微藻培養(yǎng),因此對(duì)微藻的巖藻黃質(zhì)合成調(diào)控研究具有重要意義。三角褐指藻(Phaeodactylum tricornutumBohlin)作為主要產(chǎn)巖藻黃質(zhì)的微藻之一,已報(bào)道可通過(guò)培養(yǎng)條件、營(yíng)養(yǎng)成分的改變或誘導(dǎo)子來(lái)提高巖藻黃質(zhì)含量。如Kosakowska 等[14]發(fā)現(xiàn)三角褐指藻在缺鐵的培養(yǎng)條件下,巖藻黃質(zhì)含量降低,而在氮源充足的條件下,三角褐指藻的巖藻黃質(zhì)含量提高[15]；張南南等[16]利用高光處理三角褐指藻6 h 后,巖藻黃質(zhì)含量較對(duì)照組提高近1 倍；朱帥旗等[17]發(fā)現(xiàn)低濃度硫酸鈰(0.2～0.4 mg·L-1)能提高三角褐指藻巖藻黃質(zhì)含量。水楊酸(salicylic acid,SA)是植物發(fā)育以及脅迫耐受性相關(guān)信號(hào)傳遞的酚類物質(zhì),作為植物內(nèi)源性誘導(dǎo)子參與并調(diào)節(jié)植物重要的生理生化活動(dòng)；而SA 對(duì)三角褐指藻巖藻黃質(zhì)合成影響的相關(guān)研究尚鮮見(jiàn)報(bào)道。本研究通過(guò)向?qū)?shù)期三角褐指藻中添加一定濃度乙酰水楊酸(acetylsalicylic acid,ASA),并對(duì)誘導(dǎo)過(guò)程中的三角褐指藻的生長(zhǎng)、巖藻黃質(zhì)含量及相關(guān)合成基因表達(dá)水平進(jìn)行檢測(cè),以期為三角褐指藻巖藻黃質(zhì)的研究和利用提供一定的理論依據(jù)和技術(shù)指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 三角褐指藻的培養(yǎng)

三角褐指藻(Phaeodactylum tricornutumBohlin)由寧波大學(xué)海洋生物工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室藻種室提供。經(jīng)過(guò)f/2 固體培養(yǎng)基培養(yǎng),挑斑純化擴(kuò)大培養(yǎng),以1×105cells·mL-1初始濃度接種到f/2 液體培養(yǎng)基中,置于20℃、62.5 μmol photons·m-2·s-1、12 h/12 h(黑光暗)條件下培養(yǎng)。

1.2 ASA 處理

待三角褐指藻生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)期(1×106cells·mL-1),采用0(CK)、10、25、50、100 mg·L-1的ASA 對(duì)其進(jìn)行處理,每個(gè)處理設(shè)3 組平行。

1.3 三角褐指藻生長(zhǎng)曲線測(cè)定

取1 mL 對(duì)數(shù)期藻液,通過(guò)6800 型雙光束紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(英國(guó)bibby 科技有限公司)進(jìn)行全波段掃描,確定藻液最大吸收峰波長(zhǎng)。將藻液稀釋成濃度梯度,測(cè)定最大吸收峰的OD 值,同時(shí)用XB-K-25 型血球計(jì)數(shù)板(玉環(huán)縣求精醫(yī)用儀器廠)計(jì)算相應(yīng)濃度的藻細(xì)胞密度。通過(guò)OD 值和藻細(xì)胞密度建立光密度回歸方程。以加入ASA 為初始時(shí)間,處理持續(xù)到第8天,期間每隔24 h 取1 mL 三角褐指藻溶液并測(cè)定OD680值,每組均設(shè)3 個(gè)平行。根據(jù)光密度回歸方程,繪制三角褐指藻的生長(zhǎng)曲線。

1.4 巖藻黃質(zhì)的提取

培養(yǎng)第6 天收集三角褐指藻細(xì)胞,參考Kim 等[3]的方法提取三角褐指藻的巖藻黃質(zhì),4℃、52 000×g離心10 min 收集藻體,冷凍干燥并研磨后加入無(wú)水乙醇重懸,然后靜置1 h,4℃、52 000×g離心10 min 后取上清液過(guò)一次性針頭式濾器(0.22 μm,Millipore),得高效液相色譜(high performance liquid chromatography,HPLC)檢測(cè)液,備用。

1.5 巖藻黃質(zhì)含量的測(cè)定

精確稱取0.1 mg 巖藻黃質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品溶于1 mL 無(wú)水乙醇,依次稀釋成不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品。色譜系統(tǒng)為Aliance e2695 separations module HPLC 系統(tǒng)(Waters,美國(guó)),Waters 2998 二極管陣列檢測(cè)器。洗脫程序：先用甲醇/水(9∶1,v/v)洗脫30 min,再用100%甲醇洗脫10 min,最后用甲醇/水(9∶1,v/v)洗脫15 min。進(jìn)樣量10 μL,檢測(cè)波長(zhǎng)445 nm。通過(guò)巖藻黃質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品積分峰面積與濃度作回歸曲線,根據(jù)色譜圖中的色譜峰保留時(shí)間以及相應(yīng)強(qiáng)度,計(jì)算樣品中巖藻黃質(zhì)含量。

1.6 巖藻黃質(zhì)生物合成相關(guān)基因的表達(dá)分析

收集不同濃度ASA 處理24 h 后的藻液,采用試劑盒(Plant RNA Kit,美國(guó)OMEGA-Bio-Tek 公司)提取RNA,PrimeScript RT reagent Kit(Perfect Real Time)試劑盒(TaKaRa,大連)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。采用SYBR Premix Ex TaqTMⅡ(Perfect Real Time)(TaKaRa,大連)進(jìn)行熒光定量PCR 檢測(cè),目的基因[17-19]和參照基因[20](表1)采用同一擴(kuò)增程序,應(yīng)用2-ΔΔCT法計(jì)算目的基因的相對(duì)表達(dá)量。

表1 定量PCR 引物序列Table 1 The primer sequences of quantity PCR

1.7 巖藻黃質(zhì)含量的主成分分析

以不同濃度ASA 處理下PSY、PDS、ZDS、CRTISO、LYCB和ZEP基因表達(dá)量和巖藻黃質(zhì)含量作為數(shù)據(jù)集,利用SAS 9.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行主成分分析(principal component analysis,PCA)。

1.8 數(shù)據(jù)分析

采用Microsoft Office Excel 2012 進(jìn)行數(shù)據(jù)處理,SPSS 19.0 進(jìn)行單因素方差分析,LSD 法進(jìn)行顯著性差異分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 ASA 對(duì)三角褐指藻細(xì)胞生長(zhǎng)的影響

對(duì)數(shù)期的三角褐指藻最大吸收峰的波長(zhǎng)為680 nm,對(duì)數(shù)期的三角褐指藻密度與OD680呈良好的線性關(guān)系,回歸方程為y＝0.009 5x- 0.000 5(y為OD680值,x為1 mL 藻液的細(xì)胞密度,R2＝0.996 2)。由圖1可知,各試驗(yàn)組三角褐指藻生長(zhǎng)曲線趨勢(shì)相似,培養(yǎng)第1～第6 天維持高速生長(zhǎng),且在培養(yǎng)第6 天時(shí)出現(xiàn)一個(gè)生長(zhǎng)高峰,培養(yǎng)第7 天時(shí)藻細(xì)胞數(shù)量急劇下降。與CK 不同的是,不同濃度ASA 處理的三角褐指藻在培養(yǎng)第2 天時(shí)生長(zhǎng)速度下降,培養(yǎng)第3 天又出現(xiàn)較大程度的增長(zhǎng)。總體上,ASA 各處理組的三角褐指藻藻細(xì)胞數(shù)量始終低于CK,表明ASA 抑制了三角褐指藻的生長(zhǎng)。

圖1 ASA 對(duì)三角褐指藻細(xì)胞生長(zhǎng)的影響Fig.1 Effect of ASA on the growth of Phaeodactylum tricornutum cell

2.2 ASA 對(duì)三角褐指藻巖藻黃質(zhì)含量的影響

根據(jù)HPLC 檢測(cè)發(fā)現(xiàn),標(biāo)準(zhǔn)品和樣品的出峰時(shí)間均為13.5 min(圖2)。以巖藻黃質(zhì)濃度與HPLC 峰面積作回歸方程為y＝0.107 4x＋0.013 8(y為積峰面積,x為巖藻黃質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品不同濃度,R2＝0.999 9)。根據(jù)回歸方程得出的巖藻黃質(zhì)含量(圖3),結(jié)果顯示,三角褐指藻巖藻黃質(zhì)含量對(duì)不同濃度的ASA 均有一定程度的響應(yīng)。與CK 相比,10、25、50 mg·L-1ASA 處理組中三角褐指藻巖藻黃質(zhì)含量分別極顯著提高了91%、77%、30%(P＜0.01),但100 mg·L-1ASA 處理組中巖藻黃質(zhì)含量略低于CK。

圖2 445 nm 光譜下巖藻黃素的HPLC 圖Fig.2 HPLC diagram of fucoxanthin in Phaeodactylum tricornutum under spectrum of 445 nm

2.3 ASA 對(duì)三角褐指藻巖藻黃質(zhì)生物合成相關(guān)基因表達(dá)的影響

比較不同濃度ASA 對(duì)三角褐指藻巖藻黃質(zhì)合成相關(guān)基因表達(dá)的影響,結(jié)果如圖4所示。隨著ASA 濃度的增加,PSY、PDS、ZDS、CRTISO、LYCB和ZEP基因的相對(duì)表達(dá)量均呈現(xiàn)先增加后減少的趨勢(shì),其中10 mg·L-1ASA 處理組的6 個(gè)基因表達(dá)量均最高,且極顯著高于CK(P＜0.01)；25 mg·L-1ASA 處理組,6 個(gè)基因的表達(dá)也得到顯著或極顯著上調(diào)。當(dāng)ASA 濃度上升到100 mg·L-1時(shí),大部分目的基因的表達(dá)仍然上調(diào),但上調(diào)趨勢(shì)漸緩。這可能是因?yàn)?低濃度ASA 誘導(dǎo)藻細(xì)胞產(chǎn)生信號(hào)分子,調(diào)控巖藻黃質(zhì)途徑基因的表達(dá),但隨著ASA 濃度的增加,造成了藻細(xì)胞膜系統(tǒng)和功能受損,導(dǎo)致基因調(diào)控作用減弱。

圖3 不同濃度ASA 處理下三角褐指藻中巖藻黃質(zhì)含量的變化Fig.3 Variation of the content of fucoxanthin in Phaeodactylum tricornutum treated with different concentrations of ASA

2.4 三角褐指藻巖藻黃質(zhì)生物合成相關(guān)基因的主成分分析

利用熒光定量所檢測(cè)到的與巖藻黃質(zhì)相關(guān)的5 個(gè)基因表達(dá)數(shù)據(jù),結(jié)合5 種不同濃度ASA 處理下巖藻黃質(zhì)的含量,構(gòu)成原始數(shù)據(jù)集,進(jìn)行主成分分析,得到了主元向量中5 個(gè)主成分特征值的貢獻(xiàn)率(表2),其中,第一主成分(PC1)貢獻(xiàn)率(90.05%)和第二主成分(PC2)累計(jì)貢獻(xiàn)率(97.07%)超過(guò)85%,以第一主成分和第二主成分作圖(圖5)。結(jié)果表明,變量(PSY、PDS、ZDS、CRTISO、LCYB和ZEP)與巖藻黃素含量存在正相關(guān)關(guān)系,其中,ZEP基因?qū)θ呛种冈逯袔r藻黃素含量的貢獻(xiàn)最高。

表2 6 個(gè)主成分的貢獻(xiàn)率和累積貢獻(xiàn)率Table 2 The Proportion and cumulative proportion of six principal components

3 討論

巖藻黃質(zhì)在抗氧化、抗肥胖[4]和抗癌[5-9]的治療中有重要的作用,三角褐指藻作為具有豐富巖藻黃質(zhì)的單細(xì)胞藻,其生長(zhǎng)速率以及巖藻黃質(zhì)含量均優(yōu)于大型藻,如海帶(Laminaria japonica)、裙帶菜(Undaria pinnatifida)等,目前已經(jīng)對(duì)其進(jìn)行商業(yè)規(guī)模化養(yǎng)殖[21]。SA 是植物抗逆的關(guān)鍵激素,其結(jié)構(gòu)類似物ASA 的誘導(dǎo)作用也得到了證實(shí)。目前國(guó)內(nèi)外已有學(xué)者報(bào)道了SA 對(duì)微藻生長(zhǎng)的影響,Czerpak 等[22]研究結(jié)果表明,10-6、10-5、10-4mol·L-1SA 可促進(jìn)小球藻的生長(zhǎng)。而在微擬球藻和水華魚(yú)腥藻中,SA 對(duì)其生長(zhǎng)影響呈現(xiàn)低促高抑的現(xiàn)象[23-24]。SA 在2.5～40 mg·L-1以及40～120 mg·L-1濃度范圍內(nèi)分別對(duì)三角褐指藻和銅綠微囊藻有抑制作用,且抑制作用與濃度呈正相關(guān)[23,25]。由于藻類之間的差異,SA 對(duì)微藻生長(zhǎng)的影響沒(méi)有統(tǒng)一的規(guī)律,但外源SA 作為酚酸類化感物質(zhì)之一,可通過(guò)不同途徑來(lái)影響植物和藻類的生長(zhǎng),除了造成質(zhì)膜過(guò)氧化,最常見(jiàn)的是阻礙葉綠素合成,從而影響植物光合作用[26-27]。在高等植物中,葉面施用SA后,大麥和黑吉豆葉片的葉綠素含量均降低[28-29]。Moharekar 等[30]用不同濃度SA 處理小麥后,其葉綠素a/b 值隨著SA 濃度的升高而下降,由此推測(cè)SA 改變了捕光天線的尺寸。在微藻中,張誠(chéng)鵬等[23]發(fā)現(xiàn)外源ASA 抑制了三角褐指藻光合效率。胡利靜等[25]發(fā)現(xiàn)SA 抑制了銅綠微囊藻葉綠素a 的合成,且高濃度的水楊酸(0.12 g·L-1)對(duì)葉綠素a 的降解作用更明顯。本試驗(yàn)結(jié)果也表明,ASA 處理的三角褐指藻細(xì)胞數(shù)量低于對(duì)照組,10～40 mg·L-1ASA 抑制了三角褐指藻的生長(zhǎng)。因此推測(cè),ASA 能抑制三角褐指藻葉綠素a 的合成,影響光合作用,抑制藻細(xì)胞的生長(zhǎng)。

圖4 不同濃度ASA 處理下三角褐指藻種各基因轉(zhuǎn)錄差異Fig.4 Transcriptional levels induced by different concentrations of ASA in Phaeodactylum tricornutum

大量研究表明,外源SA 能夠誘導(dǎo)高等植物和微藻中類胡蘿卜素等次級(jí)代謝產(chǎn)物的積累。Moharekar等[30]用不同濃度的SA 處理小麥和芒苗種子后,發(fā)現(xiàn)兩種植物中類胡蘿卜素的含量、葉黃素庫(kù)大小以及脫環(huán)氧化速率均顯著增加。Vidhyavathi 等[31]用SA 處理雨生紅球藻,在低光條件下,10、50 和100 μmol·L-1的SA 能促進(jìn)蝦青素和β-胡蘿卜素的合成。SA 處理不僅能促進(jìn)天然類胡蘿卜素的積累,還能增強(qiáng)抗氧化酶的活性,進(jìn)而提高植物的抗逆性。Hu 等[32]發(fā)現(xiàn),ASA能顯著增加番茄葉片的多酚氧化酶和過(guò)氧化物酶的活性；經(jīng)過(guò)SA 和ASA 處理后的甜櫻桃,其抗氧化物濃度和抗氧化酶活性提高[33]。張穎等[34]用外源SA 處理蘋(píng)果,發(fā)現(xiàn)過(guò)氧化氫酶(catalase,CAT)、多酚氧化酶(polyphenol,PPO)、過(guò)氧化物酶(peroridase,POD)和苯丙氨酸解氨酶(phenylalanine ammonia lyase,PAL)活性顯著提高。以上抗氧化酶都是植物防止膜脂過(guò)氧化、維持細(xì)胞膜正常代謝的重要酶。本研究中,巖藻黃質(zhì)的含量隨著ASA 濃度的增加呈先上升后下降的趨勢(shì),在10 mg·L-1ASA 下巖藻黃質(zhì)含量最高(P＜0.01),100 mg·L-1ASA 對(duì)三角褐指藻巖藻黃質(zhì)含量的影響不顯著(P＞0.05)。推測(cè)10 mg·L-1ASA 作為誘導(dǎo)子,通過(guò)影響藻巖藻黃質(zhì)合成途徑中相應(yīng)基因表達(dá),對(duì)巖藻黃質(zhì)的合成進(jìn)行調(diào)控,進(jìn)一步減輕膜脂過(guò)氧化。100 mg·L-1ASA 可能對(duì)藻細(xì)胞產(chǎn)生氧化脅迫,加劇膜質(zhì)過(guò)氧化,導(dǎo)致藻細(xì)胞數(shù)量減少甚至巖藻黃質(zhì)含量降低。

本研究中6 個(gè)巖藻黃質(zhì)含量合成相關(guān)酶表達(dá)水平與巖藻黃質(zhì)含量存在相關(guān)性,其中ZEP對(duì)巖藻黃質(zhì)合成貢獻(xiàn)度最大。張南南等[35]采用高光處理三角褐指藻6 h 后,ZEP1 和PSY表達(dá)量相對(duì)于對(duì)照組提高近2倍,巖藻黃素含量提高了2.16 倍,ZEP1 可能是編碼巖藻黃素合成途徑中的限速酶。本研究中,主成分分析也得出ZEP基因?qū)r藻黃質(zhì)合成貢獻(xiàn)度最高。ASA對(duì)三角褐指藻巖藻黃質(zhì)合成的促進(jìn)作用,表現(xiàn)在合成途徑關(guān)鍵酶基因表達(dá)水平和巖藻黃質(zhì)含量上,其作用機(jī)理還需進(jìn)一步研究。

目前,在巖藻黃質(zhì)的生物合成途徑中,紫黃素到巖藻黃質(zhì)的合成,仍然存在假說(shuō)和分歧的觀點(diǎn),一種是由Wilhelm 和Christian 提出紫黃質(zhì)通過(guò)硅甲藻黃素轉(zhuǎn)化成巖藻黃質(zhì)[36],而另外一種推斷是新葉黃質(zhì)先后經(jīng)過(guò)酮醇化和乙?；瘍刹叫揎?最終轉(zhuǎn)化為巖藻黃質(zhì)[37]。本研究通過(guò)ASA 處理三角褐指藻,從生長(zhǎng)、含量以及分子方面對(duì)其進(jìn)行了探究,為巖藻黃質(zhì)的生產(chǎn)實(shí)踐提供了基礎(chǔ)。

圖5 巖藻黃質(zhì)生物合成通路中的基因與其含量的主成分分析Fig.5 The principal component analysis between the contents of fucoxanthin and gene involved in pathway of fucoxanthin biosynthesis

4 結(jié)論

本研究探究了不同濃度ASA 誘導(dǎo)對(duì)三角褐指藻生長(zhǎng)和巖藻黃質(zhì)合成的影響,結(jié)果顯示,ASA 處理抑制了對(duì)數(shù)期三角褐指藻的生長(zhǎng),但10 mg·L-1ASA 對(duì)三角褐指藻巖藻黃質(zhì)合成途徑相關(guān)酶基因的表達(dá)具有促進(jìn)作用,且10 mg·L-1處理組三角褐指藻中巖藻黃質(zhì)含量顯著高于對(duì)照組,表明ASA 可能通過(guò)影響三角褐指藻巖藻黃素合成的基因的表達(dá)從而調(diào)控巖藻黃質(zhì)的合成。本試驗(yàn)為進(jìn)一步研究外源誘導(dǎo)子對(duì)三角褐指藻的巖藻黃質(zhì)積累及分子機(jī)理奠定了一定的理論基礎(chǔ)。