曠文豐，糜 芳，陳 晨，毛偉力

(上海萬力華生物科技有限公司，上海 200203)

為減少化學(xué)農(nóng)藥的使用，越來越多的微生物被用作生防制劑中的活性成分，在作物病蟲害防治中發(fā)揮著重要作用[1]。在已經(jīng)商業(yè)化生產(chǎn)和廣泛使用的生防制劑中，生防真菌因具有廣譜的生防作用、產(chǎn)量高、貨架期長等特性，已成為除芽孢桿菌外應(yīng)用最為廣泛的生防制劑，如木霉菌(Trichodermaspp.)、白僵菌(Beauveriaspp.)、綠僵菌(Metarhizumspp.)等[2]。木霉菌是目前使用最廣泛的一種微生物殺菌劑，可以通過重寄生、營養(yǎng)競(jìng)爭(zhēng)、產(chǎn)酶、誘導(dǎo)植物抗性、代謝產(chǎn)物等多種途徑防治植物的根部和葉部病害[3]。美國ABM公司和康奈爾大學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，木霉菌能影響作物根系微生物菌群的變化，提高養(yǎng)分的吸收，穩(wěn)定土壤養(yǎng)分，促進(jìn)根系發(fā)育及根毛形成[4]。木霉菌在自然界的生長、繁殖和傳播主要是通過3種菌體形態(tài)進(jìn)行：菌絲、分生孢子和厚垣孢子，菌絲在脫水干燥時(shí)容易失活，分生孢子和厚垣孢子對(duì)外界環(huán)境更具耐受性。因此，在木霉菌生防制劑的工業(yè)化生產(chǎn)過程中，選用分生孢子或厚垣孢子作為其主要活性成分[5-7]，而孢子主要是通過液體或固體發(fā)酵獲得的[5]。通過優(yōu)化發(fā)酵和后處理工藝最大限度地提高孢子產(chǎn)量，是提高木霉菌生防制劑產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)能力的重要策略[8]。提高木霉菌液體發(fā)酵的產(chǎn)孢量，除考慮培養(yǎng)基的營養(yǎng)成分、pH值、溫度、轉(zhuǎn)速、裝液量和接種量等因素外[9-10]，光照也是影響木霉菌生長發(fā)育和產(chǎn)孢能力的重要因素。研究[11]表明，光照可以促進(jìn)木霉菌分生孢子的分化和形成，350～440 nm的可見光可以誘導(dǎo)綠色木霉分生孢子的形成。然而，研究光誘導(dǎo)作用對(duì)木霉菌產(chǎn)孢量的影響多集中在木霉菌固體發(fā)酵，有關(guān)光誘導(dǎo)作用對(duì)木霉菌液體發(fā)酵產(chǎn)孢量的影響鮮有報(bào)道。作者選擇8株生防效果較好的木霉菌菌株為研究對(duì)象，測(cè)試白光(全光譜)、藍(lán)光、紅光、綠光對(duì)這8株菌株固體發(fā)酵和液體發(fā)酵產(chǎn)孢量的影響，以期為木霉菌生防制劑產(chǎn)業(yè)化研究提供新的思路與方法。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 光源

KW-T8ZW-7W型LED燈，宸華節(jié)能照明有限公司。通過數(shù)字照度計(jì)調(diào)節(jié)不同光源照度，不同光源的頻段如圖1所示，其中白光源(全光譜)為400～780 nm，藍(lán)光源最強(qiáng)波長為460 nm、綠光源最強(qiáng)波長為515 nm、紅光源最強(qiáng)波長為660 nm。

圖1 不同光源的頻段圖Fig.1 Band of different light sources

1.2 儀器

SW-CJ-1CU型潔凈工作臺(tái)，蘇州凈化工作臺(tái)設(shè)備有限公司；JA2003型電子天平，上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司；LDZX-50KBS型立式壓力蒸汽滅菌器，上海申安醫(yī)療器械廠；SY-3010B-2型發(fā)酵罐； KMC-1300V型渦旋振蕩器，VISION；MCC-450BP型光照培養(yǎng)箱，上海一恒科學(xué)儀器有限公司；SKY-2112B型搖床；BX51型顯微鏡，Olympus；紅光LED燈管；藍(lán)光LED燈管；Testo 540型數(shù)字照度計(jì)，德國Testo；HSS3000智能型生物發(fā)酵工程系統(tǒng)(帶插入式LED燈管)，無錫匯森生物設(shè)備有限公司。

1.3 菌種與培養(yǎng)基

哈茨木霉(T.harzianum，Tr121,CGMCC5202)、橘綠木霉(T.citrinoviride，Tr673,CGMCC8723)、綠色木霉(T.virens，Tr34,CGMCC7.282)、長枝木霉(T.longibrachiatum，TL02,CGMCC7.280)、棘孢木霉(T.asperellum，Tr266B,CGMCC7.283)、擬康寧木霉(T.pseudokoningii，Tr25,CGMCC7.284)、毛簇木霉(T.velutinum，Tr1111B)、深綠木霉(T.atroviride，Tr775,CGMCC7.281)等均由上海萬力華生物科技有限公司實(shí)驗(yàn)室分離、進(jìn)行生理生化和分子遺傳學(xué)鑒定后保存。

PDA培養(yǎng)基：200 g馬鈴薯切成小塊，加水煮爛，紗布過濾，加熱，加15 g瓊脂，繼續(xù)加熱攪拌混勻，待瓊脂完全溶解后，加入20 g葡萄糖，攪拌均勻，稍冷后用水補(bǔ)足至1 000 mL。

PDB培養(yǎng)基：200 g馬鈴薯切成小塊，加水煮爛，紗布過濾，5 000 r·min-1離心10 min，取上清液，加入25 g葡萄糖，攪拌均勻，稍冷后用水補(bǔ)足至1 000 mL。

1.4 菌種活化

將保存于-40 ℃冰箱中的20%甘油菌種保存液取出，置于37 ℃恒溫水浴鍋中水浴2 min，搖勻，無菌吸取20 μL孢子懸液置于PDA培養(yǎng)基平皿中央，置于菌種培養(yǎng)箱中28 ℃、日光燈下培養(yǎng)144 h。

1.5 光誘導(dǎo)作用對(duì)木霉菌固體發(fā)酵產(chǎn)孢量的影響

1.5.1 不同光源的影響

用無菌打孔器自Tr121、Tr673、Tr34、TL02、Tr266B、Tr25、Tr1111B、Tr775菌落邊緣打取直徑5 mm的菌塊，分別接種到同批次同體積的PDA培養(yǎng)基平皿中央，分別置于裝有白光、藍(lán)光、紅光、綠光的培養(yǎng)箱中,以避光處理(平皿用兩層錫箔紙完全包裹)為對(duì)照，各組均設(shè)6個(gè)重復(fù)。培養(yǎng)溫度28 ℃，照度200 Lux。培養(yǎng)至36 h時(shí)，各組取出3個(gè)平皿，用十字交叉法測(cè)量菌落直徑；培養(yǎng)至144 h時(shí)，取出剩余3個(gè)平皿，刮取平皿中孢子，重懸于10 mL 0.1%吐溫-20溶液中，用血球計(jì)數(shù)法測(cè)定孢子量。

1.5.2 藍(lán)光照度的影響

用無菌打孔器自Tr673、TL02、Tr25、Tr775菌落邊緣打取直徑5 mm的菌塊，分別接種到同批次同體積的PDA培養(yǎng)基平皿中央，以避光處理為對(duì)照，每組設(shè)3個(gè)重復(fù)。置于藍(lán)光(照度分別為500 Lux、200 Lux、100 Lux、50 Lux、25 Lux)培養(yǎng)箱中28 ℃培養(yǎng)144 h，按1.5.1方法測(cè)定孢子量。

1.5.3 藍(lán)光光照時(shí)長的影響

用無菌打孔器自Tr673、TL02、Tr25、Tr775菌落邊緣打取直徑5 mm的菌塊，分別接種到同批次同體積的PDA培養(yǎng)基平皿中央，用兩層錫箔紙完全包裹，置于培養(yǎng)箱中避光培養(yǎng)，分別在培養(yǎng)12 h、24 h、36 h、48 h、72 h時(shí)，除去錫箔紙，將每個(gè)菌株的一組平皿置于100～200 Lux的藍(lán)光培養(yǎng)箱中28 ℃培養(yǎng)至144 h，按1.5.1方法測(cè)定孢子量。各組設(shè)3個(gè)重復(fù)，對(duì)照組直接置于照度為100～200 Lux的藍(lán)光培養(yǎng)箱中28 ℃培養(yǎng)。

1.6 光誘導(dǎo)作用對(duì)木霉菌液體發(fā)酵產(chǎn)孢量的影響

1.6.1 不同光源的影響

用無菌接種鏟分別刮取Tr121、Tr673、Tr34、TL02、Tr266B、Tr25、Tr1111B、Tr775活化平皿中的孢子，置于50 mL無菌0.1%吐溫-20溶液中，振蕩分散成孢子懸液。吸取1 mL孢子懸液，接種于裝有120 mL PDB培養(yǎng)基的搖瓶中；分別將搖瓶置于裝有白光、藍(lán)光、紅光、綠光的搖床(為避免外界光源影響，用錫箔紙封閉搖床視窗和縫隙)中，照度100～200 Lux；將搖床置于封閉黑暗培養(yǎng)室中28 ℃、200 r·min-1培養(yǎng)144 h，用血球計(jì)數(shù)法測(cè)定孢子量。未安裝LED燈的搖床作為對(duì)照，每組設(shè)3個(gè)重復(fù)。

1.6.2 藍(lán)光對(duì)木霉菌液體發(fā)酵產(chǎn)孢量的影響

15L發(fā)酵罐中內(nèi)置石英管，管中插入LED光源，使發(fā)酵液面的藍(lán)光照度為100～200 Lux，發(fā)酵罐自動(dòng)控制培養(yǎng)溫度30 ℃、轉(zhuǎn)速200 r·min-1、空氣流量50 L·min-1、罐壓0.002 MPa，自動(dòng)記錄pH值、DO值變化。用錫箔紙封閉發(fā)酵罐視窗，作為避光培養(yǎng)對(duì)照。

具體過程如下：刮取Tr673、TL02、Tr25、Tr775活化平皿中的孢子，置于裝有500 mL無菌0.1%吐溫-20溶液的補(bǔ)料瓶中，振蕩分散成孢子懸液作為種子液。通過血球計(jì)數(shù)法計(jì)數(shù)，使種子液濃度達(dá)到2×107個(gè)·mL-1。15L發(fā)酵罐中PDB培養(yǎng)基為10 L，121 ℃滅菌15 min，待降至30 ℃后，將種子液經(jīng)火焰口無菌接入發(fā)酵罐內(nèi)，培養(yǎng)144 h，期間每隔8～12 h無菌取樣1次，用血球計(jì)數(shù)法測(cè)定孢子量，采用DNS法測(cè)定發(fā)酵液中還原糖含量[12]，按細(xì)胞干重法計(jì)算生物量(g·mL-1)[6]：

2 結(jié)果與討論

2.1 不同光源對(duì)木霉菌固體和液體發(fā)酵產(chǎn)孢量的影響

在避光及光照(白光、藍(lán)光、紅光、綠光)條件下，菌株Tr121、Tr673、Tr34、TL02、Tr266B、Tr25、Tr1111B、Tr775在PDA培養(yǎng)基上固體發(fā)酵的菌落形態(tài)見圖2，菌落直徑見圖3。

圖2 不同光照條件下各菌株在PDA培養(yǎng)基上生長的菌落形態(tài)Fig.2 Colony morphology of eight strains growing on PDA medium under different light conditions

注：相同菌種柱狀圖上不同小寫字母表示相互之間差異顯著(P≤0.05)

從圖3可知，各種光源對(duì)菌株Tr673、Tr34、TL02的菌落直徑無顯著影響；相對(duì)于避光處理，光照培養(yǎng)可顯著增大菌株Tr121、Tr266B、Tr25、Tr1111B、Tr775的菌落直徑。

在避光及光照(白光、藍(lán)光、紅光、綠光)條件下，菌株Tr121、Tr673、Tr34、TL02、Tr266B、Tr25、Tr1111B、Tr775固體發(fā)酵和液體發(fā)酵的產(chǎn)孢量見表1。

從表1可知：(1)固體發(fā)酵時(shí)，菌株Tr673、TL02、Tr25、Tr775在避光處理下的產(chǎn)孢量顯著低于200 Lux白光和藍(lán)光照射下的產(chǎn)孢量(P≤0.01)；菌株Tr673在綠光照射下的產(chǎn)孢量顯著高于在避光處理和紅光照射下的產(chǎn)孢量(P≤0.01)，但顯著低于在白光和藍(lán)光照射下的產(chǎn)孢量(P≤0.01)；菌株Tr121、Tr34、Tr266B、Tr1111B在避光處理和光照條件下的產(chǎn)孢量無顯著差異。(2)液體發(fā)酵時(shí)，菌株Tr673、TL02、Tr25、Tr775在100～200 Lux白光和藍(lán)光照射下的產(chǎn)孢量顯著高于在避光處理和其它光照條件下的產(chǎn)孢量(P≤0.01)；菌株Tr121、Tr34、Tr266B、Tr1111B在不同光照條件下的產(chǎn)孢量無顯著差異。

表1 不同光照條件下各菌株固體發(fā)酵和液體發(fā)酵的產(chǎn)孢量

Tab.1 Spore production of eight strains by solid and liquid fermentation under different light conditions

注：同行不同大寫字母表示相互之間差異極顯著(P≤0.01)。

2.2 藍(lán)光對(duì)木霉菌固體發(fā)酵產(chǎn)孢量的影響

藍(lán)光照度和光照時(shí)長對(duì)菌株Tr673、TL02、Tr25、Tr775固體發(fā)酵產(chǎn)孢量的影響見表2。

從表2可知，菌株Tr673、TL02、Tr25、Tr775在25 Lux微量的藍(lán)光照射下就能通過固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)生分生孢子；菌株Tr673、TL02、Tr25在50～200 Lux藍(lán)光照射下的產(chǎn)孢量顯著高于在避光處理和25 Lux、500 Lux藍(lán)光照射下的產(chǎn)孢量(P≤0.01)；持續(xù)藍(lán)光照射可以顯著提高菌株Tr673、TL02、Tr25、Tr775固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)孢量(P≤0.01)；當(dāng)菌株避光處理超過36 h后再進(jìn)行藍(lán)光照射，其產(chǎn)孢量顯著低于在36 h前就開始藍(lán)光照射時(shí)的產(chǎn)孢量(P≤0.01)。

2.3 藍(lán)光對(duì)木霉菌液體發(fā)酵產(chǎn)孢量的影響

在避光處理和藍(lán)光照射下，菌株Tr673、TL02、Tr25、Tr775在15L發(fā)酵罐中液體發(fā)酵曲線如圖4所示。

從圖4可知，僅菌株Tr25在避光處理和藍(lán)光照射下的產(chǎn)孢量沒有差異，菌株Tr673、TL02、Tr775在藍(lán)光照射下的產(chǎn)孢量數(shù)倍高于避光處理的產(chǎn)孢量；菌株Tr673、TL02、Tr25、Tr775均在生物量達(dá)到最高點(diǎn)且還原糖降至低點(diǎn)后方開始產(chǎn)孢，伴隨著產(chǎn)孢的過程，生物量逐步下降，待產(chǎn)孢恒定后生物量和還原糖趨于穩(wěn)定值；藍(lán)光照射對(duì)生長較快的菌株Tr673、TL02的糖代謝速率沒有明顯影響，但是可以加快菌株Tr25、Tr775的糖消耗過程，產(chǎn)孢在還原糖處于低值時(shí)出現(xiàn)，產(chǎn)孢完成后糖不再消耗；藍(lán)光照射可以加速菌株Tr673、TL02、Tr25、Tr775生物量的累積，在生物量累積到最高值時(shí)只有菌絲無孢子或僅有少量孢子產(chǎn)生，隨后隨著生物量的下降，分生孢子產(chǎn)生，產(chǎn)孢完成后，生物量處于穩(wěn)定狀態(tài)；藍(lán)光照射可以促使菌株Tr673、TL02、Tr25、Tr775產(chǎn)孢時(shí)間較避光處理提前，能較快達(dá)到產(chǎn)孢恒定狀態(tài)；藍(lán)光照射的最終生物量和殘?zhí)橇慷悸愿哂诒芄馓幚怼?/p>

表2 藍(lán)光照度和光照時(shí)長對(duì)木霉菌固體發(fā)酵產(chǎn)孢量的影響/(×109個(gè)/平皿)

Tab.2 Effect of blue light intensity and irradiation time on spore production of Trichoderma spp. by solid fermentation/(×109 spore per plate)

注：同列不同大寫字母表示相互之間差異極顯著(P≤0.01)。

2.4 討論

本研究通過平皿培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)證明，3種單色光源中只有藍(lán)光可以誘導(dǎo)Tr673、TL02、Tr25、Tr775產(chǎn)生分生孢子，該結(jié)果與Betina等[13]對(duì)綠色木霉產(chǎn)孢研究結(jié)果相同：光誘導(dǎo)產(chǎn)孢的最有效光源為380～500 nm的藍(lán)光。本研究發(fā)現(xiàn)，木霉菌小種之間對(duì)不同光源的反應(yīng)存在一定的差異性，不同光源對(duì)Tr121、Tr775、TL02、Tr25在PDA培養(yǎng)基上的生長影響顯著，從而印證了段慶虎等[14]的推斷：光質(zhì)對(duì)真菌的生長發(fā)育有調(diào)控作用，真菌對(duì)光質(zhì)有選擇性，最佳光質(zhì)因種類而定。本研究發(fā)現(xiàn)，Tr673、Tr775在避光處理超過36 h后，無法通過光誘導(dǎo)產(chǎn)生孢子，Tr25產(chǎn)孢量顯著下降，這與Gutter[15]的研究結(jié)論相同：綠色木霉在黑暗條件下培養(yǎng)超過48 h后，無法通過光誘導(dǎo)產(chǎn)生孢子。本研究結(jié)果表明，藍(lán)光對(duì)木霉菌的孢子誘導(dǎo)是一個(gè)非常敏感的過程，低照度50～200 Lux的藍(lán)光能誘導(dǎo)Tr673、TL02、Tr25、Tr775在PDA培養(yǎng)基中產(chǎn)生分生孢子；而當(dāng)照度為500 Lux時(shí)，Tr673、TL02、Tr25、Tr775的產(chǎn)孢被顯著抑制；高照度的近紫外區(qū)的藍(lán)光會(huì)對(duì)真菌造成損傷，從而抑制了產(chǎn)孢過程[16]。

圖4 在避光處理和藍(lán)光照射下，菌株Tr673、TL02、Tr25、Tr775的液體發(fā)酵曲線Fig.4 Liquid fermentation curves of Tr673,TL02,Tr25,and Tr775 under conditions of dark and blue light irradiation

本研究通過搖瓶培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)表明，藍(lán)光可以誘導(dǎo)Tr673、TL02、Tr25、Tr775產(chǎn)生大量分生孢子，這個(gè)結(jié)果與平皿實(shí)驗(yàn)結(jié)果相一致。在15L發(fā)酵罐的深層液體培養(yǎng)中，得到了與搖瓶發(fā)酵近似的結(jié)果。只有Tr25在深層液體發(fā)酵時(shí)產(chǎn)孢時(shí)間提前，產(chǎn)孢量與避光處理相同，有可能是因?yàn)閿嚢铇募羟辛?duì)Tr25的菌絲造成損傷，觸發(fā)了新的產(chǎn)孢誘導(dǎo)過程[17-18]；同時(shí)表明，Tr25在深層液體發(fā)酵中可以通過機(jī)械損傷和營養(yǎng)饑餓協(xié)同作用誘導(dǎo)孢子生成而不依賴于光誘導(dǎo)作用。 Chovanec等[19]和Friedl等[20]對(duì)深綠木霉和綠色木霉的產(chǎn)孢研究也表明，光誘導(dǎo)和營養(yǎng)誘導(dǎo)對(duì)兩種木霉菌產(chǎn)孢有著交互的影響，碳源被認(rèn)為是光誘導(dǎo)產(chǎn)孢和營養(yǎng)饑餓誘導(dǎo)產(chǎn)孢的主要因素。營養(yǎng)饑餓誘導(dǎo)產(chǎn)孢是深層液體發(fā)酵中孢子產(chǎn)生的重要途徑。本研究結(jié)果表明，木霉菌液體發(fā)酵產(chǎn)孢過程發(fā)生在生物量達(dá)到最高點(diǎn)而碳源急速下降之后。

木霉菌的固體發(fā)酵和液體發(fā)酵的產(chǎn)孢途徑和產(chǎn)孢機(jī)理不同。木霉菌固體發(fā)酵的產(chǎn)孢途徑是孢子萌發(fā)10 h后，菌絲特化現(xiàn)象明顯，形成氣生菌絲，部分氣生菌絲分化形成分生孢子梗最后形成分生孢子[21]；木霉菌液體發(fā)酵的產(chǎn)孢途徑主要為營養(yǎng)菌絲直接斷裂產(chǎn)生孢子、分生孢子囊破裂產(chǎn)生孢子、微循環(huán)產(chǎn)孢產(chǎn)生孢子[22]。本研究結(jié)果表明，在液體發(fā)酵產(chǎn)孢中，分生孢子的產(chǎn)生同樣受到藍(lán)光和饑餓誘導(dǎo)的調(diào)控。在大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)中，可以通過增加低照度藍(lán)光誘導(dǎo)的方式提高橘綠木霉、長枝木霉、深綠木霉的產(chǎn)孢量，縮短產(chǎn)孢發(fā)酵周期，達(dá)到降低成本的目的。

3 結(jié)論

通過平皿培養(yǎng)和搖瓶培養(yǎng)，對(duì)比研究了避光處理和不同光照條件對(duì)8株木霉菌菌株產(chǎn)孢量的影響。結(jié)果顯示，在固體發(fā)酵條件下，50～200 Lux藍(lán)光照射能顯著提高菌株Tr673、TL02、Tr25、Tr775的產(chǎn)孢量(P≤0.01)；將菌株避光處理36 h后再進(jìn)行藍(lán)光照射，其產(chǎn)孢量較持續(xù)光照的顯著降低(P≤0.01)。在液體發(fā)酵條件下，菌株Tr673、TL02、Tr25、Tr775在100～200 Lux白光或藍(lán)光照射下的產(chǎn)孢量較避光處理提高數(shù)倍(P≤0.01)，較其它光源照射提高2～8倍；通過15L發(fā)酵罐進(jìn)行深層發(fā)酵發(fā)現(xiàn)，100～200 Lux藍(lán)光照射較避光處理能顯著提高Tr673、TL02、Tr775的產(chǎn)孢量(P≤0.01)，但對(duì)Tr25的產(chǎn)孢量增加不明顯。